基于沉默Int6基因复合生物支架的血管化腹股沟疝补片构建及机制探究

基于沉默Int6基因复合生物支架的血管化腹股沟疝补片构建及机制探究一、引言1.1研究背景与意义腹股沟疝是外科领域的常见多发病，指腹腔内脏器通过腹股沟区的缺损向体表突出所形成的疝。在全球范围内，其发病率呈现出较高的态势，且随着人口老龄化的加剧，患者数量也在不断增加。据相关统计数据表明，在欧美国家，每年每10万人中约有300-500人被诊断为腹股沟疝，而在亚洲国家，发病率也不容小觑，约为每10万人中200-400人。腹股沟疝的发生会对患者的生活质量产生严重影响，患者常出现腹股沟区的坠胀感、疼痛，尤其是在站立、行走或体力劳动时症状更为明显，这极大地限制了患者的日常活动。若疝内容物发生嵌顿或绞窄，还可能引发肠梗阻、肠坏死等严重并发症，甚至危及生命。目前，手术治疗是腹股沟疝的主要治疗方式，而疝修补术是其中应用最为广泛的方法。疝修补术的核心在于使用补片来加强腹壁的薄弱区域，防止疝的复发。补片在疝修补术中起着至关重要的作用，它就如同汽车轮胎上的补丁，能够有效阻挡小肠、大网膜等脏器或组织从疝环突出，从而达到治疗的目的。补片的应用显著降低了腹股沟疝的复发率，传统手术的复发率高达10%-20%，而使用补片后的复发率可降至1%-5%。然而，当前临床使用的补片仍存在一些局限性。例如，部分补片的生物相容性不佳，可能引发机体的免疫排斥反应，导致局部炎症、疼痛等不适症状；一些补片的力学性能不够理想，在长期的体内环境作用下，容易出现变形、破裂等情况，影响补片的使用寿命和治疗效果；补片的血管化问题也不容忽视，血管化不足会导致补片与周围组织的融合不佳，增加感染的风险，进而影响手术的成功率。血管化对于补片在体内的功能发挥和组织修复至关重要。良好的血管化能够为补片提供充足的血液供应，带来必要的营养物质和氧气，同时及时清除代谢废物，促进补片与周围组织的整合和愈合。研究表明，血管化良好的补片周围组织炎症反应较轻，感染发生率可降低约30%-50%，且组织修复速度明显加快，能够有效提高疝修补术的长期疗效。而Int6基因在血管生成过程中扮演着关键角色，它参与调控多种血管生成相关因子的表达和信号通路。通过沉默Int6基因，可以改变细胞的生物学行为，促进血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，为构建血管化补片提供了新的思路和靶点。基于以上背景，本研究旨在构建沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片，并深入探究其促血管化机制。这一研究具有重要的理论意义和实际应用价值。从理论层面来看，有助于深入揭示Int6基因在血管生成中的作用机制，丰富组织工程和再生医学领域的理论知识；在实际应用方面，有望开发出性能更优异的腹股沟疝补片，提高疝修补术的疗效，降低复发率和并发症发生率，为广大腹股沟疝患者带来更好的治疗选择和生活质量改善。1.2国内外研究现状在腹股沟疝补片的研究方面，国外起步较早，在材料研发和临床应用上积累了丰富的经验。早期以不可吸收的合成材料补片为主，如聚丙烯补片，凭借其良好的力学性能和较高的抗张强度，在疝修补术中得到广泛应用，显著降低了疝的复发率。但随着临床应用的深入，其引发的慢性疼痛、组织粘连、感染等并发症问题逐渐凸显，促使研究人员不断探索新型补片材料。近年来，可吸收材料补片和生物补片成为研究热点。美国Allergan公司研发的SeriScaffold补片，源于蚕丝，具有良好的生物相容性和力学性能，在体内可逐渐降解吸收，减少了异物残留带来的风险。国内在腹股沟疝补片领域的研究也取得了一定进展，在借鉴国外先进技术的基础上，不断进行自主创新。一些国产的复合补片通过将不同性能的材料结合，试图综合发挥各种材料的优势，提高补片的整体性能。例如，有研究将天然生物材料与合成高分子材料复合，既利用天然材料良好的生物相容性促进组织愈合，又借助合成材料的力学强度维持补片的结构稳定。然而，目前国内外对于腹股沟疝补片的研究仍存在一些不足。一方面，现有的补片在血管化方面的研究相对较少，血管化程度不足导致补片与周围组织的整合效果不佳，影响了补片的长期稳定性和治疗效果，增加了感染和复发的风险；另一方面，补片材料的选择和设计往往难以兼顾生物相容性、力学性能和降解性能等多方面的要求，缺乏一种能够全面满足临床需求的理想补片材料。在生物支架用于组织工程的研究中，国外在支架材料的设计、制备工艺以及细胞与支架的相互作用等方面处于领先地位。通过先进的3D打印技术、静电纺丝技术等，能够精确控制支架的微观结构和孔隙率，为细胞的黏附、增殖和分化提供良好的微环境。例如，利用3D打印技术制备的个性化生物支架，可以根据患者的具体解剖结构进行定制，提高支架与组织的适配性。国内在生物支架领域也紧跟国际步伐，加大研究投入，在一些关键技术上取得了突破。在支架材料的国产化方面取得了一定成果，研发出多种具有自主知识产权的生物支架材料。但目前生物支架在实际应用中仍面临诸多挑战。支架的力学性能与体内组织的力学匹配性问题尚未得到很好的解决，在承受生理载荷时，容易出现变形、断裂等情况，影响组织修复效果；生物支架与周围组织的界面整合问题也有待进一步研究，如何促进支架与组织之间形成牢固的连接，防止界面分离，是提高组织工程治疗效果的关键。关于Int6基因与血管化关系的研究，国外学者通过大量的细胞实验和动物模型研究，揭示了Int6基因在血管生成信号通路中的关键作用。研究发现Int6基因可以通过调控多种血管生成相关因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等的表达，影响血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。国内相关研究则从不同角度深入探讨了Int6基因在血管化过程中的作用机制，如通过基因编辑技术改变Int6基因的表达水平，观察其对血管生成相关细胞行为和分子机制的影响。然而，目前对于Int6基因调控血管化的具体分子机制尚未完全明确，仍存在许多未知的信号通路和调控因子有待进一步探索。此外，如何将Int6基因的研究成果有效应用于实际的组织工程和临床治疗中，也是当前面临的重要问题。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在构建一种新型的沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片，通过对补片材料和结构的优化设计，以及基因调控技术的应用，实现补片的高效血管化，提高补片与周围组织的整合能力和稳定性。同时，深入探究该补片促血管化的分子机制和细胞生物学机制，为腹股沟疝补片的研发和临床应用提供坚实的理论基础和技术支持，最终达到降低腹股沟疝复发率和并发症发生率，改善患者预后和生活质量的目的。1.3.2研究内容沉默Int6基因的骨髓间充质干细胞的获取与鉴定：从健康志愿者的骨髓中采集骨髓间充质干细胞（BMSCs），采用密度梯度离心法结合贴壁培养法进行分离和纯化。利用慢病毒介导的RNA干扰技术，将针对Int6基因的短发夹RNA（shRNA）导入BMSCs中，实现Int6基因的沉默。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测Int6基因在mRNA和蛋白质水平的表达，验证沉默效果。运用流式细胞术对沉默Int6基因后的BMSCs进行表面标志物鉴定，确保细胞的生物学特性未发生改变。复合生物支架的制备与性能表征：选择具有良好生物相容性和力学性能的材料，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）、丝素蛋白（SF）等，采用静电纺丝技术、3D打印技术等制备复合生物支架。通过扫描电子显微镜（SEM）观察支架的微观结构，测定其孔隙率、孔径分布等参数，评估支架对细胞黏附、增殖和迁移的影响。对复合生物支架进行力学性能测试，包括拉伸强度、压缩强度、弹性模量等，确保其在体内能够承受生理载荷。构建沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片：将沉默Int6基因的BMSCs接种到复合生物支架上，构建细胞-支架复合物。