2025年细胞工程制药试题及答案

2025年细胞工程制药试题及答案一、单项选择题（每题1分，共20分）1.在CHO细胞中实现人源化单克隆抗体高表达时，最优先考虑的基因扩增系统是A.DHFR/MTX系统B.GS/MSX系统C.谷氨酰胺合成酶系统D.嘌呤霉素抗性系统答案：A。DHFR/MTX系统可通过梯度加压获得上千拷贝的抗体基因，CHO细胞本身DHFR缺陷，背景低，扩增效率高。2.用于诱导iPSC向胰岛β细胞分化的关键转录因子组合是A.PDX1、MAFA、NGN3B.SOX2、KLF4、C-MYCC.GATA4、TBX5、MESP1D.OCT4、NANOG、LIN28答案：A。PDX1决定胰腺命运，NGN3触发内分泌祖细胞程序，MAFA促进β细胞成熟。3.在慢病毒载体生产中，对VSV-G包膜蛋白进行瞬时表达时，最常用的转染试剂是A.PEI-MAXB.Lipofectamine3000C.CaCl₂-DNA共沉淀D.电穿孔答案：A。PEI-MAX成本低、可放大至200L转瓶，病毒滴度可达1×10⁸TU/mL以上。4.下列哪项不是CRISPR-Cas9敲除细胞系后必须进行的脱靶评估实验A.T7E1酶切B.全基因组测序C.靶向深度测序D.预测软件Off-Spotter分析答案：A。T7E1仅检测靶位点突变率，不用于脱靶评估。5.在生物反应器放大过程中，若保持P/V（单位体积功率）不变，则从10L放大至1000L时，搅拌桨叶尖速度应A.增加3.2倍B.减少至0.46倍C.保持不变D.增加10倍答案：B。根据P/V∝(NDᵢ)³，体积增加100倍，Dᵢ增加4.64倍，故N需降至0.46倍。6.用于检测细胞培养中支原体污染的金标准方法是A.荧光Hoechst染色B.PCR-荧光探针法C.培养法（肉汤+琼脂）D.扫描电镜答案：C。尽管耗时28天，但法规（EP2.6.7）仍将其列为仲裁方法。7.在CAR-T细胞制备中，CD3/CD28磁珠与细胞分离最常用的方式是A.胰酶消化B.EDTA螯合C.强磁铁吸附+旋晃洗脱D.流式分选答案：C。强磁铁吸附后，旋晃洗脱可在15min内去除>99%磁珠，且不影响T细胞活性。8.下列哪种培养基添加剂可有效抑制CHO细胞凋亡并提高抗体半乳糖基化水平A.丁酸钠B.白藜芦醇C.丙戊酸D.半乳糖+尿苷答案：D。半乳糖提供底物，尿苷补充UDP-半乳糖池，提高G2糖型比例。9.在细胞系建库过程中，主细胞库（MCB）与工作细胞库（WCB）的遗传一致性检测不包括A.短串联重复（STR）图谱B.外源因子检测C.全外显子测序D.核型分析答案：C。WES成本过高且非法规强制，仅用于研究级深度表征。10.用于封闭细胞治疗产品冷链运输的-80℃冻存液，其最优DMSO浓度为A.2%B.5%C.10%D.15%答案：B。5%DMSO+5%HSA+90%Plasma-LyteA，复苏后活率>90%，且降低DMSO相关毒性。11.在基因编辑敲入实验中，当供体模板为ssODN时，其最佳长度为A.40-60ntB.80-120ntC.200-400ntD.>1000nt答案：B。80-120nt可在同源臂与突变位点间取得平衡，敲入效率>30%。12.下列哪项不是细胞微载体培养的优点A.可实现锚地依赖型细胞的高密度B.易于实现灌流培养C.降低剪切损伤D.简化下游纯化答案：D。微载体需裂解或酶解分离，反而增加纯化步骤。13.在iPSC基因编辑中，使用电转比化学转染可提高A.单细胞克隆率B.同源重组效率C.细胞活率D.脱靶率答案：B。电转使Cas9-sgRNA核内浓度瞬间升高，HR效率提升2-3倍。14.用于定量检测单克隆抗体电荷异构体的技术是A.cIEFB.CE-SDSC.HPAEC-PADD.SEC-MALS答案：A。cIEF分辨率可达0.01pI单位，可区分主峰与酸性/碱性变异体。15.在细胞工厂（10层）培养中，最不易均匀化的参数是A.pHB.溶氧C.温度D.葡萄糖答案：B。