高效液相色谱-原子荧光光谱联用技术和电感耦合等离子体质谱技术检测鸡蛋中甲基汞含量的比较分析

目录1 材料与方法 51.1 材料与仪器 51.1.1 试剂材料 51.1.2 仪器 51.2 方法 51.2.1 试剂配制 51.2.2 标准曲线的制作 61.2.3 样品前处理 61.2.4 加标样品前处理 61.2.5 色谱条件 71.2.6 试样溶液的测定 71.2.7 数据分析 72 结果与讨论 72.1 试样测定前仪器的处理 72.2 试样测定后的数据分析 72.2.1 HPLC-AFS和ICP-MS的标准曲线和检出限对比 72.2.2 HPLC-AFS和ICP-MS的标准试样结果对比 82.2.3 HPLC-AFS和ICP-MS的样品结果对比 92.2.4 HPLC-AFS和ICP-MS的加标回收率对比 103 结论 11参考文献： 11高效液相色谱-原子荧光光谱联用技术和电感耦合等离子体质谱技术检测鸡蛋中甲基汞含量的比较分析【摘要】目的：建立准确、灵敏和高效的分析食物中甲基汞含量的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的方法，用于评价食物中甲基汞的含量。方法：高效液相色谱-原子荧光光谱联用技术（HPLC-AFS）和ICP-MS测定鸡蛋样品中的甲基汞。结果：HPLC-AFS和电感耦合等离子体质谱技术（ICP-MS）的线性关系良好，标准系数r2范围在0.9999~1.000之间；而ICP-MS的仪器稳定时间在50min内，前处理时间短，其检出限更低，为0.021μg/L。其次，ICP-MS加标回收率在102.90%~116.00%之间，加标回收率比HPLC-AFS高，最优条件下使用ICP-MS对鸡蛋样品中的甲基汞进行检测，发现甲基汞含量在0.021μg/L~0.028μg/L之间，低于我国制定的食品中和水产品中的甲基汞容许标准，清远市8个超市共20份鸡蛋样品检验结果为合格。结论：在检测食物的甲基汞含量中，ICP-MS比HPLC-AFS要更加快捷、方便、高效和准确。【关键词】电感耦合；高效液相色谱；原子荧光；质谱；联用技术ComparativeanalysisofmethylmercμryineggsbyHPLC-AFSandICP-MS【Abstract】Objective:Inordertoevaluatethemethylmercruryineggssensitively,accyratlelyandefficiently,aninductivelycoupledplasmamassspectrometry(ICP-MS)wasdeveloped.Methods:UsingHigh-performanceLiquidChromatographyAtomicfluorescencespectrometer(HPLC-AFS)andICP-MStoassaymethylmercuryineggs.Resμlts:ThelinearrelationshipbetweenHPLC-AFSandICP-MSwasgood.ThestandardCoefficientr2ofICP-MSrangesfrom0.9999to1.000,andICP-MS’sinstrumentsarestablefor50minutes,whichmeansthepre-treatmenttimeofICP-MSisshorter.ThedetectionlimitofICP-MSis0.021μg/L,whichmeansitsdetectionlimitislower.Inthenextplace,thestandardrecoveryofICP-MSisbetween71.80%and89.50%.Therefor,thestandardrecoveryofICP-MSishigherthanthatofHPLC-AFS.UsingICP-MStoassaymethylmercuryineggsunderoptimalconditions,wefoundmethylmercurylevelsintherangeof0.021μg/L~0.028μg/L,whichmeansthecontentofmethylmercuryislowerthantheallowablestandardofmethylmercuryinfoodandaquaticproducts.ThetestresultsoftwentyeggsamplestakenfromeightsupermakertsinQingyuanwerequalified.Conclμsion:ICP-MSisfaster,moreconvenient,moreefficientandmoreaccuratethanHPLC-AFSinthedeterminationofmethylmercuryineggs.