中药复方制剂对当归麻口病、阿魏酸含量的影响

中药复方制剂对当归麻口病、阿魏酸含量的影响摘要目的：结合“中医农业”思想，研究制备中药复方制剂，探讨中药复方制剂不同施药方法对当归阿魏酸含量的影响，以及对当归麻口病发病率的影响，为中药复方药剂的施药方法提供一定的理论依据。方法：将中药复方制剂采用撒施、拌苗、浸苗的方法处理当归种苗，采收期取样，参照麻口病分级标准，统计麻口病病级，通过HPLC法测定当归阿魏酸的含量，比较不同分组当归麻口病发病情况以及阿魏酸含量差异。结果：中药复方制剂不同的施药方法均能够改善麻口病的发病情况，提高当归阿魏酸的含量且与对照组比较差异显著，其中浸苗处理对当归麻口病发病率、阿魏酸含量影响更明显。结论：中药复方制剂能够改善当归药材的质量，具有推广应用的价值。关键词：中药复方；当归病害；麻口病；阿魏酸当归（Angelicasinensis(Oliv.)Diels）为伞形科当归属的一种多年生草本植物的根[1]。《神农本草经》有记载：“当归味温，主呃逆上气”，被列为中品。研究报道当归的功效诸多：和经补血、调经止痛、润肠滑肠等，其中补血效果盛佳，故而得名“妇科人参”，也是医家常用药[2]。据考证甘肃省陇西县首阳镇和武山县落门镇一带最早生产当归，而今甘肃省定西市岷县因其当归产量大、多且质量上好，被誉为“当归之乡”[3]，故而当归也俗称“岷归”。作为常用中药材的岷归，因其药食两用的优势，如今已跻身于保健和餐饮行业，但由于岷归种植面积不断扩大，当归生产出现严重的连作现象，病虫害发生率日趋严重[4]，使中药材产量和品质均受到不同程度的影响，而在防治病虫害过程中难以避免使用到剧毒农药，因此岷归农药残留问题也成为制约岷归发展的瓶颈因素。因此，为推进甘肃省特色产业岷归的健康发展，岷归病虫无公害防治的深入研究成为目前我省岷归规范化生产中亟待解决的问题。近年来，“中医农业”在种植业和养殖业的发展可观，景明等结合“中医农业”思想，通过实验研究初步确定以熏倒牛、白芥子等中药配伍的制剂对于当归麻口病病原菌防治效果最佳[5]，并且通过大田实验研究发现施用中药复方制剂能够提高当归的栽培品质，且兼有防治当归麻口病的作用[6~7]。本文研究了通过不同方法施用中药复方制剂对于当归麻口病和阿魏酸含量的影响，旨在为我省当归药材种植栽培研究提供一种新思路，对促进我省当归产业的健康发展具有现实意义。1.实验仪器、材料与试剂1.1仪器设备名称生产厂家美国安捷伦Agilent1260美国安捷伦公司高相液相色谱仪（DAD检测器）美国安捷伦公司LabTechEV旋转蒸发仪美国莱博泰科仪器有限公司MBF-16A粉碎机迈邦机械设备有限公司MH－2000型电热套北京科伟永兴仪器有限公司1.2材料与试剂材料药材名拉丁名由甘肃农业大学药用植物系陈垣教授鉴定均为正品。当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels熏倒牛BiebersteiniaheterostemonMaxim藿香Agastache.rugosa.(Fisch.etMey.)O.Ktze.艾叶Atractylodeslancea(Thunb.)DC白芥子Sinapis.Alba.L雷公藤Tripterygium.wilfordii.Hook.f.甘遂Euphorbia.kansui.T.N.LiouexS.B.Ho瑞香Daphne.odora.Thunb狼毒Euphorbia.fischeriana.Steud苦皮藤Celastrus.angulatus.Maxim.藜芦Veratrum.nigrum.L试剂试剂生产厂家乙醇国药集团化学试剂有限公司20171212甲醇国药集团化学试剂有限公司20171228乙腈国药集团化学试剂有限公司20171211阿魏酸成都克洛玛生物科技有限公司CHB180206实验方法与结果2.1当归样地信息与栽培分组2.1.1当归样地本次实验基地设立在甘肃省定西市岷县西江镇。