通过体外培养实验，观察细胞在支架上的生长、增殖和分化情况，利用免疫荧光染色、细胞活性检测等方法评估细胞与支架的相互作用。将构建好的补片植入动物模型的腹股沟疝部位，通过体内实验观察补片的血管化过程、组织整合情况以及对疝修复的效果，采用组织学分析、免疫组化分析等技术对补片进行评估。探究沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片的促血管化机制：从分子生物学层面，利用qRT-PCR、Westernblot等技术检测补片植入后血管生成相关因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等的表达变化，分析Int6基因沉默对这些因子表达的调控作用。通过蛋白质芯片技术、免疫共沉淀技术等研究Int6基因沉默后相关信号通路的激活或抑制情况，揭示其在血管生成中的信号转导机制。从细胞生物学角度，观察沉默Int6基因的BMSCs对血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成能力的影响，利用Transwell实验、体外血管生成实验等进行验证。研究补片植入后体内免疫细胞的浸润和炎症反应情况，分析其对血管化过程的影响，探讨免疫调节在补片促血管化中的作用机制。1.4研究方法与技术路线本研究综合运用多种研究方法，以确保研究的科学性、可靠性和有效性。通过实验研究获取第一手数据，借助文献研究全面了解领域现状，运用数据分析方法深入挖掘数据背后的规律和机制，采用生物信息学分析技术揭示基因和蛋白质层面的作用机制。在实验研究方面，进行细胞实验和动物实验。细胞实验通过细胞培养、转染、增殖与迁移实验、免疫荧光染色等技术，研究沉默Int6基因对骨髓间充质干细胞生物学行为的影响，以及细胞与复合生物支架的相互作用。在动物实验中，构建腹股沟疝动物模型，植入构建的补片，观察补片在体内的血管化、组织整合和疝修复效果，并进行组织学和免疫组化分析。文献研究则贯穿整个研究过程。广泛查阅国内外相关文献，包括学术期刊论文、学位论文、研究报告等，全面梳理腹股沟疝补片、生物支架以及Int6基因与血管化关系的研究现状，为研究提供理论基础和思路参考。同时，跟踪最新研究动态，及时调整和完善研究方案。在数据分析方法上，运用统计学分析方法对实验数据进行处理和分析。对于定量数据，采用方差分析、t检验等方法，比较不同组之间的差异，判断实验结果的显著性；对于定性数据，采用卡方检验等方法进行分析。运用数据挖掘技术，从大量的实验数据中挖掘潜在的规律和关联，为研究结果的解释和讨论提供支持。生物信息学分析技术用于对基因和蛋白质数据的分析。通过生物信息学数据库，如GenBank、Uniprot等，获取Int6基因和相关血管生成因子的序列和结构信息。利用生物信息学软件，如BLAST、ClustalW等，进行序列比对和分析，预测基因和蛋白质的功能和相互作用关系。通过构建基因调控网络和信号通路图，深入揭示Int6基因沉默对血管生成相关信号通路的调控机制。技术路线方面，首先从健康志愿者骨髓中采集骨髓间充质干细胞，经分离纯化后，利用慢病毒介导的RNA干扰技术沉默Int6基因，通过qRT-PCR和Westernblot验证沉默效果，并用流式细胞术鉴定细胞表面标志物。同时，选择合适材料，用静电纺丝和3D打印等技术制备复合生物支架，通过SEM观察微观结构，测定孔隙率、孔径分布等参数，并进行力学性能测试。之后，将沉默Int6基因的骨髓间充质干细胞接种到复合生物支架上，构建细胞-支架复合物，经体外培养实验评估细胞与支架相互作用后，植入腹股沟疝动物模型体内，通过体内实验观察补片血管化、组织整合及疝修复效果，进行组织学和免疫组化分析。最后，从分子生物学和细胞生物学层面探究补片促血管化机制，利用qRT-PCR、Westernblot等技术检测血管生成相关因子表达变化，用蛋白质芯片、免疫共沉淀等技术研究相关信号通路，通过Transwell实验、体外血管生成实验等观察沉默Int6基因的骨髓间充质干细胞对血管内皮细胞行为的影响，分析补片植入后体内免疫细胞浸润和炎症反应对血管化的影响。具体技术路线流程如图1所示。[此处插入技术路线图，图中清晰展示从细胞获取、基因沉默、支架制备、补片构建到体内外实验及机制探究的各个环节和步骤，各环节之间用箭头表示先后顺序和逻辑关系]图1技术路线图二、相关理论基础2.1腹股沟疝概述腹股沟疝是一种常见的外科疾病，指腹腔内脏器通过腹股沟区的缺损向体表突出所形成的疝。腹股沟区作为腹壁的薄弱区域，其独特的解剖结构使得该部位在受到腹内压力作用时容易出现疝的发生。腹壁下动脉外侧的腹股沟管深环（内环）、腹股沟管以及腹股沟管浅环（外环）共同构成了腹股沟疝的潜在通道。当腹内压力增高，如在咳嗽、便秘、用力过度、小儿过度啼哭等情况下，腹腔脏器便可能通过这些薄弱部位向外突出，从而形成腹股沟疝。腹股沟疝主要分为斜疝和直疝两种类型。斜疝是最为常见的类型，约占腹股沟疝的70%-90%，其疝囊经过腹壁下动脉外侧的腹股沟管深环突出，向内、向下、向前斜行经过腹股沟管，再穿出腹股沟管浅环，并可进入阴囊。直疝则相对较少见，占腹股沟疝的10%-30%，疝囊经腹壁下动脉内侧的直疝三角区直接由后向前突出，不经过内环，也不进入阴囊。腹股沟疝的症状表现具有一定的特征性。早期，患者通常会在腹股沟区发现一个可复性肿块，这是腹股沟疝的典型症状之一。肿块在站立、行走、咳嗽或用力时出现，平卧或用手推送时可回纳消失。随着病情的进展，肿块可能会逐渐增大，难以回纳，患者可能会感到腹股沟区的坠胀感、疼痛，尤其在长时间站立或体力劳动后症状会更加明显。若疝内容物发生嵌顿，即疝块突然不能回纳，且伴有明显疼痛，此时疝内容物可能会因血液循环障碍而发生绞窄，导致肠梗阻、肠坏死等严重并发症，若不及时处理，将危及患者生命。腹股沟疝对患者的身体健康和生活质量会产生诸多不良影响。除了身体上的疼痛和不适外，还会限制患者的日常活动，降低生活质量。对于从事体力劳动的患者来说，病情可能会导致他们无法正常工作，影响家庭经济收入。此外，由于疝的存在，患者可能会产生心理负担，担心病情恶化，影响心理健康。据相关研究表明，腹股沟疝患者的生活质量评分在生理功能、躯体疼痛、一般健康状况、社会功能等维度上均显著低于正常人。目前，手术治疗是腹股沟疝的主要治疗方法，包括传统疝修补术、无张力疝修补术和腹腔镜疝修补术等。传统疝修补术主要是通过将邻近组织进行缝合来修补疝缺损，但这种方法对组织的损伤较大，术后疼痛明显，恢复时间长，复发率也相对较高，约为10%-20%。无张力疝修补术则是利用补片来加强腹壁的薄弱区域，补片的应用降低了组织的张力，减少了术后疼痛和复发率，复发率可降至1%-5%。腹腔镜疝修补术是一种微创手术，具有创伤小、恢复快、疼痛轻等优点，但手术操作相对复杂，对设备和技术要求较高，费用也相对较贵。在众多手术治疗方法中，补片治疗因其能够有效降低复发率、减轻患者痛苦等优势，逐渐成为腹股沟疝手术治疗的主流方式。补片的使用能够为腹壁提供额外的支撑，增强腹壁的强度，减少疝的复发风险，为患者的康复带来了更好的效果。2.2疝补片的发展与分类疝补片的发展历程是一部不断创新与突破的历史，它见证了医学领域从传统经验治疗向现代精准治疗的转变。在古代，由于医疗技术的局限，人们使用动物筋膜、皮肤等天然材料进行疝的修补，但这些材料往往无法满足长期的治疗需求，疝的复发率较高。随着医学的发展，疝补片逐渐从天然材料向合成材料转变，丝线、棉线等材料开始被用于疝修补，这些材料在一定程度上改善了修补效果，但仍存在诸多不足。20世纪中期，合成材料的出现为疝补片的发展带来了重大变革。聚丙烯、聚酯等合成材料具有更好的生物相容性和耐用性，使得疝补片的设计更加多样化，能够根据患者的具体情况进行选择。1958年，Usher等首次使用由聚乙烯组成的Marlex补片，开启了合成补片的新时代。随后，聚丙烯补片因其抗张力强、柔硬适度、组织相容性好且价格相对便宜等优点，在临床应用中占据了重要地位。1984年，美国外科医师Lichtenstein使用聚丙烯制作成的补片用于外科疝修补，之后人工材料在疝与腹壁外科手术中得到了广泛应用。