血液基因组提取专家讲座

不可忽略细节

—血液基因组提取天根生化科技（北京）有限企业血液基因组提取第1页DNA提取标准基因组提取方法样本保留和前处理基因组提取流程DNA保留及检测方法试剂选择标准

内容血液基因组提取第2页没有严格要求:PCRSouthernBlotsRFLP严格要求片段长度:

构建文库PFGE(脉冲场凝胶电泳)DNALengthDNA提取标准1：DNA片段长度血液基因组提取第3页没有严格要求

常规PCR严格要求产物纯度

存档、产物长久保留Southern杂交

荧光定量PCRSNPMicroarrayCGH(比较基因组杂交)

DNA提取标准2：DNA产物纯度血液基因组提取第4页DNA提取标准基因组提取方法样本保留和前处理基因组提取流程DNA保留及检测方法试剂选择标准

内容血液基因组提取第5页基因组提取方法溶液盐析法：无需酚氯仿，样本量灵活可变，得率高硅胶膜吸附法：利用硅胶膜特异吸附核酸原理来纯化核酸磁珠法：独特包埋磁珠，在一定条件下对核酸含有很强亲和力，而当条件改变时，磁珠释放吸附核酸，能够到达快速分离纯化核酸目标。传统酚氯仿法：传统方法，抽提时间长，成本低。但酚氯仿有毒，危害身体健康。血液基因组提取第6页DNA提取标准基因组提取方法样本保留和前处理基因组提取流程DNA保留及检测方法试剂选择标准

内容血液基因组提取第7页样本保留和前处理－抗凝血液保留柠檬酸、EDTA、肝素三种抗凝剂均可使用。但肝素对酶反应有可能起阻害作用,采血时如没有特殊要求,请使用柠檬酸或EDTA处理血样。

加入抗凝剂混匀后2-8℃保留一周；－20℃保留一个月；－70℃长久保留。尽可能确保样本不经过重复冻融。样本前处理1.冻存抗凝血液使用前溶解应在37℃水浴快速溶解。

2.抗凝血提取前需要彻底混匀后再吸收试验所需体积。血液基因组提取第8页样本保留和前处理－非抗凝血保留非抗凝血即血凝块。-20℃保留一个月；-70℃长久保留。尽可能确保样本不经过重复冻融。样本前处理

1.

冻存血凝块使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

2.血凝块取出后先采取机械破碎方法（比如：放入无粉橡胶手套中捏碎或匀浆）将血凝块破碎，然后再依据自己试验取适量样本。血凝块前期破碎程度越高，提取基因组就越轻易！血液基因组提取第9页样本保留和前处理－白膜层保留全血分离得到白膜层放置-20℃或-70℃长久保留。尽可能确保样本不经过重复冻融。样本前处理1.白膜层是将全血离心取中间层所得。白细胞则是用红细胞裂解液裂解红细胞后得到沉淀。

2.冻存白膜层使用前应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

3.即使得到是白膜层，不过会有少许红细胞存在，所以红细胞裂解液还是必要，但用量减半。

4.采取白膜层提取核酸时，所用到提取溶液体积需按照全血体积进行操作。即：1ml全血得到白膜层提取时需要加入提取1ml全血试剂量。血液基因组提取第10页样本保留和前处理－血清/血浆保留现在很多科研者使用血清/血浆提取游离核酸进行研究，比如：肿瘤研究。分离得到血清/血浆放置-70℃保留。尽可能防止样本重复冻融。样本前处理

1.

冻存血清/血浆使用前溶解应在37℃水浴溶解，轻柔颠倒混匀。

2.血清/血浆核酸提取时无需红细胞裂解。

3.只需100-200ul样本，基本能满足下游常规PCR或荧光定量PCR检测。血液基因组提取第11页样本保留和前处理－微量血液/干血点/羊水/胸水保留微量血液：抗凝血液-20或-70℃保留；

干血点：干燥后室温或4℃保留；

羊水：-20或-70℃保留。样本前处理

1.

微量血液处理同抗凝血液，不一样之处是无需进行红细胞裂解步骤。

2.干血点加入缓冲液直接进行提取。

3.羊水/胸水提取时先离心得到沉淀，再进行裂解提取核酸。血液基因组提取第12页样本保留和前处理－口拭子/漱口水保留口拭子：干燥后室温保留

漱口水：4℃保留或离心得到沉淀-20℃或-70℃保留样本前处理

1.拭子将拭子棉头剪入到离心管里，加入缓冲液直接进行提取。

2.有些拭子棉头剪不下来，能够将拭子在生理盐水里漂洗几次，离心得到沉淀再进行核酸提取。

3.漱口水先进行离心得到沉淀再进行核酸提取。血液基因组提取第13页DNA提取标准基因组提取方法样本保留和前处理基因组提取流程DNA保留及检测方法试剂选择标准

内容血液基因组提取第14页基因组提取流程加入吸附柱缓冲液漂洗DNA洗脱搜集样本裂解纯化去蛋白沉淀核酸洗涤去盐溶解DNA沉淀样本裂解溶液法（盐析法）吸附柱法血液基因组提取第15页红细胞裂解哺乳动物血液红细胞中没有细胞核且核酸酶含量丰富，所以裂解红细胞对核酸提取非常主要。红细胞裂解有两种方式：采取红细胞裂解液进行裂解（通常红细胞裂解液按照3倍全血体积加入进行裂解).采取细胞裂解液进行裂解（TIANGEN细胞裂解液CL是按照2.5倍全血体积），细胞裂解液将红细胞裂解同时能够裂解白细胞，得到为细胞核沉淀，更方便基因组DNA提取。红细胞裂解充分现象：

