《生物成分的分离与测定技术》学习要点

2/4第一节生物成分的分离与测定技术学习目标1.掌握电泳法分离大分子的原理。2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。3.了解芳香油的特点，知道提取芳香油的原理及会设计简单的实验装置进行提取。学习重、难点重点1.掌握电泳法分离大分子的原理。2.运用常用的方法提取和分离蛋白质。3.了解芳香油的特点，知道提取芳香油的原理及会设计简单的实验装置进行提取。难点运用常用的方法提取和分离蛋白质。学习要点梳理一、蛋白质的分离方法1.薄膜透析法：（1）原理：蛋白质水溶液具有亲水胶体溶液性质，不能透过半透膜。（2）目的：去除小分子化合物杂质，如无机盐、单糖、二糖、氨基酸等。（3）常用的半透膜：肠衣、玻璃纸等。（4）步骤：将待纯化的蛋白质溶液装入透析袋内，再把透析袋放入透析液中即可。2.离心沉降法：（1）原理：在离心力的作用下，分子大小、密度不同的分子沉降速度不同，从而被分离。（2）目的：使分子大小、密度不同的不同种类的蛋白质彼此分离。3.电泳：（1）概念：带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动的现象。（2）原理：不同的物质所带电荷不同，颗粒的大小、性状不同，因此，在电场中的泳动速度不同。（3）影响泳动速度的因素：带电颗粒的性质，即颗粒的大小、形状和所带电荷的多少；此外还有电场强度、溶液的pH等因素。（4）泳动规律：带电颗粒直径越小，越接近于球形，所带静电荷越多，则在电场中的泳动速度越快；反之，则越慢。（5）常用方法：支持物电泳。（6）支持物：滤纸、醋酸纤维薄膜、大分子凝胶等。思维拓展琼脂凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法优势（1）琼脂凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。（2）测定蛋白质的相对分子质量常用聚丙烯酰胺凝胶电泳，这是因为在一定浓度范围内，聚丙烯酰胺对热稳定性强，可以用检测仪直接测定。二、血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳1.特点（1）电泳后区带界限清晰。（2）通电时间较短（60min~90min）。（3）它对各种蛋白质都几乎完全不吸附，因此无拖尾现象。（4）对染料也没有吸附，因此不结合的染料能完全洗掉，无样品处几乎完全无色。2.关键步骤及其技术要求：点样是本实验的关键步骤。点样前，应将薄膜表面多余的缓冲液用滤纸吸去，以免引起样品扩散；但不宜太干，否则样品不易进入膜内，造成点样起始参差不齐，影响分离效果。3.结果及其分析：（1）结果：（2）结果分析：从电泳图谱示意图中可以看出：①血清蛋白主要包括五种蛋白质，且含量最多的是清蛋白，其他依次是：γ-球蛋白＞α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β-球蛋白。②由五种蛋白质所处的位置可判断出它们均带负电荷，四种球蛋白在电场中的泳动速度由快到慢依次为α1-球蛋白＞α2-球蛋白＞β-球蛋白＞γ-球蛋白。思维拓展醋酸纤维薄膜电泳所具有的优点：简单、快速、分离清晰、灵敏度高、样品用量少、没有吸附现象，电泳后区带界限清晰等。三、橘皮精油提取实验装置、操作及注意事项1.蒸馏装置如图所示，整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收冷凝后的蒸馏物。（1）加热装置：包括铁架台、酒精灯、铁圈、石棉网、蒸馏烧瓶、铁夹、单孔塞及温度计。①温度计装置：温度计水银球应与蒸馏烧瓶的支管口下保持水平；②加热时要防爆沸：垫石棉网，向液体中加入几片碎石或瓷片；③烧瓶内液体量：烧瓶容积的1/3~2/3.（2）冷凝装置：由铁架台和冷凝管组成，冷凝管中水流应从下方进水，上方出水，与蒸汽流向相反。（3）接收装置：由接液管和接收器（通常用锥形瓶）组成，收集冷凝后的液体。2.具体实验操作：安装仪器一般都按照自上而下、自左而右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下：（1）固定热源——酒精灯。（2）固定蒸馏瓶，保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。（4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。（5）连接接液管。（6）将接收瓶瓶口对准接液管出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接收器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。（7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处于同一水平线上。易错提醒（1）用蒸馏法分离植物有效成分时，温度会影响植物成分的性质，因此需要严格控制温度，温度过高会破坏植物成分的结构，温度过低则会导致分离不出植