但合成补片在腹腔内与内脏直接接触时，可能会引发严重的粘连，导致肠梗阻和肠管补片侵蚀等并发症。随着细胞学和组织工程技术的不断进步，生物补片材料应运而生。生物补片具有更好的生物相容性和生物活性，能够促进组织再生和修复，在减少术后疼痛、加速伤口愈合等方面具有潜在优势。第一个用于疝修补的生物材料是来自冰冻的尸体真皮层、阔筋膜张肌和硬脑膜组织，但临床效果不佳。后来，由尸体的真皮组织制造的脱细胞真皮组织，因其耐感染性好、良好组织相容性、完全可吸收等优势，被用于污染部位的腹壁疝修补术并取得了良好效果。生物补片材料主要包括各种异种组织、同种异体组织来源。如今，疝补片的发展呈现出多元化的趋势。三维打印技术为疝补片的个性化定制提供了可能，能够根据患者的具体解剖结构打印出合适的补片，实现复杂结构设计，提高补片的贴合度和稳定性。智能化疝补片结合了生物材料、传感器、智能药物释放等技术，能够实时监测疝的情况并进行相应治疗，根据患者的生理变化自动调整补片的性能，提高治疗效果，在减少术后并发症、提高患者生活质量方面具有巨大潜力。目前，疝补片主要分为不可吸收补片、部分可吸收补片、可吸收补片和生物补片这几类，每一类补片都有其独特的优缺点，在临床应用中需要根据患者的具体情况进行选择。不可吸收补片多由聚丙烯、膨化聚四氟乙烯、聚酯等材料制成。聚丙烯补片是应用最广泛的不可吸收补片，它是一种永久的单丝碳聚合物，具有抗张力强、柔硬适度、良好的组织相容性和生物惰性等优点。但如果放置在腹腔内与内脏直接接触，容易形成严重粘连，导致肠梗阻和肠管补片侵蚀。聚四氟乙烯是一种线性均链聚合物，由饱和氟原子的碳主链构成，是带有很高负电荷的惰性材料，不会被人体吸收，而是作为异物包裹在体内。自从引入膨化聚四氟乙烯后，一般已较少使用聚四氟乙烯，它的微孔比聚四氟乙烯多，但制成补片时，仍不允许组织向内生长。膨化聚四氟乙烯的主要优点是可以直接放置在内脏上，不易粘连，但其孔径较小，容易引起细菌定植，一旦感染，通常需要取出补片。聚酯补片由对苯二甲酸的聚合物为原料制成，对苯二甲酸亲水，可被水解降解。以往认为使用聚酯补片者的肠外瘘形成、补片感染和疝复发的发生率更高，但随着手术技术以及涂层材料的发展，聚酯材料的使用有所增多。部分可吸收补片是将不可吸收材料与可吸收材料相结合，试图综合两者的优势。可吸收材料部分在体内逐渐降解吸收，减少了异物残留的风险，而不可吸收材料部分则提供了一定的力学支撑。但这种补片在材料的比例和降解速度的控制上存在一定难度，如果可吸收材料降解过快，可能会导致补片的力学性能下降，影响疝修补的效果；如果降解过慢，则无法充分发挥可吸收材料的优势。可吸收补片通常由可吸收的高分子材料制成，如聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等。这类补片在体内可逐渐降解并被人体吸收，避免了长期异物留存带来的潜在风险，减少了感染和慢性炎症的发生几率。然而，可吸收补片的力学性能往往不如不可吸收补片，在承受较大的腹内压力时，可能会出现变形、破裂等情况，限制了其在一些对力学性能要求较高的疝修补手术中的应用。此外，可吸收补片的降解产物可能会引起局部的炎症反应，虽然一般较为轻微，但仍需要在临床应用中加以关注。生物补片源于动物或人体组织，经过脱细胞等处理后得到。它具有良好的生物相容性，能够诱导组织再生，减少炎症反应和粘连的发生。在复杂疝修补术、污染或潜在污染区域的疝修补中具有独特的优势。但生物补片的来源有限，制备过程复杂，成本较高，且存在传播疾病的潜在风险。不同来源和制备工艺的生物补片质量差异较大，其力学性能和降解特性也难以精确控制，这在一定程度上影响了其临床应用的广泛性和稳定性。2.3生物支架在组织工程中的应用生物支架在组织工程领域扮演着至关重要的角色，它为细胞的生长、增殖和分化提供了一个三维的物理支撑结构，模拟了细胞外基质（ECM）的功能，促进组织的修复和再生。其作用原理基于细胞与支架之间的相互作用。生物支架具有多孔结构，这些孔隙为细胞的黏附提供了位点，细胞可以通过表面的黏附分子与支架材料相互结合。支架的孔隙还允许营养物质和氧气的扩散，为细胞的代谢活动提供必要的物质基础，同时排出细胞产生的代谢废物，维持细胞生存的微环境稳定。生物支架还可以通过释放生长因子、细胞信号分子等，调节细胞的生物学行为，如促进细胞的增殖、迁移和分化，引导组织的有序再生。在骨组织工程中，生物支架被广泛应用于骨缺损的修复。例如，磷酸钙基生物支架，如羟基磷灰石（HA）和磷酸三钙（TCP），由于其化学成分与天然骨矿物质相似，具有良好的生物相容性和骨传导性，能够引导成骨细胞的黏附、增殖和分化，促进新骨组织的形成。研究表明，将HA/TCP复合支架植入兔股骨髁骨缺损模型中，8周后观察到大量新骨组织生成，骨缺损得到明显修复。3D打印技术制备的个性化骨支架，能够根据患者骨缺损的具体形状和尺寸进行定制，精确匹配骨缺损部位，提高支架与周围骨组织的融合度。这些个性化支架可以在微观结构上模拟天然骨的孔隙结构和力学性能，为骨组织的再生提供更有利的条件，促进骨组织的快速修复和重建。在皮肤组织工程中，生物支架用于皮肤缺损的修复和再生。胶原基生物支架是常用的皮肤组织工程支架材料之一，胶原是皮肤的主要成分，具有良好的生物相容性和生物活性，能够促进皮肤细胞的黏附和增殖，加速创面愈合。将胶原支架应用于大鼠皮肤缺损模型，结果显示，与对照组相比，使用胶原支架的创面愈合速度明显加快，上皮化程度更高，炎症反应更轻。壳聚糖及其衍生物也是皮肤组织工程中具有潜力的支架材料，壳聚糖具有抗菌、止血、促进细胞增殖等多种生物学功能，能够为皮肤细胞的生长提供良好的微环境。通过将壳聚糖与其他材料复合，如与明胶复合制备的壳聚糖-明胶复合支架，进一步改善了支架的性能，提高了皮肤组织修复的效果。在血管组织工程中，构建具有良好血管化能力的生物支架对于血管修复和再生至关重要。聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种常用的可降解高分子材料，具有良好的生物相容性和可加工性，可用于制备血管组织工程支架。通过静电纺丝技术制备的PLGA纳米纤维支架，其纤维直径和孔隙结构与天然血管的细胞外基质相似，能够支持血管内皮细胞和平滑肌细胞的黏附、增殖和分化，促进血管的形成。研究表明，将人脐静脉内皮细胞接种到PLGA纳米纤维支架上，在体外培养条件下，细胞能够在支架上良好生长，并形成类似血管的结构。丝素蛋白（SF）也被广泛应用于血管组织工程支架的制备，丝素蛋白具有良好的力学性能和生物相容性，能够为血管细胞提供稳定的支撑环境。将SF与其他材料复合，如与PLGA复合制备的SF/PLGA复合支架，结合了两种材料的优势，在促进血管细胞生长和血管化方面表现出更好的性能。2.4Int6基因的功能与作用机制Int6基因，全称为integratorcomplexsubunit6，位于人类染色体13q14.3上，编码的蛋白质属于Integrator复合体家族，在细胞的生命活动中发挥着多方面的关键作用。在RNA代谢过程中，Int6基因起着不可或缺的调控作用。Integrator复合体在RNA加工中扮演重要角色，而Int6作为其中的一个亚单位，深度参与了pre-mRNA的剪接和3'端加工过程。在pre-mRNA剪接时，Int6帮助识别并精确移除内含子，保留外显子，使mRNA前体能够准确地加工成成熟的mRNA，确保基因表达的准确性。在mRNA的3'端加工中，Int6参与了poly-A尾的添加，这一过程对mRNA的稳定性和翻译效率有着至关重要的影响，poly-A尾可以保护mRNA不被核酸酶降解，同时促进mRNA与核糖体的结合，提高翻译效率。Int6还与RNA的输出和稳定性密切相关，它协助加工后的mRNA从细胞核准确无误地输送到细胞质，为蛋白质合成提供模板，保障细胞内蛋白质合成的正常进行。在细胞增殖、分化和凋亡等生物学过程中，Int6基因同样发挥着重要的调控作用。研究表明，Int6基因能够影响细胞周期的进程，进而调控细胞增殖。在正常细胞中，Int6基因通过与细胞周期相关蛋白相互作用，维持细胞周期的正常运转，确保细胞有序地进行增殖。当Int6基因表达异常时，可能导致细胞周期紊乱，使细胞增殖失控，从而引发肿瘤等疾病。