得到沉淀应为白色沉淀或淡粉色沉淀。有时血液需要进行两次裂解，注意第二次加入裂解液后需要将沉淀votex彻底混匀。血液基因组提取第16页核细胞裂解假如有裂红步骤，请尽可能将上清去除再加入裂解液。加入裂解液（如：TIANGEN试剂盒中GB或FG）和蛋白酶K需要彻底混匀。将沉淀打散混匀后再进行水浴。水浴时看到溶液变清，没有粘稠物或沉淀时即可进行下步操作，通常水浴时间10-30min.若采取有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，动作要轻柔。离心分离两相时，应确保一定转速和时间，且吸收上清时注意不要吸收到中间层及有机相。血液基因组提取第17页核酸吸附或沉淀硅胶膜吸附法

1.加入乙醇颠倒混匀后可能会出现絮状沉淀，动作要轻柔。

2.将裂解溶液和絮状沉淀全部加入到吸附柱里，此时溶液应是高盐低pH值。经过硅胶膜特异吸附核酸特征将裂解溶液中核酸吸附到硅胶膜上。溶液法

1.当沉淀时间有限时，用预冷异丙醇沉淀，沉淀会更充分。

2.加入异丙醇颠倒混匀后应出现丝状沉淀，动作要轻柔，防止基因组因过于猛烈外力而降解。

3.分离沉淀方法：a.用枪头小心地将丝状沉淀挑出；b.离心分离，应确保一定转速和时间。血液基因组提取第18页核酸洗脱或溶解硅胶膜吸附法

1.用去蛋白液、漂洗液将膜上核酸漂洗后，将不加溶液吸附柱离心以去除残留液体及挥发乙醇成份。加入适量洗脱液TBbuffer（或自己配制buffer）后放置5-10min后再进行离心得到基因组DNA。溶液法

1.使用70-75％乙醇对核酸沉淀进行洗涤。溶解DNA前需要室温或37℃放置几分钟晾干核酸（使乙醇挥发），然后再加入适量TBbuffer（或自己配制buffer）溶解DNA。血液基因组提取第19页DNA提取标准基因组提取方法样本保留和前处理基因组提取流程DNA保留及检测方法试剂选择标准

内容血液基因组提取第20页浓度：100－300ng/ul纯度：任何杂质都可能造成DNA在储存过程中降解，所以要确保纯化得到核酸纯度。温度：纯化得到基因组DNA之后需将DNA溶液分装保留到-20℃，重复冻溶会造成DNA降解。溶解DNABuffer：纯化得到基因组DNA最好溶解在TBBuffer(TIANGEN)或者Tris缓冲液里，因为大片段基因组DNA在酸性水溶液中不稳定，易水解。核酸保留血液基因组提取第21页纯度（OD260-320/OD280-320）

紫外分光光度计进行测量（选择正确稀释倍数，确保OD260值在0.1~1.0之间，通常离心柱法稀释4－5倍；溶液裂解法稀释20－30倍）

OD260-320/OD280-320<1.7说明有蛋白污染

OD260-320/OD280-320＝1.7～1.9说明纯度很好

OD260-320/OD280-320>1.9说明有部分降解或有RNA污染得率

紫外分光光度计进行测量

Yield＝OD260×50ng/ul×稀释倍数DNA检测方法－紫外分光光度法血液基因组提取第22页Tiangen产品提取得率产品详细细节请直接点击产品名称样本处理量DNA/RNA得率（μg）推荐试剂盒哺乳动物全血100μl2DP327-磁珠法基因组提取试剂盒DP316-微量样品基因组DNA提取试剂盒200μl4-12DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)600μl12-201ml4-30DP319-血液基因组提取试剂盒(0.1-20ml)5ml100-20020ml300-700禽类、两栖类全血5-205-40DP318-血液基因组提取试剂盒(0.1-1ml)血凝块200-500ul1-8DP318/DP319500-1000ul8-15DP318/DP3191ml-5ml5-150DP319口腔拭子1个0.5-3.5DP322-口腔拭子基因组提取试剂盒血液基因组提取第23页DNA检测方法－电泳检测取2μl洗脱液1%琼脂糖凝胶电泳,检测DNA分子大小，纯度以及完整性TIANamp血液基因组DNA提取试剂盒提取相同血样不一样起始体积DNA电泳图电泳检测要控制上样量。上样量过大会造成泳道过亮、拖尾等现象，影响正确判断。假如加样孔里有亮带，说明有蛋白污染。若上样量适当，泳道有弥散、拖尾现象，说明书基因组DNA有降解。血液基因组提取第24页TIANamp微量样本基因组DNA提取试剂盒样本起源一致，分别取1μl，10μl，50μl，100μl为起始样本提取基因组。各取2μl基因组DNA为模板，扩增GAPDH基因，荧光定量PCR分析试验结果。D