【Keywords】Inductivecoupling;high-performanceliquidchromatography;atomicflμorescence;massspectrum;interworkingtechnique甲基汞属于有机汞，系亲脂性毒物，进入人体后遍布人体全身组织器官，主要侵犯神经系统、损害肾脏，其损害最严重部位为大脑枕叶和小脑，其神经毒素可能扰乱谷氨酸的重摄取，致使神经细胞基因表达异常，症状又神经衰弱综合征、精神障碍、谵妄和共济失调等，特别是对婴幼儿正在发育的神经系统，造成不可逆的损伤[1]。此外亦可致心脏、肝脏及皮肤损害。甲基汞对环境的污染常见于海洋，经生物富集效应[2]传递至鱼虾贝类等海产品中。根据世界卫生组织国际癌症研究机构在2017年公布的致癌物清单初步整理，甲基汞化合物属于2B类致癌物。因此，我国在食品安全国家标准中，对海产品中甲基汞的含量有严格的限量[3]。随着工业和农业的发展，汞的用途越来越广泛，其中，工业排放的废水和有机汞农药的滥用是世界各地汞污染的主要来源，甲基汞在水生生物中有很强的富集放大作用，可以通过食物链传递和富集。所以即使水体中的甲基汞含量很低，也会在水生生物体内检测到高浓度的甲基汞，而处于水生食物链中的营养级较高的肉食性鱼类中，汞的富集倍数可达104~107[1]。各国针对鱼肉中的甲基汞含量都有严格的限量标准：食品法典委员会(CAC)限定鱼类产品中甲基汞的含量为0.5mg/kg；我国限定鱼类中甲基汞含量≤0.5mg/kg[4]。我国食品中汞的限量标准（GB2762）规定新鲜蔬菜、乳及乳制品≤0.01mg/kg；肉类、蛋类≤0.05mg/kg；谷类及其制品、婴幼儿罐装食品≤0.02mg/kg；矿泉水≤0.001mg/L；肉食类鱼类及其制品（甲基汞计）≤1.0mg/kg，其他水产品甲基汞含量≤0.5mg/kg[5]。所以对甲基汞进行分析是十分重要的。近年来，对甲基汞检测的分析方法的改进，已经成为分析化学研究领域的一个热点[4]。常用的测定甲基汞分析方法有原子吸收光谱法、气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱-原子荧光光谱法、液相色谱-原子吸收光谱法、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法等。各种分析方法各有优缺点，在应用上会受到一定限制[6]。目前食品安全标准GB5009.17-2014《食品中总汞和有机汞的测定》[7]规定了甲基汞的检测方法是液相色谱-原子荧光光谱联用法[8]。其中，HPLC-AFS具有前处理过程简便、有利于保持待测样品原始形态不变，接口简单、灵敏度高、选择性好、仪器成本低和普及广等优点，在甲基汞的分析中已有广泛应用，目前GB5009.17-2014《食品中总汞和有机汞的测定》[7]中就是采用这种技术[9]。电感耦合等离子体质谱法是近年来迅速发展起来的一门新技术，由于其灵敏度高、检出限低、线性检测范围宽（可达9个数量级)可以同时进行多元素的测定等优点，该分析技术已广泛应用于食品、卫生、冶金、石油、环境等领域。近年来，以ICP-MS为检测器，与高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等一系列高效分离方法的在线耦合技术为重金属元素的分析提供了平台，在食品行业也起了至关重要的作用[10]。故本实验旨在通过对比高相液相色谱-原子荧光光谱联用方法和电感耦合等离子体质谱法，根据二者之间的仪器稳定性和灵敏度、分析结果的准确性以及两种不同方法的方便性的结果，进行对比与分析，比较出二者的优缺点，从而找出更为高效准确并且适宜的测定食品中甲基汞的方法。材料与方法材料与仪器试剂材料甲醇（CH3OH）为色谱纯，硼氢化钠（KBH4）、过硫酸钾（K2S2O8）、乙酸铵（CH3COONH4）和L-半胱氨酸（L-HSCH2CH（NH2）COOH）为分析纯，硝酸（HNO）、氨水（NH3·H2O），以上试剂材料均购自上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钠（NaOH）、氢氧化钾（KOH）和盐酸（HCl）均购自百灵威有限公司。