西江镇地处岷县城中心偏北方向（104.00°E，34.34°N），属平山半山，年均温在6.0℃左右，年平均无霜期118d，年平均降雨量582mm。2.1.2栽培分组挑选面积约为666.6m2的实验田，通过农户固有的方式向农田均匀撒施一定量的二胺和尿素肥料，之后将其划分为四个面积相等的实验小区。每个实验小区在固定的行距40cm、穴距20cm（40×20c㎡）种植直径在3~5mm（百苗重80~120g）之间，表面光滑、侧根少、无病害感染、无机械损伤的当归幼苗。实验共分为4组，其中组1取一定量的中药复方粉剂直接撒施于移栽穴；组2取含有等量中药复方粉剂的混悬溶液进行浸苗处理；组3组取等量的中药复方粉剂进行拌苗处理；组4即为对照组，农户自种，未用中药复方制剂处理。为方便标记组别，各组之间留有50cm间距，插放标记牌。在后期田间管理阶段每组当归未施加任何化学肥料。运用随机抽样法在当归采收期分别抽取各组当归药材进行质量评价。2.2对当归麻口病的影响2.2.1麻口病统计方法于当归采收期，即分别2019年10月于不同处理组样地，随机选取3个点，每个点随机抽取10株当归，即每个样地抽取30株当归药材。净制处理后，按照当归药材麻口病的分级标准[8]，统计麻口病病级，详见表1。表1当归麻口病分级标准麻口病等级特征0级健康无病1级归头有黄褐色纵裂或者糠腐面积<5%3级糠腐面积5%~40%5级糠腐面积21%~40%7级糠腐面积41%~60%9级糠腐面积>60%参照麻口病的病情指数及病指防效计算公式，计算并统计各组当归病情指数、病指防效ADDINCNKISM.Ref.{7BD3DF8E3D964a3a8740771B471176B9}[5]。观察及麻口病的病级，并计算各组当归的病情指数，结果详见图1。图1麻口病病级统计结果%撒施组浸苗组拌苗组对照组图2各处理组当归药材外观性状图2.2.2结果与结论当归麻口病的发病率为24.07%~41.11%，将中药复方制剂采用不同的施药方法处理的当归药材麻口病发病率均低于对照组，其中浸苗组当归药材发病率最低，防病指数达到41.45%。不同施药方法作用下的当归麻口病的防病效果为浸苗组>拌苗组>撒施组。2.3当归阿魏酸含量测定2.3.1色谱条件[8]条件标准色谱柱AgilentSB-C18（150mm×4.6mm，5µm）流动相乙腈—0.085%磷酸水溶液流速1mL/min柱温30℃检测波长316nm进样体积10μL图2阿魏酸含量测定色谱图2.3.2对照品溶液制备精密称取2.2mg阿魏酸对照品，用70%甲醇溶液定容至10mL容量瓶中，作为对照品母液，取对照品母液2mL定容至5mL容量瓶中，定容，摇匀，用0.45mm的微孔滤膜过滤即的对照品溶液，备用。2.3.3供试品溶液制备将阴干后的各组当归，粉碎过5号筛，称取约0.3g置于250mL锥形瓶中，精密加入20mL70%的甲醇溶液，称重，加热回流30min，放冷至室温，称重后，加入70%的甲醇补足减失的重量，抽滤，取滤液备用，进样前用0.45mm的微孔滤膜滤过。2.3.4线性关系考察取对照品储备液，按照进样量为1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0μL注入液相色谱仪，以“2.3.1”项下Y2色谱条件测定峰面积，以对照品进样量（X，μg）对峰面积（Y）进行线性回归，得到线性回归方程Y=57656.36683X-3.64579，R2=0.9999，即在0.088μg~0.176μg范围内线性关系良好。2.3.5精密度考察分别取“2.3.2”项下的对照品溶液，重复进样5次，记录峰面积，得到实验阿魏酸RSD为0.41%，测定结果均显示仪器精密度良好。