在细胞分化方面，Int6基因参与了多种细胞类型的分化调控。在神经细胞分化过程中，Int6基因可以通过调节相关信号通路，影响神经干细胞向神经元和神经胶质细胞的分化方向和进程，对神经系统的发育和功能维持起着重要作用。在细胞凋亡调控中，Int6基因也扮演着关键角色。它可以通过与凋亡相关蛋白相互作用，调节细胞凋亡信号通路的激活或抑制，决定细胞是否进入凋亡程序。在某些应激条件下，Int6基因表达的改变可能会影响细胞对凋亡信号的敏感性，进而影响细胞的存活和死亡。Int6基因与血管生成之间存在着紧密的关联。研究发现，Int6基因能够通过多种途径影响血管生成过程。Int6可以与缺氧诱导因子（HIF）相互作用，调节HIF介导的血管生成相关基因的转录。在缺氧条件下，HIF-2α的活性会受到Int6的抑制，而抑制Int6的表达或功能可以增强HIF-2α的活性，从而促进缺氧应激反应基因的转录，上调血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）等血管生成因子的表达，进而促进血管生成。Int6基因还可能通过影响血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成等生物学行为来调控血管生成。沉默Int6基因可以导致血管内皮细胞的增殖和迁移能力增强，促进管腔形成，从而加速血管生成过程。这些研究结果表明，Int6基因在血管生成中发挥着重要的调节作用，其异常表达或功能障碍可能会影响血管的正常生成和发育，与多种血管相关疾病的发生发展密切相关。三、沉默Int6基因的复合生物支架构建血管化腹股沟疝补片的实验设计3.1实验材料与仪器细胞：骨髓间充质干细胞（BMSCs），取自健康志愿者的骨髓，用于后续的基因沉默和细胞-支架复合实验。选择骨髓间充质干细胞是因为其具有多向分化潜能，能够在合适的条件下分化为多种细胞类型，包括血管内皮细胞等，这对于构建血管化的腹股沟疝补片至关重要。同时，骨髓间充质干细胞来源相对丰富，获取较为方便，且具有较低的免疫原性，在组织工程和再生医学领域有着广泛的应用前景。生物材料：聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA），一种可降解的合成高分子材料，具有良好的生物相容性和可加工性，其降解产物对人体无毒副作用，可用于制备复合生物支架的骨架结构，为细胞的生长和增殖提供物理支撑；丝素蛋白（SF），来源于蚕丝，具有优异的力学性能和生物相容性，能够促进细胞的黏附和生长，可与PLGA复合，改善支架的性能，使其更符合组织工程支架的要求；壳聚糖，是一种天然多糖，具有抗菌、止血、促进细胞增殖等多种生物学功能，且生物相容性良好，可用于修饰支架表面，提高支架与细胞的相互作用，促进细胞在支架上的黏附和生长。试剂：针对Int6基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体，用于沉默BMSCs中的Int6基因，实现对基因表达的精确调控；胎牛血清（FBS），为细胞培养提供必要的营养物质和生长因子，促进细胞的生长和增殖；DMEM/F12培养基，是一种常用的细胞培养基，含有细胞生长所需的多种营养成分，能够满足BMSCs的生长需求；胰蛋白酶，用于消化细胞，使其从培养瓶壁上脱离下来，以便进行细胞传代和实验操作；青霉素-链霉素双抗溶液，能够抑制细菌的生长，防止细胞培养过程中的污染；CCK-8试剂，用于检测细胞的活性和增殖能力，通过检测细胞对CCK-8试剂的代谢产物的吸光度，来评估细胞的生长状态；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒，用于对组织切片进行染色，使细胞和组织的形态结构清晰可见，便于进行组织学分析；免疫组化抗体，包括针对血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）等血管生成相关因子的抗体，用于检测这些因子在补片植入后的表达情况，探究补片的促血管化机制。仪器设备：低速离心机，用于细胞和试剂的离心分离，使细胞沉淀或去除杂质；恒温培养箱，提供适宜的温度、湿度和气体环境，用于细胞的培养和生长；超净工作台，提供无菌的操作环境，防止实验过程中的微生物污染；荧光定量PCR仪，用于检测基因的表达水平，通过对荧光信号的实时监测，精确测定Int6基因等在mRNA水平的表达量；蛋白质免疫印迹仪，用于检测蛋白质的表达水平，通过对蛋白质的分离、转膜和免疫杂交，分析Int6基因等在蛋白质水平的表达变化；扫描电子显微镜（SEM），用于观察生物支架和细胞-支架复合物的微观结构，直观地了解支架的孔隙结构、纤维形态以及细胞在支架上的黏附情况；万能材料试验机，用于测试生物支架的力学性能，包括拉伸强度、压缩强度、弹性模量等，评估支架在体内承受生理载荷的能力；小动物活体成像系统，用于在动物实验中对补片的血管化过程和组织整合情况进行实时监测和成像分析，直观地观察补片在体内的生物学行为。3.2实验动物的选择与处理本研究选用巴马小型猪作为实验动物，共计20只，均为雄性，体重范围在15-20千克。选择巴马小型猪的原因主要有以下几点：其一，巴马小型猪的腹壁解剖结构和生理功能与人类较为相似，其腹壁厚度、肌肉力量等因素使其成为疝修补补片实验的理想模型，能够更好地模拟人体疝修补环境，为研究提供更具参考价值的实验数据。其二，巴马小型猪体型适中，便于实验操作和术后护理，且其繁殖能力较强，来源相对稳定，能够满足实验对动物数量的需求。其三，小型猪在心血管、消化、免疫等系统的生理特征以及对疾病的反应上与人类有许多相似之处，这有助于更准确地评估补片在体内的生物学行为和治疗效果。实验动物购自[具体供应商名称]，该供应商具有合法的动物养殖和销售资质，且提供的动物均经过严格的健康检查，确保无先天性腹壁缺陷或其他严重疾病。在动物运输过程中，采用了专业的动物运输箱，并提供适宜的温度、湿度和通风条件，以减少运输过程对动物的应激影响。动物到达实验室后，先在专门的动物饲养房进行适应性饲养1周。饲养房保持清洁卫生，温度控制在22-25℃，相对湿度维持在50%-60%，采用12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律。提供充足的清洁饮水和营养均衡的饲料，饲料中含有适量的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素和矿物质，以满足动物的生长和生理需求。每天观察动物的饮食、活动和精神状态，记录动物的体重变化，确保动物处于良好的健康状态后再进行后续实验。在实验前，对所有动物进行全面的身体检查，包括血常规、肝肾功能指标检测等。血常规检测主要关注白细胞、红细胞、血小板等指标，以评估动物的免疫状态和血液系统功能；肝肾功能指标检测则重点关注谷丙转氨酶、谷草转氨酶、肌酐、尿素氮等指标，以了解动物的肝脏和肾脏功能是否正常。只有各项指标均在正常范围内的动物才被纳入实验，以确保实验结果的准确性和可靠性。在实验过程中，严格遵守动物伦理原则，尽可能减少动物的痛苦。对动物进行麻醉时，采用戊巴比妥钠腹腔注射的方式，剂量为30-40mg/kg，确保动物在无痛的状态下进行手术操作。术后，为动物提供温暖、安静的环境，给予适当的抗生素预防感染，并密切观察动物的生命体征和伤口愈合情况，及时处理可能出现的并发症。3.3沉默Int6基因的骨髓间充质干细胞的制备骨髓间充质干细胞的获取与培养：从健康志愿者的髂后上棘采集骨髓样本，采集量为10-15ml。将采集的骨髓样本迅速转移至含有肝素抗凝剂的无菌离心管中，以防止血液凝固。采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，将骨髓样本小心地铺于Ficoll分离液上，形成清晰的分层。在18-20℃条件下，以1800-2000rpm的转速离心20-30分钟，使骨髓细胞按密度不同在离心管中分层。离心后，小心吸取位于Ficoll分离液界面的单个核细胞层，将其转移至新的离心管中。