DB34-T 825-2008 动物组织中莱克多巴胺的残留测定酶联免疫吸附法

DB34T8252008动物组织中莱克多巴胺的残留测定酶联免疫吸附法1范围本标准规定了动物组织中莱克多巴胺残留量的酶联免疫吸附测定方法。本标准适用于猪、牛、羊等动物肌肉组织中莱克多巴胺残留量的测定。本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。2原理试样中的莱克多巴胺经缓冲溶液提取，离心后取上清液，通过酶联免疫吸附法进行测定。该方法基于抗原抗体特异性反应，将莱克多巴胺与酶标莱克多巴胺竞争结合固相载体上的特异性抗体，加入底物溶液后，酶催化底物产生显色反应，显色强度与试样中莱克多巴胺含量成反比，通过酶标仪测定吸光度值，根据标准曲线计算试样中莱克多巴胺的含量。3试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的三级水。3.1莱克多巴胺标准品：纯度≥98.0%。3.2乙腈：色谱纯。3.3正己烷：色谱纯。3.4甲醇：色谱纯。3.5氢氧化钠溶液（1mol/L）：称取4.0g氢氧化钠，溶于100mL水中。3.6盐酸溶液（1mol/L）：量取8.3mL浓盐酸，用水稀释至100mL。3.7磷酸盐缓冲溶液（PBS，0.01mol/L，pH7.4）：称取8.0g氯化钠、0.2g氯化钾、3.58g磷酸氢二钠十二水合物、0.24g磷酸二氢钾，溶于1000mL水中，用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节pH至7.4。3.8提取缓冲液：称取1.46g磷酸氢二钠、0.44g磷酸二氢钾、8.0g氯化钠、0.2g氯化钾，溶于900mL水中，加入1mLTween20，用水定容至1000mL，用盐酸溶液调节pH至7.4。3.9洗涤缓冲液：取提取缓冲液，用水稀释10倍。3.10莱克多巴胺酶联免疫试剂盒：包括包被有莱克多巴胺抗体的微孔板、莱克多巴胺标准溶液（0μg/L、0.1μg/L、0.3μg/L、0.9μg/L、2.7μg/L、8.1μg/L）、酶标莱克多巴胺工作液、底物溶液、终止液。3.11莱克多巴胺标准储备液（100mg/L）：准确称取10.0mg莱克多巴胺标准品，用甲醇溶解并定容至100mL，20℃保存，有效期3个月。3.12莱克多巴胺标准工作液：用提取缓冲液将标准储备液稀释成适当浓度的标准工作液，现用现配。4仪器和设备4.1酶标仪：配备450nm滤光片。4.2匀浆机：转速不低于10000r/min。4.3离心机：转速不低于4000r/min。4.4电子天平：感量0.01g和0.0001g。4.5微量移液器：10μL~100μL，100μL~1000μL。4.6恒温培养箱：温度控制范围（37±1）℃。4.7涡旋混合器。4.8振荡器。4.9聚丙烯离心管：50mL。4.10微孔板振荡器。5试样制备与保存5.1试样制备：取动物肌肉组织，去除脂肪和结缔组织，切成小块，用匀浆机匀浆，混匀后分装，备用。6分析步骤6.1提取：称取2.0g（精确至0.01g）匀浆后的试样于50mL聚丙烯离心管中，加入10mL提取缓冲液，涡旋混合1min，振荡10min，以4000r/min离心10min，取上清液备用。6.2净化：取1.0mL上清液，加入1mL正己烷，涡旋混合1min，以4000r/min离心5min，弃去上层正己烷层，取下层水相待测。6.3测定：6.3.1取出所需数量的微孔条，设置标准品孔和样品孔，每个标准品和样品做两个平行。6.3.2在标准品孔中加入50μL莱克多巴胺标准溶液，在样品孔中加入50μL待测样品溶液。6.3.3每孔加入50μL酶标莱克多巴胺工作液，轻轻振荡混匀，用封板膜封板，置于37℃恒温培养箱中孵育30min。6.3.4取出微孔板，弃去孔内液体，每孔加入250μL洗涤缓冲液，洗涤3次，每次1min，一次在吸水纸上拍干。6.3.5每孔加入100μL底物溶液，轻轻振荡混匀，室温避光反应15min。6.3.6每孔加入50μL终止液，轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值。6.4标准曲线绘制：以莱克多巴胺标准溶液浓度的对数为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。7结果计算试样中莱克多巴胺残留量按式（1）计算：X=C×V×D/m式中：X——试样中莱克多巴胺残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；C——从标准曲线上查得的试样提取液中莱克多巴胺的浓度，单位为微克每升（μg/L）；V——提取液总体积，单位为毫升（mL）；D——稀释倍数；m——试样质量，单位为克（g）。计算结果保留两位有效数字。8精密度本方法的相对标准偏差应小于15%。9检测限和定量限本方法的检出限为0.5μg/kg，定量限为1.0μg/kg。10注意事项10.1试剂盒应于2℃~8℃保存，使用前恢复至室温。10.