溶氧受液面深度影响，底层与顶层可差30%以上，需微泡分布器。16.下列哪种病毒载体对插入片段大小最敏感A.AAVB.慢病毒C.腺病毒D.逆转录病毒答案：A。AAV包装上限4.7kb，超过则滴度指数下降。17.在细胞培养中，若乳酸>4g/L，则最优先的代谢干预策略是A.降低培养温度至30℃B.切换为谷氨酰胺替代物（如Gln-GLC）C.增加灌流速率D.加入丙酮酸答案：B。谷氨酰胺限制可减少乳酸生成，糖酵解通量下降30-50%。18.用于检测CAR-T细胞体外杀伤效力的效靶比（E:T）梯度设计通常为A.10:1、5:1、1:1B.5:1、1:1、0.2:1C.1:1、0.5:1、0.1:1D.0.3:1、0.1:1、0.03:1答案：D。低E:T可放大差异，更贴近体内肿瘤微环境。19.在细胞株开发中，采用pool-to-clone策略时，pool阶段的主要目的是A.快速获得克级蛋白B.降低拷贝数异质性C.提前锁定最优表达载体D.减少单克隆筛选工作量答案：A。pool可在4周内提供1-5g蛋白，支持早期毒理与制剂研究。20.下列哪项不是细胞治疗产品放行检测的强制性项目A.无菌B.支原体C.端粒长度D.细胞活率答案：C。端粒长度为研究级指标，非法规强制。二、多项选择题（每题2分，共20分）21.关于CRISPR-Cas12a系统，下列说法正确的是A.仅需crRNA即可靶向B.产生黏性末端C.脱靶率低于Cas9D.可识别PAM序列为5'-TTTV-3'答案：A、B、C、D。Cas12a为Ⅴ型系统，切割错位产生5'突出，PAM松弛，脱靶低。22.在生物反应器放大中，常数k_La与下列哪些因素正相关A.搅拌转速B.气体表观流速C.培养液黏度D.微泡直径答案：A、B。k_La∝(P/V)^0.7(V_s)^0.6，黏度增加降低k_La，微泡减小则k_La增大但选项未区分方向。23.用于提高外源蛋白可溶性表达的策略包括A.共表达分子伴侣GroEL/ESB.降低诱导温度至25℃C.融合MBP标签D.使用SUMO蛋白酶切位点答案：A、B、C、D。低温减慢折叠速率，MBP与SUMO均增加溶解度。24.在iPSC-CM（心肌细胞）冻存中，可显著降低冰晶损伤的添加剂有A.海藻糖B.乙二醇C.聚乙烯吡咯烷酮D.二甲基亚砜答案：A、B、D。海藻糖非渗透性保护细胞膜，乙二醇毒性低于DMSO。25.关于微载体培养Vero细胞制备狂犬疫苗，下列操作正确的是A.使用Cytodex-1，浓度2g/LB.灌流速率1RV/dC.感染MOI0.01D.病毒收获时加入0.5%人血白蛋白保护毒价答案：A、B、C、D。低MOI延长复制周期，提高病毒比产率；白蛋白减少剪切失活。26.在CAR-T质检中，采用流式检测CD3+CAR+比例时，需设置的荧光通道包括A.FITC-CD3B.PE-CAR独特型抗体C.APC-CD45D.PerCP-7AAD答案：A、B、C、D。7AAD排除死细胞，CD45圈选白细胞。27.下列属于细胞治疗产品运输验证必须涵盖的极端条件A.延迟48hB.温度偏移至-95℃C.跌落测试1.2mD.振动4h（5-50Hz）答案：A、C、D。-95℃超出常规干冰范围，非强制。28.在抗体Fc工程改造中，可延长半衰期的突变位点有A.M252YB.S254TC.T256ED.N434A答案：A、B、C、D。YTE与LS突变均增强FcRn结合，pH6.0亲和提高10倍。29.关于细胞系基因稳定性评估，下列检测手段组合合理的是A.核型+STR+FISHB.全基因组测序+RNA-seqC.外显子测序+数字PCRD.比较基因组杂交（CGH）+qPCR答案：A、C、D。RNA-seq反映表达水平，不直接测基因拷贝。30.在干细胞诱导过程中，小分子CHIR99021的作用包括A.激活Wnt-β-cateninB.抑制GSK3βC.促进中胚层分化D.维持多能性答案：A、B、C。CHIR为GSK3β抑制剂，激活Wnt，推动中胚层命运。三、判断题（每题1分，共10分）31.