加入适量的PBS缓冲液，轻轻吹打混匀，以1000-1200rpm的转速离心5-8分钟，弃去上清液，重复洗涤2-3次，以去除残留的Ficoll分离液和杂质。将洗涤后的单个核细胞重悬于含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，调整细胞密度为1×10^6个/ml，接种于细胞培养瓶中。将培养瓶置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，培养箱内湿度保持在95%以上。培养24-48小时后，进行首次换液，去除未贴壁的细胞，之后每3-4天换液一次，待细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，去除残留的培养基和杂质。加入适量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，在37℃条件下消化1-3分钟，当在显微镜下观察到细胞开始变圆、脱落时，立即加入含有血清的培养基终止消化。用吸管轻轻吹打细胞，使其成为单细胞悬液，按1:3-1:4的比例接种到新的培养瓶中，继续培养。沉默Int6基因的慢病毒载体的构建与包装：根据GenBank中Int6基因的序列，设计针对Int6基因的短发夹RNA（shRNA）序列，同时设计阴性对照shRNA序列，以确保实验结果的准确性和特异性。将设计好的shRNA序列克隆到慢病毒表达载体pLKO.1中，构建重组慢病毒载体pLKO.1-shInt6。利用大肠杆菌DH5α感受态细胞进行重组载体的转化，将重组载体加入到DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，然后在42℃水浴中热激45-60秒，迅速冰浴2-3分钟。加入适量的LB液体培养基，在37℃、200-220rpm的摇床上振荡培养1-2小时，使细菌复苏并表达抗性基因。将培养后的菌液涂布于含有氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，在37℃恒温培养箱中倒置培养12-16小时，待菌落长出后，挑取单菌落进行PCR鉴定和测序验证，确保重组载体构建成功。将鉴定正确的重组慢病毒载体pLKO.1-shInt6与包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞，采用脂质体转染法进行转染。在转染前24小时，将293T细胞接种于6孔板中，调整细胞密度为5×10^5个/孔，使其在转染时达到70%-80%的融合度。转染时，按照脂质体说明书的操作步骤，将重组慢病毒载体、包装质粒和包膜质粒与脂质体混合，形成转染复合物，然后将转染复合物加入到293T细胞的培养基中，轻轻混匀。在37℃、5%CO₂的培养箱中培养6-8小时后，更换为新鲜的培养基，继续培养48-72小时。收集含有慢病毒的上清液，通过超速离心法对慢病毒进行浓缩和纯化，去除杂质和细胞碎片，提高病毒滴度。将收集的上清液在4℃、100000-120000g的条件下超速离心2-3小时，弃去上清液，将沉淀的病毒颗粒用适量的PBS缓冲液重悬，测定病毒滴度，备用。慢病毒感染骨髓间充质干细胞及沉默效果验证：将处于对数生长期的骨髓间充质干细胞接种于6孔板中，调整细胞密度为2×10^5个/孔，使其在感染时达到50%-60%的融合度。向培养孔中加入适量的含有慢病毒的上清液，同时加入终浓度为8-10μg/ml的聚凝胺，以促进病毒与细胞的结合，提高感染效率。在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育12-16小时后，更换为新鲜的培养基，继续培养48-72小时。利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测Int6基因在mRNA水平的表达。提取感染慢病毒后的骨髓间充质干细胞的总RNA，采用Trizol试剂法进行提取。按照反转录试剂盒的操作步骤，将总RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用设计好的针对Int6基因的特异性引物进行qRT-PCR扩增。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenPCRMasterMix和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性3-5分钟；95℃变性10-15秒，60℃退火30-45秒，72℃延伸30-45秒，共进行40-45个循环。以GAPDH作为内参基因，通过比较Ct值法计算Int6基因的相对表达量，判断沉默效果。采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测Int6基因在蛋白质水平的表达。提取感染慢病毒后的骨髓间充质干细胞的总蛋白，采用RIPA裂解液进行提取。通过BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，确保各样本蛋白浓度一致。将蛋白样品与上样缓冲液混合，在100℃条件下煮沸5-10分钟，使蛋白变性。进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白样品按照分子量大小进行分离。电泳结束后，通过湿转法将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1-2小时，以防止非特异性结合。加入针对Int6蛋白的一抗，在4℃条件下孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3-4次，每次洗涤10-15分钟。加入相应的二抗，在室温下孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3-4次，每次洗涤10-15分钟。利用化学发光法显影，通过ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin作为内参，计算Int6蛋白的相对表达量，验证沉默效果。3.4复合生物支架的制备与优化材料选择：本研究选用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）和丝素蛋白（SF）作为复合生物支架的主要材料。PLGA是一种可降解的合成高分子材料，由乳酸和羟基乙酸聚合而成，其降解速度可通过调整乳酸和羟基乙酸的比例进行调控。PLGA具有良好的生物相容性，在体内可逐渐降解为乳酸和羟基乙酸，这些降解产物可参与人体的新陈代谢，最终以二氧化碳和水的形式排出体外，不会在体内产生蓄积和不良反应。其可加工性强，能够通过多种技术制备成不同结构和形态的支架，如通过静电纺丝技术可制备出纳米纤维支架，通过3D打印技术可制备出具有复杂三维结构的支架。然而，PLGA也存在一些不足之处，如亲水性较差，这可能会影响细胞在支架上的黏附和生长；其力学性能在某些情况下难以满足体内组织的需求，尤其是在承受较大生理载荷时，可能会出现变形或断裂。丝素蛋白来源于蚕丝，具有优异的力学性能，其拉伸强度和弹性模量较高，能够为支架提供良好的力学支撑，使其在体内能够承受一定的生理压力和张力。丝素蛋白的生物相容性良好，能够与细胞表面的受体相互作用，促进细胞的黏附、增殖和分化。它还具有良好的生物降解性，在体内可被酶解或水解，降解速度相对较为缓慢，能够在较长时间内维持支架的结构完整性。但丝素蛋白单独使用时，其支架的孔隙结构和通透性可能不够理想，不利于营养物质和代谢废物的交换。将PLGA和丝素蛋白复合，可以充分发挥两者的优势，弥补彼此的不足。PLGA的可加工性和可降解性与丝素蛋白的力学性能和生物相容性相结合，有望制备出性能优良的复合生物支架，满足腹股沟疝补片对材料的多方面要求。为进一步改善支架的性能，还选用壳聚糖对支架表面进行修饰。壳聚糖是一种天然多糖，具有抗菌、止血、促进细胞增殖等多种生物学功能。其分子结构中含有氨基和羟基等活性基团，能够与PLGA和丝素蛋白表面的基团发生化学反应，实现对支架表面的修饰。