仪器高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪由高效液相色谱（包括高效液相色谱泵和进样阀）、在线紫外消解系统以及原子荧光光谱仪组成，购自北京宝德仪器有限公司，货号名称为BSA-100B；电感耦合等离子体质谱联用仪由自动进样器和电感耦合等离子质谱仪组成，其中自动进样器购自广州谱临晟科技有限公司，产品名称为SpeciaAnalyst，模型号为ELSpe-2，电感耦合等离子体质谱仪购自赛默飞世尔科技公司，产品名称为iCAPTQICP-MS；天平（感量为0.1mg和1.0mg）；离心机（最大转速为10000r/min）；超声清洗器。样品样品为鲜鸡蛋，购于清远市中各8个超市，共20份鸡蛋样品。方法试剂配制盐酸溶液（5mol/L）：量取208mL盐酸，溶于水井稀释至500mL。盐酸溶液10%（体积比）：量取100mL盐酸，溶于水并稀释至1000mL。硝酸溶液（5mol/L）：量取208mL硝酸，溶于水井稀释至500mL。硝酸溶液10%（体积比）：量取100mL硝酸，溶于水并稀释至1000mL。氢氧化钾溶液（5g/L）：称取5.0g氢氧化钾，溶于水并稀释至1000mL。氢氧化钠溶液（6mol/L）：称取24g氢氧化钠，溶于水并稀释至100mL。硼氢化钾溶液（2g/L）：称取2.0g硼氢化钾，用氢氧化钾溶液(5g/L)溶解并稀释至1000mL。现用现配。过硫酸钾溶液（2g/L）：称取1.0g过硫酸钾，用氢氧化钾溶液(5g/L)溶解并稀释至500mL现用现配。L-半胱氨酸溶液（10g/L）：称取0.1gL-半胱氨酸溶于10mL水中。现用现配。甲醇溶液（1+1）：量取甲醇100mL，加入100mL水中，混匀。标准曲线的制作取5支10mL容量瓶，分别准确加入混合标准使用液(1.00μg/mL)0.010mL、0.020mL、0.040mL、0.060mL和0.10mL，用流动相稀释至刻度。此标准系列溶液的浓度分别为1.0ng/mL、2.0ng/mL、4.0ng/mL、6.0ng/mL和10.0ng/mL。吸取标准系列溶液100μL进样。标准曲线浓度见表-1。表-SEQ图表\*ARABIC1甲基汞标准曲线浓度C1C2C3C4C5甲基汞标准试样1.0ng/mL2.0ng/mL4.0ng/mL6.0ng/mL10.0ng/mL样品前处理HPLC-AFS将鸡蛋样品的蛋清和蛋黄搅拌均匀，称取样品0.5~2.0g（精确至0.001g），置于15mL塑料离心管中，加入10mL的盐酸溶液（5mol/L），放置过夜。室温下超声水浴提取60min，期间振摇数次。4℃下以8000r/min转速离心15min。准确吸取2.0mL上清液至5mL容量瓶或刻度试管中，逐滴加入氢氧化钠溶液（6mol/L），使样液pH为2~7。加入0.2mL的L-半胱氨酸溶液（10g/L），最后用水定容至刻度。0.45μm有机系滤膜过滤，待测，同时做空白试验。ICP-MSICP-MS的样品前处理使用硝酸溶液，其余的方法程序与HPLC-AFS相同。加标样品前处理处理好试样样品，按标准曲线试样的制作步骤，以试样样品为溶剂稀释，将加标样品浓度设置为1.00μg/L和4.00μg/L，平行检测三次。色谱条件色谱柱为C18柱（柱长150mm，内径4.6mm，粒径5μm）；流动相由5%甲醇和0.06mol/L乙酸铵和0.1%L-半胱氨酸混合而成，制备过程为称取0.5gL-半胱氨酸，2.2g乙酸铵，置于500mL容量瓶中，用水溶解，再加入25mL甲醇，最后用水定容至500mL，经0.45μm有机系滤膜过滤后，于超声水浴中超声脱气30min，现用现配；负高压设置为285V；载气设为400mL/min；屏蔽气设置为800mL/min；主阴极电流设为300mA；柱温箱的温度设置为30℃；流速为1.0mL/min；进样体积为100μL。试样溶液的测定将试样溶液100μL注入高效液相色谱-原子荧光光谱联用仪和电感耦合等离子体质谱仪中，得到色谱图，以保留时间定性。以外标法峰面积定量。平行测定次数不少于两次。数据分析试验中测得的数据结果，由仪器自带测定软件以及Excel分析处理。结果与讨论试样测定前仪器的处理在试样进入仪器测定前，仪器和色谱柱需要进行预热和平衡，用不同浓度梯度的甲醇溶液和流动相冲洗与充满仪器管道和色谱柱，以保证仪器运行稳定，有助于提高结果的准确性。不同试验方法，其所使用的不同仪器所需要的稳定时间的长短不同。