使用CRISPR-Cas9进行基因敲除时，NHEJ修复途径必然导致移码突变。答案：错。NHEJ也可产生in-frameindel，未必移码。32.在灌流培养中，细胞截留设备为ATF时，滤膜孔径50kDa可防止抗体流失。答案：错。抗体150kDa，50kDa膜会截留，需0.2µm或0.65µm微滤。33.细胞冻存时，降温速率-1℃/min适用于所有哺乳动物细胞。答案：错。造血干细胞需-3℃/min，iPSC需-0.5℃/min。34.慢病毒包装质粒psPAX2提供Rev蛋白。答案：错。Rev由pRSV-Rev单独提供，psPAX2含gag/pol/tat。35.在抗体纯化中，ProteinA亲和层析后，用pH3.5柠檬酸洗脱会显著增加聚体。答案：对。低pH诱导疏水暴露，需立即中和至pH5.0。36.细胞治疗产品放行时，若无菌检查14天未长菌，即可判定无菌。答案：错。法规要求14天+7天观察，共21天。37.使用T175培养瓶进行MSCs扩增时，最大接种密度不应超过1×10⁴cells/cm²。答案：错。MSCs可高至5×10⁴cells/cm²，但需每日换液。38.在iPSC基因编辑中，单链模板(ssODN)的PAM远端同源臂应≥40nt。答案：对。远端臂长可提高HR效率，近端可短至30nt。39.微载体培养中，搅拌转速>80rpm会导致Vero细胞脱落。答案：对。Vero对剪切敏感，通常维持40-60rpm。40.细胞株亚克隆过程中，若使用有限稀释法，每孔0.5个细胞可确保>90%单克隆率。答案：错。需0.3个/孔，泊松分布计算单克隆率仅78%，需图像验证。四、填空题（每空1分，共20分）41.在CHO细胞中，抗体岩藻糖基化缺失突变______（基因名）可使ADCC提高50-100倍。答案：FUT8。42.用于iPSC无饲养层培养的基质蛋白E8配方包含VTN-N、______、______、______。答案：bFGF、TGFβ、胰岛素。43.在细胞冻存液中，DMSO的终浓度为______%，复苏后需______倍体积稀释去除。答案：5-10，10。44.慢病毒转导T细胞时，常用促转导添加剂______，工作浓度______μg/mL。答案：Retronectin，10。45.细胞培养中，若溶氧低于______%，则抗体半乳糖基化水平下降。答案：20。46.在生物反应器中，k_La单位是______。答案：h⁻¹。47.用于检测CAR-T细胞复制性衰老的端粒长度试剂盒采用______法。答案：qPCR（relativeT/Sratio）。48.细胞株稳定性研究中，体外传代极限为______PDL。答案：60。49.在微载体培养中，Cytodex-3表面包被的胶原类型为______。答案：I型。50.抗体纯化后，病毒灭活步骤常用______pH______维持______小时。答案：pH3.5，1。51.用于封闭细胞治疗产品运输的冻存盒，其降温速率为______℃/min。答案：-1。52.在基因编辑中，ssODN模板5'端磷酸化可提高______效率。答案：敲入。53.细胞治疗产品标签需包含______、______、______三项最小信息。答案：产品名称、批号、有效期。54.用于诱导iPSC向神经嵴分化的双SMAD抑制剂为______和______。答案：SB431542、DMH1。55.在灌流培养中，ATF系统的剪切速率低于______s⁻¹。答案：3000。五、简答题（每题8分，共40分）56.阐述在CHO细胞中利用CRISPR-Cas9实现FUT8基因敲除的完整流程，包括sgRNA设计、供体模板选择、筛选策略及效率评估。答案：1)sgRNA设计：在FUT8外显子3选取5'-GGCCGAGTACCGCATCGCAG-3'，PAM为TGG，脱靶预测Off-Spotter评分<0.5。2)供体模板：采用ssODN（120nt），引入两个终止密码子TAGTAA及BamHI位点，同源臂各60nt。