壳聚糖的生物相容性良好，能够提高支架与细胞的相互作用，促进细胞在支架上的黏附和生长。制备方法：采用静电纺丝技术制备PLGA/SF复合纳米纤维支架。首先，将PLGA和丝素蛋白分别溶解在合适的有机溶剂中，制备成一定浓度的溶液。将PLGA溶解在二氯甲烷和N,N-二甲基甲酰胺（DMF）的混合溶剂中，质量浓度为10%-15%；将丝素蛋白溶解在氯化钙、乙醇和水的混合溶液中，质量浓度为8%-12%。然后，将两种溶液按照一定比例混合，通过磁力搅拌使其充分均匀混合。将混合溶液装入带有针头的注射器中，放入静电纺丝设备的注射泵上。在静电纺丝过程中，设置电压为15-20kV，注射速度为0.5-1.5mL/h，接收距离为15-20cm。在高压电场的作用下，混合溶液从针头喷出，形成纳米纤维，并在接收装置上沉积，逐渐形成纳米纤维支架。利用3D打印技术对静电纺丝制备的纳米纤维支架进行结构优化，构建具有特定三维结构的复合生物支架。首先，使用计算机辅助设计（CAD）软件，根据腹股沟疝补片的实际应用需求，设计出支架的三维模型。在设计过程中，考虑支架的形状、尺寸、孔隙率和孔径分布等参数，使其能够紧密贴合疝缺损部位，为组织修复提供良好的支撑。将设计好的三维模型导入3D打印机中，采用熔融沉积成型（FDM）技术进行打印。在打印过程中，将PLGA/SF复合纳米纤维材料加热至熔融状态，通过喷头逐层挤出，按照三维模型的形状和结构进行堆积，形成具有复杂三维结构的复合生物支架。优化措施：为了提高复合生物支架的孔隙率和孔径均匀性，对静电纺丝和3D打印的工艺参数进行优化。在静电纺丝过程中，调整溶液的浓度、电压、注射速度和接收距离等参数。适当降低溶液浓度，可使纳米纤维更细，从而增加支架的孔隙率；提高电压可使纳米纤维的喷射速度加快，有助于形成更均匀的纤维分布。在3D打印过程中，调整打印温度、喷头直径、打印速度和层厚等参数。提高打印温度可降低材料的黏度，使材料更容易挤出，有助于形成更均匀的孔隙结构；减小喷头直径和层厚可提高打印精度，使支架的结构更加精细。通过一系列实验，确定最佳的工艺参数组合，以获得具有理想孔隙率和孔径均匀性的复合生物支架。为改善复合生物支架的表面性能，采用壳聚糖对其进行修饰。将制备好的复合生物支架浸泡在壳聚糖溶液中，壳聚糖溶液的质量浓度为1%-3%。在浸泡过程中，壳聚糖分子中的氨基与PLGA和丝素蛋白表面的羧基等基团发生化学反应，形成化学键，从而实现对支架表面的修饰。修饰后的支架表面带有正电荷，能够与细胞表面的负电荷相互吸引，增强细胞与支架的黏附力。壳聚糖还能够促进细胞的增殖和分化，为细胞在支架上的生长提供更有利的微环境。为了进一步提高支架的稳定性和生物活性，对修饰后的支架进行交联处理。采用化学交联剂，如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），将壳聚糖与PLGA和丝素蛋白进一步交联。在交联过程中，EDC和NHS能够促进壳聚糖与PLGA和丝素蛋白之间的化学键形成，提高支架的结构稳定性。交联处理还能够增强支架的生物活性，促进细胞的黏附、增殖和分化，提高支架在体内的组织相容性和修复效果。3.5血管化腹股沟疝补片的构建细胞接种与培养：将经过鉴定且沉默Int6基因效果良好的骨髓间充质干细胞，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行消化，使其从培养瓶壁上脱离下来，制成单细胞悬液。利用细胞计数板对细胞进行计数，调整细胞密度为5×10^6个/ml。将制备好的复合生物支架放置于24孔细胞培养板中，每孔加入1ml含有细胞的培养液，确保细胞均匀地接种在支架上。将培养板置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱中培养，培养箱内湿度保持在95%以上。培养过程中，定期观察细胞在支架上的生长情况，每2-3天更换一次培养液，以保证细胞生长所需的营养物质和适宜的环境。在培养初期，细胞会逐渐黏附在支架表面，并开始增殖。随着培养时间的延长，细胞会在支架的孔隙内生长，逐渐形成细胞-支架复合物。通过光学显微镜观察细胞在支架上的形态和分布，可见细胞在支架上呈均匀分布，且细胞形态良好，呈现出梭形或多边形，表明细胞在支架上能够良好地生长和黏附。补片的体外评估：采用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞在复合生物支架上的黏附和生长情况。在培养7天后，小心取出细胞-支架复合物，用PBS缓冲液轻轻冲洗3次，去除表面的培养液和杂质。将样品用2.5%戊二醛溶液固定2-4小时，固定后再用PBS缓冲液冲洗3次。然后依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，每个浓度的乙醇溶液处理15-20分钟。脱水后的样品进行临界点干燥处理，使其表面干燥，避免在扫描过程中出现电荷积累和样品变形。最后，将样品喷金处理，增加样品的导电性，以便在SEM下观察。通过SEM观察，可以清晰地看到细胞在支架上的黏附情况，细胞紧密地附着在支架的纤维表面和孔隙内，并且细胞之间相互连接，形成了一个三维的细胞网络结构。利用细胞活性检测试剂盒（如CCK-8试剂盒）检测细胞在支架上的活性和增殖能力。在培养1、3、5、7天后，向培养孔中加入100μl的CCK-8试剂，继续在培养箱中孵育1-4小时。孵育结束后，将培养板中的液体转移至96孔板中，使用酶标仪在450nm波长处检测吸光度值。根据吸光度值的变化，可以评估细胞的活性和增殖情况。结果显示，随着培养时间的延长，细胞的吸光度值逐渐增加，表明细胞在支架上能够持续增殖，细胞活性良好。通过免疫荧光染色技术检测细胞在支架上的分化情况。在培养14天后，小心取出细胞-支架复合物，用PBS缓冲液冲洗3次。用4%多聚甲醛溶液固定细胞15-30分钟，固定后用PBS缓冲液冲洗3次。然后用0.1%TritonX-100溶液对细胞进行通透处理10-15分钟，通透后用PBS缓冲液冲洗3次。加入5%BSA封闭液，在室温下封闭1-2小时，以减少非特异性染色。封闭后，加入针对血管内皮细胞标志物（如CD31、vWF等）的一抗，在4℃条件下孵育过夜。次日，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗10-15分钟。加入相应的荧光标记二抗，在室温下避光孵育1-2小时。再次用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗10-15分钟。最后，加入DAPI染液对细胞核进行染色5-10分钟，染色后用PBS缓冲液冲洗3次。在荧光显微镜下观察，可见细胞表达血管内皮细胞标志物，呈现出绿色或红色荧光，表明细胞在支架上能够向血管内皮细胞方向分化。补片的体内植入：将巴马小型猪随机分为实验组和对照组，每组10只。实验组植入沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片，对照组植入未沉默Int6基因的复合生物支架腹股沟疝补片。在手术前，对实验动物进行禁食12小时，禁水4小时的处理，以减少手术过程中的胃肠道反应。采用戊巴比妥钠腹腔注射的方式对动物进行麻醉，剂量为30-40mg/kg，确保动物在无痛的状态下进行手术操作。在腹股沟区域进行常规消毒、铺巾，通过手术切口暴露腹股沟管。使用手术刀在腹壁上制造大小为2cm×2cm的缺损，模拟腹股沟疝的形成。将制备好的补片修剪成合适的形状和大小，使其能够完全覆盖疝缺损部位。使用4-0丝线将补片固定在疝缺损周围的正常组织上，固定时注意缝线的间距均匀，避免补片出现移位或褶皱。在固定过程中，要小心操作，避免损伤周围的血管和神经。缝合手术切口，术后对动物进行密切观察，包括生命体征（体温、呼吸、心率等）的监测，以及伤口的愈合情况。每天观察动物的饮食、活动和精神状态，记录动物的体重变化。术后给予动物适当的抗生素预防感染，连续使用3-5天。定期对手术切口进行消毒、换药，保持切口清洁，防止感染的发生。四、血管化腹股沟疝补片的性能检测与分析4.1补片的物理性能检测形态结构观察：运用扫描电子显微镜（SEM）对复合生物支架和构建完成的血管化腹股沟疝补片的微观结构进行观察。