HPLC-AFS和ICP-MS的稳定时间见表-2。由表-2可知，HPLC-AFS的总稳定时间一共为120min，ICP-MS的总稳定时间一共为50min，HPLC-AFS的稳定时间比ICP-MS的稳定时间多两倍以上，由此可得知，使用ICP-MS测定食物中的甲基汞时，所需要的稳定仪器时间较少，故ICP-MS比HPLC-AFS更为快捷便利。表-SEQ图表\*ARABIC2HPLC-AFS与ICP-MS稳定时间100%甲醇50%甲醇5%甲醇流动相HPLC-AFS20min20min20min60minICP-MS15min10min15min10min试样测定后的数据分析HPLC-AFS和ICP-MS的标准曲线和检出限对比检测标准试样，以检测到的浓度为纵坐标，以标准系列溶液中目标化合物的浓度为横坐标，得到标准曲线。通过仪器自带数据分析软件的分析，HPLC-AFS和ICP-MS的标准曲线线性关系良好，相关系数r2在0.9999~1.000之间。检出限是评价分析方法及测试仪器性能的重要指标，是指某一特定分析方法，在给定的显著性水平内，可以定性地从样品中检出待测物质的最小浓度或最小量，检出限仅仅是一种定性的判断依据，是粗略表征测试体系性能的概念，通常不能用于真实分析，而常用于仪器比较及方法比对[11]。HPLC-AFS的检出限为0.83μg/L，ICP-MS的检出限为0.021μg/L，二者之间的检出限相差较大，ICP-MS的检出限比HPLC-AFS的检出限更低。虽然ICP-MS标准系数为0.9999，HPLC-AFS标准系数为1.000，但在试验操作中，是通过保留时间定性，峰的面积大小定量，而HPLC-AFS的仪器自带数据分析软件在分析结果数据时，由于HPLC-AFS的检出限比ICP-MS的检出限要高，所以在检测低浓度试样样品时，HPLC-AFS会将检测试样中的杂峰误当成甲基汞的峰，导致需要人为地手动去找出峰和标定峰面积，导致分析数据过程中，结果数据可能会因操作实验人员的主观性等不稳定因素出现错误，而ICP-MS的低检出限，能够很好地避免出现这种问题，从而能够有效提升甲基汞含量的检出率和检测结果的准确性。由此可见，ICP-MS仪器检测食物中甲基汞含量更为灵敏。HPLC-AFS和ICP-MS的标准曲线和检出限见表-3。表-3HPLC-AFS和ICP-MS标准曲线和检出限曲线方程相关系数r2检出限μg/LHPLC-AFSY=1.0003x-0.00071.0000.83ICP-MSY=1.0047x-0.03180.99990.021HPLC-AFS和ICP-MS的标准试样结果对比由于HPLC-AFS的检出限为0.83μg/L，所以测定HPLC-AFS的结果准确性时，为避免浓度的检出，使用1.00μg/L和6.00μg/L的标准试样来进行检测。同时，由于ICP-MS的检出限较低，为0.021μg/L，故使用0.60μg/L和6.00μg/L的标准试样来进行测定，HPLC-AFS和ICP-MS的标准试样检测浓度见表-4，根据平行试验结果数据，用Excel对数据进行计算和分析，检测得出的结果见表-5。精密度是在规定条件下，独立测试结果间的一致程度。精密度仅仅依赖于随机误差的分布而与真值或接受参照值无关。通常用偏差衡量精密度的高低，最常用的是标准差。精密度越低，标准差越大[12]。相对标准偏差是反映精密度的一个值，当相对标准偏差的值越低时，其精密度越高，由表-5可知，HPLC-AFS和ICP-MS对检测甲基汞含量有较好的精密度，由于HPLC-AFS和ICP-MS的6.00μg/L标准试样结果的标准差和相对标准偏差数值相差较近，所以用HPLC-AFS的1.00μg/L与ICP-MS的0.6μg/L标准试样结果做对比，HPLC-AFS的相对标准偏差数值为6.42%，数值比ICP-MS的相对标准偏差数值0.79%高出许多，可得知HPLC-AFS对检测甲基汞含量需要较高条件的前处理，否则，检测时受到比较严重的杂质污染，从而影响检测的精密度，而ICP-MS的标准偏差数值较低，可见其对检测环境条件并不十分苛刻，干扰份子少，数值波动篇幅小且均衡，所以仪器检测的精密度较高。