DB15∕T 3551-2024 呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程

ICS65.020.30

CCSB44

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3551—2024

呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程

TechnicalcodeofgermplasmresourcescryopreservationonHulunbeier

sheep

2024-07-15发布2024-08-15实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3551—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：中国科学院东北地理与农业生态研究所、吉林农业大学、内蒙古自治区农牧业科

学院、中国科学院西北高原生物研究所、赤峰学院。

本文件主要起草人：房义、薛树媛、杨其恩、李九月、莫显红、贾功雪、冯春涛、钟荣珍、郭晓飞、

毕江华。

I

DB15/T3551—2024

呼伦贝尔羊种质资源冷冻保存技术规程

1范围

本文件规定了呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻解冻液制备、低温平衡、冷冻、贮存及解冻

技术要点。

本文件适用于呼伦贝尔羊精液、卵母细胞和胚胎的冷冻保存。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T26613呼伦贝尔羊

NY/T1674牛羊胚胎质量检测技术规程

DB15/T1769绵羊冷冻精液

DB15/T3401奶绵羊胚胎冷冻解冻技术规程

3术语和定义

GB/T26613界定的以及下列术语和定义适用于本文件。

开放式拉长细管openpulledstraw

卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻保存的容器。

胚胎保存液holding

用于胚胎体外发育的一种商品化溶液。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）

COCs：卵丘卵母细胞复合体（Cumulus-OocyteComplexes）

DMSO：二甲基亚砜（DimethylSulfoxide）

EG：乙二醇（EthyleneGlycol）

FBS：胎牛血清（FetalBovineSerum）

OPS：开放式拉长细管（OpenPulledStraw）

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DB15/T3551—2024

PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSolution）

TS：玻璃化解冻液（ThawingSolution）

VS：玻璃化冷冻液（VitrifiedSolution）

5精液冷冻保存

冷冻稀释液配制

按照附录A中表A.1规定的配方配制。

标记

按照DB15/T1769的规定执行。

精液要求

精子活力≥70%、密度≥0.8×109个/mL、畸形率≤15%，颜色为乳白色。

精液处理

原精液用PBS稀释5倍，缓慢搅拌，孵育5min，以600rpm离心10min，移除上清液。

稀释和平衡

离心处理后的精子，用I液稀释至2×108个/毫升，在4℃冰箱平衡2h后，再用等体积II液稀释至1

×108个/毫升，再平衡1.5h。

装管

在4℃条件下，将精液分装到0.25mL细管中，另一端封口。

冷冻

5.7.1程序化冷冻

利用程序冷冻仪，在4℃～-35℃温区，设置6℃/min的降温速率；在-35℃～-100℃的温区，

设置20℃/min的降温速率，然后投入液氮。

5.7.2熏蒸冷冻

将液氮倒入深度50cm以上的泡沫箱预冷10min，细管铺放在支架后放入泡沫箱，支架平面距离液

氮面4cm，熏蒸7min，然后投入液氮。

贮存

冻精细管以25支或50支包装单位投入液氮罐。

解冻

取出冻精细管，室温空气浴5s，然后放置于40℃水浴10s取出，无菌纸巾擦干备用。

6卵母细胞冷冻保存

2

DB15/T3551—2024

冷冻方法

OPS法。

卵母细胞选择

挑选至少有3层卵丘颗粒细胞的COCs，体外成熟24h后，在含0.1%（w/v）透明质酸酶中消化，去除

卵丘颗粒细胞，挑选胞质均匀、折光性好、排出第一极体的裸卵。

试剂与溶液

按照附录A中表A.2规定的配方配制。

冷冻

6.4.1OPS制备

将0.25mL细管加热变软后拉成为管壁内径为0.2mm，管壁厚0.02mm的OPS管，冷却后用手术刀片

在其细端切开，细端长度约2cm。

6.4.2冻前准备

玻璃化冷冻液及使用器材在室温25℃至少预热30min，在培养皿中制作100μL～200μL的VS1和

VS2液滴。保温杯倒入液氮，15ml离心管壁扎眼儿、贴标签、记录羊只信息、卵母细胞质量和数量、日

期等，放入保温杯中，用于OPS的收集。

6.4.3冷冻

将卵母细胞在VS1液中平衡30s，再移入VS2液中平衡不超过25s，将多枚卵母细胞及少量VS2吸入

OPS中，投入液氮保存。

解冻

6.5.1准备

解冻液及使用器材在室温25℃至少预热30min。在一个培养皿中加入2ml的TS1液，在另一个培养

皿中分别制作200μLTS1、TS2、TS3解冻液微滴，置于37℃恒温台上，至少预热10min。

6.5.2解冻

取出OPS，迅速插入盛有TS1的培养皿中，排出卵母细胞并计时。将卵母细胞移入TS1微滴孵育1min，

然后移入TS2微滴孵育5min，再移入TS3微滴孵育5min，将卵母细胞在培养液中洗涤3～5次，置于二氧

化碳培养箱中复苏0.5h～2h，备用。

7胚胎冷冻保存

冷冻方法

程序冷冻仪法。

胚胎选择

选择1、2级桑葚胚至扩张囊胚，胚胎质量鉴定按照NY/T1674的规定执行。

3

DB15/T3551—2024

溶液配置

按照附录A中表A.3规定的配方配制。

标记

按照DB15/T3401的规定执行。

胚胎回收

回收到装有胚胎保存液并编号的平皿中。

洗涤

胚胎在胚胎保存液滴中洗4次，放入做好标记的平皿中，30min内必须开始冷冻。

平衡

胚胎在S1和S2液中平衡5min，在1.5M乙二醇中平衡10min。

冷冻

按照DB15/T3401的规定执行。

贮存

将细管装入相应的拇指管内，放入液氮罐中保存。

解冻

胚胎细管从液氮中取出，空气浴2s～3s后，放入32℃水浴10s。把胚胎放入T液中平衡5min，

然后把胚胎移入胚胎保存液平衡5min，并洗3次，备用。

4

DB15/T3551—2024

A

A

附录A

（资料性）

种质资源冷冻保存溶液配方

A.1精液冷冻保存溶液配方见表A.1。

表A.1精液冷冻保存溶液配方

种质资源溶液名称配方

超纯水80ml、葡萄糖2.80g、柠檬酸钠2.0g、卵黄20ml、

冷冻保存稀释液I液

精液青霉素10万单位、链霉素10万单位

冷冻保存稀释液II液I液45ml、甘油5ml

A.2卵母细胞冷冻保存溶液配方见表A.2。

表A.2卵母细胞冷冻保存溶液配方

种质资源溶液名称配方

DPBS100ml、3.6mg丙酮酸钠、0.1g葡萄糖、0.3g牛血清白

mPBS液

基础液蛋白

FS液含有0.3g/ml聚蔗糖、0.17g/ml蔗糖的mPBS

含7.5%（v/v）乙二醇、7.5%（v/v）二甲基亚砜、20%（v/v）

VS1

胎牛血清的mPBS

冷冻液

卵母细胞含15%（v/v）乙二醇、15%（v/v）二甲基亚砜、20%（v/v）胎

VS2

牛血清的mPBS

TS1含0.34g/ml蔗糖的mPBS

解冻液TS2含0.17g/ml蔗糖的mPBS

TS3含0.085g/ml蔗糖的mPBS

卵母细胞培养液