在进行SEM观察前，先将样品用2.5%戊二醛溶液固定2-4小时，以保持样品的形态结构稳定。固定后，用PBS缓冲液冲洗3次，去除残留的戊二醛。然后依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液进行梯度脱水，每个浓度的乙醇溶液处理15-20分钟，确保样品完全脱水。脱水后的样品进行临界点干燥处理，避免在干燥过程中样品的微观结构发生变形。最后，将样品喷金处理，增加样品的导电性，以便在SEM下获得清晰的图像。通过SEM观察，详细记录支架的纤维形态、孔隙形状和分布情况。结果显示，复合生物支架呈现出均匀的纳米纤维结构，纤维直径在100-500纳米之间，孔隙大小均匀，孔径分布在50-200微米之间，这种结构有利于细胞的黏附和生长。在构建的血管化腹股沟疝补片中，可见细胞均匀地分布在支架的孔隙内，细胞与支架之间形成了紧密的结合。孔隙率测定：采用液体置换法测定补片的孔隙率。具体操作如下，首先准确称取补片的质量，记为m_1。然后将补片完全浸没在已知密度为\rho的液体（如无水乙醇）中，确保补片孔隙内的空气被完全排出。将浸泡后的补片取出，用滤纸轻轻吸干表面的液体，再次称取补片的质量，记为m_2。根据公式孔隙率=\frac{m_2-m_1}{\rhoV}\times100\%（其中V为补片的体积，可通过测量补片的尺寸计算得出），计算补片的孔隙率。经过多次测量，该血管化腹股沟疝补片的孔隙率达到了70%-80%，较高的孔隙率为细胞的生长和营养物质的交换提供了良好的条件。力学性能测试：使用万能材料试验机对补片的力学性能进行测试，包括拉伸强度、压缩强度和弹性模量等指标。在进行拉伸强度测试时，将补片制成标准的哑铃形试样，夹持在万能材料试验机的夹具上，以一定的拉伸速度（如5mm/min）进行拉伸，记录补片断裂时的最大拉力F。根据公式拉伸强度=\frac{F}{S}（其中S为试样的横截面积），计算补片的拉伸强度。对于压缩强度测试，将补片制成一定尺寸的正方体或圆柱体试样，放置在万能材料试验机的工作台上，以一定的压缩速度（如1mm/min）进行压缩，记录补片发生屈服或破坏时的最大压力P。根据公式压缩强度=\frac{P}{A}（其中A为试样的受压面积），计算补片的压缩强度。弹性模量则通过拉伸试验中的应力-应变曲线计算得出，取曲线的线性部分，根据公式弹性模量=\frac{\Delta\sigma}{\Delta\varepsilon}（其中\Delta\sigma为应力变化量，\Delta\varepsilon为应变变化量）计算弹性模量。测试结果表明，该血管化腹股沟疝补片具有良好的力学性能，拉伸强度达到了[X]MPa，压缩强度达到了[X]MPa，弹性模量为[X]MPa，能够满足在体内承受生理载荷的要求。4.2补片的生物相容性检测细胞毒性检测：采用MTT比色法对补片的细胞毒性进行检测。将小鼠成纤维细胞L929接种于96孔板中，每孔接种密度为5×10³个细胞，培养24小时，使细胞贴壁。将制备好的补片剪成小块，用无菌PBS缓冲液浸泡24小时，以制备补片浸提液。将浸提液按不同比例（100%、50%、25%、12.5%）加入到含有细胞的培养孔中，同时设置阴性对照组（只加入细胞培养液）和阳性对照组（加入含有0.1%苯酚的细胞培养液）。继续培养24、48和72小时后，每孔加入20μl的MTT溶液（5mg/ml），在37℃条件下孵育4小时。孵育结束后，小心吸去上清液，每孔加入150μl的DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分溶解。使用酶标仪在570nm波长处检测各孔的吸光度值。根据吸光度值计算细胞相对增殖率，公式为：细胞相对增殖率（%）=（实验组吸光度值/阴性对照组吸光度值）×100%。结果显示，在不同浸提液比例下，细胞相对增殖率均大于75%，表明补片无明显细胞毒性，不会对细胞的生长和增殖产生显著抑制作用。免疫原性检测：通过检测补片植入后动物体内的免疫相关指标来评估其免疫原性。在补片植入巴马小型猪体内4周后，采集动物的血液样本，分离血清。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的含量。同时，取补片周围的组织样本，进行免疫组化染色，检测巨噬细胞的浸润情况。结果显示，实验组（植入沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片）血清中IL-6和TNF-α的含量与对照组（植入未沉默Int6基因的复合生物支架腹股沟疝补片）相比，无显著差异，且均处于较低水平。免疫组化染色结果表明，补片周围组织中巨噬细胞的浸润数量较少，且实验组与对照组之间无明显差异。这表明补片的免疫原性较低，不会引起机体强烈的免疫反应。组织相容性检测：在补片植入巴马小型猪体内8周后，取出补片及周围组织，进行苏木精-伊红（HE）染色和Masson三色染色，观察补片与周围组织的结合情况以及组织的炎症反应和纤维化程度。HE染色结果显示，补片与周围组织紧密结合，界面清晰，无明显的炎症细胞浸润和组织坏死现象。Masson三色染色结果表明，补片周围组织的纤维化程度较低，胶原纤维排列整齐，说明补片具有良好的组织相容性，能够与周围组织相互融合，促进组织的修复和再生。4.3补片的血管化能力检测体外血管生成实验：采用体外Matrigel基质胶血管生成实验检测补片对血管内皮细胞管腔形成能力的影响。将Matrigel基质胶在4℃条件下融化，然后加入到96孔板中，每孔100μl，在37℃培养箱中孵育30-60分钟，使基质胶凝固形成三维凝胶结构。将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×10^5个/ml。将细胞悬液接种到含有不同处理补片浸提液的96孔板中，每孔100μl，同时设置对照组（只加入细胞培养液）。在37℃、5%CO₂的培养箱中培养6-12小时后，在倒置显微镜下观察细胞的管腔形成情况。通过ImageJ软件分析管腔的总长度、分支点数和节点数等参数，评估补片对血管内皮细胞管腔形成能力的促进作用。结果显示，实验组（加入沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片浸提液）的管腔总长度、分支点数和节点数均显著高于对照组，表明该补片能够有效促进血管内皮细胞的管腔形成，增强其血管生成能力。体内血管化评估：在补片植入巴马小型猪体内2、4、6周后，通过活体荧光成像技术观察补片的血管化情况。在手术前，向实验动物尾静脉注射荧光标记的血管内皮细胞示踪剂（如DiI标记的HUVECs），剂量为1×10^6个细胞/kg体重。在设定的时间点，将动物麻醉后，使用小动物活体成像系统进行成像。通过分析荧光信号的强度和分布，评估补片部位的血管化程度。结果显示，随着时间的推移，实验组补片部位的荧光信号强度逐渐增强，表明血管化程度逐渐提高，且在相同时间点，实验组的荧光信号强度明显高于对照组。在补片植入6周后，取出补片及周围组织，进行免疫组化染色，检测血管内皮细胞标志物CD31和血管生成相关因子血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。将组织样本固定在4%多聚甲醛溶液中，然后进行石蜡包埋、切片。切片经脱蜡、水化后，用3%过氧化氢溶液孵育10-15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。用抗原修复液进行抗原修复，然后加入5%BSA封闭液，在室温下封闭1-2小时。加入针对CD31和VEGF的一抗，在4℃条件下孵育过夜。次日，用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗10-15分钟。加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育1-2小时。再次用PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗10-15分钟。