表-4HPLC-AFS与ICP-MS标准试样检测浓度HPLC-AFSICP-MS1.00μg/L标准试样6.00μg/L标准试样0.60μg/L标准试样6.00μg/L标准试样1.13μg/L5.93μg/L0.607μg/L6.036μg/L1.19μg/L6.01μg/L0.624μg/L6.091μg/L1.19μg/L5.99μg/L0.602μg/L5.963μg/L1.16μg/L6.12μg/L0.611μg/L6.091μg/L1.27μg/L6.02μg/L0.618μg/L6.096μg/L1.08μg/L5.99μg/L0.615μg/L6.141μg/L表-5HPLC-AFS和ICP-MS结果平均值μg/L标准差相对标准偏差HPLC-AFS1.17/6.010.0642/0.06236.42%/6.23%ICP-MS0.613/6.0700.0079/0.06200.79%/6.20%HPLC-AFS和ICP-MS的样品结果对比实验中分别用HPLC-AFS和ICP-MS两种不同的方法对20份新鲜鸡蛋的甲基汞进行检测，使用ICP-MS测定到鸡蛋的甲基汞含量范围在0.021μg/L~0.028μg/L之间，而HPLC-AFS没有检测到鸡蛋样品中的甲基汞含量。从表-3得知，HPLC-AFS的检出限在0.83μg/L以上，而从ICP-MS测定得出的数据可知，鸡蛋样品中的甲基汞含量大多在0.021μg/L~0.028μg/L之间，故HPLC-AFS检测不到样品中的甲基汞含量多少，所以HPLC-AFS在检测食品中甲基汞含量并不及格。由于我制定的食品中和水产品中的甲基汞容许标准中，蛋类中的甲基汞含量需小于等于0.2mg/kg，ICP-MS测定的甲基汞含量在0.021μg/L~0.028μg/L之间，结果均在容许标准之下，由此可见，各大超市售卖的鸡蛋所含的甲基汞含量较少，对人体没有危害，检测结果为合格。ICP-MS测定20份鸡蛋中甲基汞含量见表-6。表-6ICP-MS测定20份鸡蛋中甲基汞含量（μg/L）样品编号甲基汞含量样品编号甲基汞含量样品010.024样品110.021样品020.022样品120.025样品030.021样品130.026样品040.027样品140.028样品050.025样品150.023样品060.021样品160.028样品070.026样品170.027样品080.0.27样品180.024样品090.028样品190.022样品100.022样品200.026HPLC-AFS和ICP-MS的加标回收率对比表-7为HPLC-AFS和ICP-MS的加标回收率。加标回收率的结果，按规定的允许限判定是否合格。被测组分的含量≤1mg/L时，回收率的允许限为80%~120%；被测组分的含量在1~100mg/L时，回收率的允许限为90%~110%；被测组分的含量≥100mg/L时，回收率的允许限为95%~105% [11]。由表-7可以看到，HPLC-AFS的1.00μg/L加标回收率在19.00%~39.00%之间，4.00μg/L加标回收率在，74.00%~75.75%之间，范围幅度浮动较大，二者的数值范围相差较大，而1.00μg/L的19.00%~39.00%加标回收率范围，不禁波动幅度大，而且回收率也非常低，出现这种情况，可能是由于HPLC-AFS的检出限低，需要较高的前处理条件，同时受样品中的其他杂质影响，由前文得知HPLC-AFS的检出限为0.83μg/L，而试样的甲基汞含量普遍在0.021μg/L~0.028μg/L之间，所以，在使用HPLC-AFS检测试样样品时，仪器检测不到明确的峰，只能人为手动去设置，从而有极大程度地把杂质峰误认为甲基汞的峰，最后导致HPLC-AFS的加标回收率结果失效，判定为不及格。同样，ICP-MS的1.00μg/L加标回收率在113.20%~116.00%之间，4.00μg/L加标回收率在102.90%~103.75%之间，范围波动较小，且数值相差也较小，结果符合当被测组分的含量≤1mg/L时，回收率的允许限为80%~120%的条件，结果判定为合格。通过二者的高低浓度梯度的加标样品的加标回收率对比，出现了低浓度梯度的加标样品的加标回收率均高于高浓度梯度的加标样品的加标回收率的现象，经过思考和回溯试验中的制备加标样品过程，造成这种情况出现的原因可能为在制备加标样品时，使用普通试样为溶剂稀释，会对加标样品检测后的甲基汞含量造成一定的影响，查阅文献得知，直接使用回收率理论计算公式的计算值，受加标体积的影响，均较其真实的回收率偏低，且其偏低值随加标体积的增加而增大，影响对分析结果准确度的正确评估[11]。在对比之下，明显可知ICP-MS检测食物中甲基汞含量时，其加标回收率高于HPLC-AFS加标回收率值，检测结果较稳定，满足检测中遇到低浓度样品时所需要达到的检测要求，准确性和稳定性较好。表-7HPLC-AFS和ICP-MS的加标回收