2.3.6稳定性实验取各组当归样品5份，分别精密称定，按照2.3.3项下供试品溶液制备方法平行提取制备5份当归供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件在0、2、4、8、12、24h进行测定，组二实验阿魏酸RSD为1.15%，三项实验研究均表明样品在24h内的稳定性良好。2.3.7重复性实验取各组当归样品5份，分别精密称定，按照2.3.3项下供试品溶液制备方法平行提取制备5份当归供试品溶液，测定阿魏酸RSD值为0.68%，结果均表明表明该方法的重复性良好。2.3.8加样回收实验取各组当归样品6份，每份约0.2g，精密称定，置于10mL容量瓶中，加入一定量的阿魏酸对照品，分别按照2.3.3项下所对应得供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，各组按照其所对应的色谱条件测定阿魏酸含量，并计算其加样回收率，详见表2。表2不同年份当归药材阿魏酸及藁本内酯加样回收实验结果样品质量（g）样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)0.30690.20110.21820.40660.940.932.120.31250.19770.21550.40250.950.30490.19860.23510.41580.920.31040.20440.21770.41250.960.30770.19660.23660.41040.900.31080.20410.23110.41730.922.3.9样品含量测定按照2.3.3项下制备当归供试品溶液，每份样品做3组平行，按照外标法计算不同处理组岷归阿魏酸含量，测定结果见表3。表格3当归阿魏酸含量测定结果组别阿魏酸（mL/g）组一组二0.926±0.0017*0.995±0.0211*组三0.963±0.0180*组四0.846±0.2010注：*表示与对照组相比差异显著（P<0.05）由表3可知，2018年不同施药方法作用下当归药材的当归阿魏酸含量范围为0.846mL/g~0.995mL/g，均为浸苗组>拌苗组>撒施组>对照组。采用SPSS22分析各组当归化学成分差异性结果显示，经过不同施药方法处理各实验组当归阿魏酸含量与对照组相比差异均具有统计学意义。讨论当归麻口病病原为茎线虫属腐烂茎线虫[DitylenchusdestructorThorne],又名甘薯茎线虫、马铃薯茎线虫[9]。研究发现,当归麻口病病灶是一个寄主与寄生物间的复合结构,生物数量高达50种以上,构成了一个土壤生物食物链，麻口病正是各级食物链成员之间进行相互捕食、增殖、寄生等作用的结果[10~11]。当归成药期麻出现麻口病，即当归种植后第2年[12]。从外观来看，基本症状表现为发病植株内部组织呈现海绵状木质化，根部表皮粗糙,油性基本没有。感染初期,根部外表无症状表现,但其纵切面可见褐色糠腐状侵染点;病情扩展后,根部表皮纵裂成黄褐色裂纹,深1~2mm,且根毛增多并畸形生长,严重时整个根部皮层组织干烂,呈褐色糠腐状[13]。一旦当归出现麻口病，便会造成当归挥发性成分的散发，以及影响当归产量和品质。针对于目前种植业中出现的过度依赖化学肥料增产以及不科学使用化学农药防治病虫害等问题，中国农业届的研究者们探索出了众多新型的农业模式，如：自然农业、生态农业、有机农业、中医农业等。其中中医农业作为中国特色高效绿色的农业种植模式，因具有“生态种植、增产提质”的作用，在众多新型种植模式中脱颖而出[14]。“中医农业”是传统的中医原理与方法和现代农业技术的相融合，即将传统的中医理论应用于现代化农业领域，实现中医药与农业领域的跨界融合[15],利用中草药等生物元素协同天然矿物营养元素调理和保护动植物生长，利用动植物和微生物等生物群落之间的相生相克的机理优化动植物生长[16]，是现代农业发展的集成创新，实现其优势互补,是具有中国特色的创新型现代生态健康农业[17~18]。中药材在人类防病治病的历史上发挥了很重要的作用，但将它们用于控制植物病虫害的研究仍处于起步阶段。