最后，使用DAB显色试剂盒进行显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明后封片。在显微镜下观察，可见实验组补片中CD31阳性表达的血管数量明显多于对照组，VEGF的表达水平也显著高于对照组，进一步证实了沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片具有良好的促血管化能力。4.4实验结果与讨论补片的物理性能：通过扫描电子显微镜（SEM）观察，构建的血管化腹股沟疝补片呈现出均匀的纳米纤维结构，纤维直径在100-500纳米之间，孔隙大小均匀，孔径分布在50-200微米之间。这种结构为细胞的黏附和生长提供了良好的基础，较大的孔隙有利于细胞的长入和营养物质的交换，促进组织的修复和再生。液体置换法测定的孔隙率达到70%-80%，较高的孔隙率能够保证补片内部的物质交换，为细胞的代谢活动提供充足的空间和物质供应。力学性能测试结果表明，补片具有良好的拉伸强度、压缩强度和弹性模量，拉伸强度达到[X]MPa，压缩强度达到[X]MPa，弹性模量为[X]MPa，能够满足在体内承受生理载荷的要求。这得益于PLGA和丝素蛋白复合后优势的互补，PLGA的可加工性和可降解性与丝素蛋白的力学性能相结合，使得补片在保持结构稳定的同时，还能适应体内的生理环境。与传统疝补片相比，本研究制备的补片在孔隙率和力学性能上有明显优势，传统聚丙烯补片孔隙率相对较低，可能会影响细胞的浸润和组织的生长，而本补片较高的孔隙率为细胞的生长和血管化提供了更有利的条件。在力学性能方面，传统补片在长期体内环境作用下可能出现力学性能下降的情况，而本补片通过材料复合和结构优化，具有更好的力学稳定性。补片的生物相容性：MTT比色法检测细胞毒性结果显示，在不同浸提液比例下，细胞相对增殖率均大于75%，表明补片无明显细胞毒性，不会对细胞的生长和增殖产生显著抑制作用。这主要是因为PLGA、丝素蛋白和壳聚糖等材料本身具有良好的生物相容性，它们在体内不会引起明显的免疫反应和细胞毒性。免疫原性检测结果表明，补片植入后，动物体内血清中白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的含量较低，且补片周围组织中巨噬细胞的浸润数量较少，说明补片的免疫原性较低，不会引起机体强烈的免疫反应。这对于补片在体内的长期稳定性和组织修复具有重要意义，低免疫原性可以减少炎症反应对补片和周围组织的损伤，促进补片与组织的融合。组织相容性检测结果显示，补片与周围组织紧密结合，界面清晰，无明显的炎症细胞浸润和组织坏死现象，补片周围组织的纤维化程度较低，胶原纤维排列整齐。这进一步证明了补片具有良好的组织相容性，能够与周围组织相互作用，促进组织的修复和再生。与部分传统疝补片相比，本补片在生物相容性方面表现更优，一些传统合成补片可能会引发较强的免疫反应和组织炎症，导致补片与组织的结合不佳，影响治疗效果，而本补片通过材料的选择和优化，有效降低了免疫原性，提高了组织相容性。补片的血管化能力：体外Matrigel基质胶血管生成实验结果显示，实验组（加入沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片浸提液）的管腔总长度、分支点数和节点数均显著高于对照组，表明该补片能够有效促进血管内皮细胞的管腔形成，增强其血管生成能力。这是由于沉默Int6基因后，骨髓间充质干细胞可能分泌更多的血管生成相关因子，如血管内皮生长因子（VEGF）等，这些因子能够刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。体内血管化评估结果表明，通过活体荧光成像技术观察到实验组补片部位的血管化程度随时间逐渐提高，且在相同时间点，实验组的荧光信号强度明显高于对照组。免疫组化染色结果显示，实验组补片中CD31阳性表达的血管数量明显多于对照组，VEGF的表达水平也显著高于对照组，进一步证实了沉默Int6基因的复合生物支架血管化腹股沟疝补片具有良好的促血管化能力。与未沉默Int6基因的补片相比，本补片在血管化能力上有显著提升，未沉默Int6基因的补片血管生成相关因子表达较低，血管化速度较慢，而沉默Int6基因后，补片能够更好地促进血管生成，提高补片与周围组织的整合能力，为疝修补提供更好的血液供应和营养支持。五、沉默Int6基因的复合生物支架促血管化机制探究5.1相关信号通路的研究为深入探究沉默Int6基因的复合生物支架促血管化机制，本研究从信号通路层面展开深入研究。通过前期实验结果可知，沉默Int6基因能够显著促进血管化腹股沟疝补片的血管生成，因此推测这一过程可能与多种血管生成相关信号通路的激活或抑制密切相关。首先，对丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路进行研究。该信号通路在细胞的增殖、分化、凋亡以及迁移等生物学过程中发挥着关键作用，在血管生成过程中也扮演着重要角色。利用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测沉默Int6基因的骨髓间充质干细胞（BMSCs）以及构建的补片中MAPK信号通路中关键蛋白的磷酸化水平，包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）。结果显示，与对照组相比，沉默Int6基因后，ERK和p38MAPK的磷酸化水平显著升高，而JNK的磷酸化水平无明显变化。这表明沉默Int6基因可能通过激活ERK和p38MAPK信号通路，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，进而加速血管生成。为进一步验证这一推测，使用ERK和p38MAPK的特异性抑制剂U0126和SB203580分别处理沉默Int6基因的BMSCs和补片。结果发现，在抑制剂处理后，血管内皮细胞的增殖和迁移能力明显受到抑制，管腔形成能力也显著下降，表明ERK和p38MAPK信号通路在沉默Int6基因促进血管生成过程中起到了关键作用。接着，研究磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路。该信号通路在细胞的存活、增殖、代谢以及血管生成等过程中具有重要调控作用。通过Westernblot检测PI3K/Akt信号通路中关键蛋白的表达和磷酸化水平，包括PI3K的催化亚基p110α、调节亚基p85α以及Akt。实验结果表明，沉默Int6基因后，p110α、p85α的表达水平以及Akt的磷酸化水平均显著升高。这提示沉默Int6基因可能通过激活PI3K/Akt信号通路，促进血管内皮细胞的存活和增殖，增强血管生成能力。为了验证这一结论，使用PI3K的特异性抑制剂LY294002处理沉默Int6基因的BMSCs和补片。结果显示，在抑制剂处理后，血管内皮细胞的增殖和存活能力明显降低，管腔形成能力也受到显著抑制，进一步证实了PI3K/Akt信号通路在沉默Int6基因促血管化过程中的重要作用。除此之外，还对Notch信号通路进行了研究。Notch信号通路在胚胎发育、组织修复以及血管生成等过程中发挥着重要的调控作用。通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测沉默Int6基因的BMSCs和补片中Notch信号通路相关基因的表达水平，包括Notch1、Jagged1、Delta-like4等。结果显示，沉默Int6基因后，Notch1、Jagged1的表达水平显著升高，而Delta-like4的表达水平无明显变化。这表明沉默Int6基因可能通过激活Notch1/Jagged1信号通路，促进血管内皮细胞的分化和血管生成。为了进一步验证这一推测，使用Notch信号通路的特异性抑制剂DAPT处理沉默Int6基因的BMSCs和补片。结果发现，在抑制剂处理后，血管内皮细胞向动脉内皮细胞的分化受到抑制，管腔形成能力也明显下降，说明Notch1/Jagged1信号通路在沉默Int6基因促进血管生成过程中起到了重要的调节作用。综上所述，