3)转染：CHO-K12×10⁶cells，电转条件200V、1ms、1pulse，Cas9-sgRNARNP5µg，ssODN10µg。4)筛选：有限稀释单克隆，PCR扩增外显子3，BamHI酶切阳性克隆产生160+240bp片段，测序确认双终止密码子。5)效率评估：T7E1检测突变率68%，测序显示32%为双等位基因敲除；Westernblot验证FUT8蛋白完全缺失；凝集素Lensculinarisagglutinin（LCA）blot证实核心岩藻糖缺失；ADCC实验显示活性提高120倍。57.说明在iPSC向心肌细胞分化过程中，如何通过代谢筛选获得高纯度心室样心肌细胞，并列举关键标志物。答案：1)分化第6天起，采用乳酸筛选（4mMglucose-freemedium+10mMlactate），非心肌细胞因无法利用乳酸而凋亡。2)第10天流式分选，采用CD172a（SIRPA）+/CD90-圈选心肌细胞，纯度>95%。3)心室样细胞特征：MLC2v+/MLC2a-、IRX4+、HEY2+、HAND1-；动作电位呈典型心室样，APD90>300ms；钙瞬变衰减时间常数τ>200ms。4)代谢特征：线粒体膜电位TMRE高、OCR/ECAR>5；脂肪酸氧化抑制剂Etomoxir可降低收缩频率<20%，证实成熟氧化表型。58.描述在慢病毒载体大规模生产中，采用悬浮HEK293T系统的关键工艺参数及在线监控策略。答案：1)培养基：无血清SFM4Transfx-293+4mML-Gln+0.1%PluronicF68，初始密度1×10⁶cells/mL。2)转染：PEI-MAX1:2（w/w）DNA，比例质粒gag/pol:rev:env:transfer=3:1:1:4，DNA总量1µg/10⁶cells。3)参数：pH7.1±0.05，DO40%，温度37℃，搅拌80rpm，k_La15h⁻¹。4)在线监控：采用Raman探头实时监测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺；电容法（AberFutura）测活细胞密度；尾气CO₂红外分析计算OUR，间接反映病毒产率。5)收获：转染后48h，ATFTFF截留0.2µm，灌流速率1RV/d，持续72h，最终滴度1.5×10⁹TU/mL，比活2×10⁴TU/cell。59.阐述在CAR-T细胞制备中，如何采用CliniMACSProdigy系统实现全封闭自动化，并比较其与手工工艺的优势。答案：1)流程：白细胞采集→T细胞富集（CD3/CD28磁珠）→激活→病毒转导→扩增→收获→制剂→质控，全程在Prodigy封闭管路完成。2)关键参数：磁珠与细胞比例3:1，病毒MOI5，IL-2300IU/mL，扩增7天，终密度2×10⁶cells/mL，总量可达2×10⁹cells。3)优势：封闭系统降低污染风险100倍；人工操作时间由手工36h降至4h；批次间CV<10%；减少洁净区占用面积70%；符合GMPAnnex12025版要求。4)劣势：设备成本高（$400k），耗材$15k/批次；灵活性差，无法并行多产品。60.说明在抗体药物偶联物（ADC）开发中，如何利用细胞工程实现定点偶联，并评价其均一性。答案：1)工程细胞：CHO细胞中引入两个pAcF（对乙酰苯丙氨酸）tRNA/RS突变体，在重链A114位插入pAcF。2)发酵：在表达第3天加入1mMpAcF，持续72h，抗体产量1.5g/L。3)偶联：羟胺-肟连接子-毒素（vc-MMAE）与pAcF酮基反应，pH5.5、37℃、12h，DAR（药物抗体比）=2.0±0.05。4)均一性：疏水层析（HIC）单峰面积>98%；质谱轻链无偶联，重链+1200Da，证实位点特异；体外细胞毒实验IC50比随机偶联降低3倍，体内肿瘤抑制率提高40%。六、综合设计题（共50分）61.某生物制药公司拟开发一款双特异性抗体（BsAb）靶向C