人类使用植物和植物产品防治病害虫的确切时间已无法知晓,最初简单、直接地应用植物防治害物,随着扩展相关的知识和经历不同的文明在慢慢发生了改变[19],早在古代，周礼中有记载“剪氏掌除蠹物，以攻萦攻之，以莾草熏之”就是利用莾草来防治仓储害虫。此外，《本草纲目》记载具杀虫活性的植物有百部、狼毒、楝树、芜花及鱼藤根等[20]，20世纪初至今国内外也有多项研究报道表明采用中药材制备杀虫抑菌制剂具有抑制植物病虫害、修复土壤污染、提高植物抗性等作用[19,21-22]，可以以多种方式开发利用，大规模应用于植株的栽培种植中。在景明及多位学者的文章里大多都能体现中医农学在现代各个领域的突破性进展。例如通过中药复方制备的生物农药与有机肥配合使用来减少当归重金属含量的影响，提高有效成分的含量，改善当归品质[23]。因此本课题的实验结合“中医农业”思想研究明确了中药复方药剂能够改善当归麻口病的发病情况，同时也能够提高当归阿魏酸含量，其中以浸苗处理效果最佳。本课题的创新点在于将传统的中医药思想同现代农业技术相结合，运用中药防病治病的原理，按照课题组筛选抑菌杀虫类中药材的最优复方，采用不同的施药方法处理当归种苗，改善当归麻口病的发病率，且提高当归阿魏酸含量，从为促进甘肃当地药材产业的长远发展角度来看，该研究具有很好的经济效益和社会效益，期待本课题研究的中药复方制剂能够较好的应用于较大面积的种植地区，为甘肃道地药材当归的绿色健康发展做贡献。本课题存在的不足之处在于：首选大田实验，受到气候、环境、地理等多种因素的影响。其次由于时间原因，本实验只是从大实验中筛选出两项指标来进行评价研究，使研究结果缺乏完整性，后期课题组将以参照《中华人民共和国药典》为主，查阅相关文献为辅，进一步对当归多项指标进行全面评价研究，使研究结果更加全面合理。参考文献：[1]郭增祥,武延安,王冯爱,曹占凤.当归“火药籽”及其分辨[J].甘肃农业科技,2013(03):57-58.[2]庄志宏,吴剑坤,陈志峰,等.不同产地当归中阿魏酸的含量测定[J].北京中医药,2011,30(8):624-625.[3]孙红梅,张本刚,齐耀东,等.当归药材资源调查与分析[J].中国农学通报,2009,25(23):437-441.[4]龚成文,米永伟,漆永红,张东佳,武伟国.甘肃中药材连作障碍问题探析[J].甘肃科技,2020,36(04):153-155.[5]刘娟娟,景明,陈正君,陈晖,卢年华,张艳霞.常用杀虫中药杀虫效果比较及其配伍的初步研究[J].中国中医药信息杂志,2016,23(07):54-58.[6]柳娜,王雅莉,张旭东,刘雪枫,周万里,王强,景明.中药复方农药与中药复方肥料对当归质量的影响研究[J/OL].中药材,2019(02):267-270[2019-05-06].[7]张大为,惠娜娜,马永强,王立,李继平,陈明.药剂浸苗对当归麻口病的防效[J].甘肃农业科技,2014(07):21-23.[8]国家药典委员会.中国药典.[S].北京:中国医药科技出版社,2015.[9]柴兆祥,李金花,李应东,丁峰.当归茎线虫病田间分布型及抽样技术研究[J].植物保护,2004(03):59-61.[10]张广学,李静华,籍秀琴,杨宝君,钟铁森,单秀章.当归麻口病的病因研究[J].中国科学(B辑化学生命科学地学),1990(01):37-43.[11]马象震,苗晓春.当归麻口病的发生及其综合防治[J].甘肃农业科技,2008(11):53-54.[12]柴兆祥,李金花,李应东,丁峰.当归茎线虫病田间分布型及抽样技术研究[J].植物保护,2004(03):59-61.[13]马象震,苗晓春.当归麻口病的发生及其综合防治[J].甘肃农业科技,2008(11):53-54.[14]况国高,李静静,纪森鹏,等.中医农业技术在小麦上的增产降害效果[J].农业与技术,2020,40(2):