弹性蛋白仿生多肽的合成与性质研究

弹性蛋白仿生多肽的合成与性质研究摘要利用固相合成法合成DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD、DD（VPGVG）6DD、DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD三段弹性蛋白仿生多肽序列，质谱检测其是否符合目标序列，并对符合目标序列的多肽进行溶解度温变性等性质研究。关键词弹性蛋白；仿生多肽；固相合成；质谱；相变温度；引言1.1弹性蛋白概述弹性蛋白是一种细胞外基质蛋白，主要由成纤维细胞、大动脉平滑肌细胞和弹性软骨的软骨细胞等产生，可与微原纤维结合成弹性纤维，赋予所在组织和器官伸缩性与可逆变形能力。大动脉、皮肤等高活动性细胞中含有大量的弹性蛋白。弹性蛋白的可溶性前体称为原弹性蛋白，在赖氨酰氧化酶的催化氧化下形成其特有的交联结构而形成弹性蛋白\o"常德才,2008.12#91"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>常德才</Author><Year>2008.12</Year><RecNum>91</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">1</style></DisplayText><record><rec-number>91</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">91</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">常德才</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">弹性蛋白在生物医用材料中的应用</style></title></titles><dates><year>2008.12</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>1。在组织中，如动脉血管，弹性蛋白网络支配低应变机械反应，能量的传递效率和形状恢复率是关键参数。事实上，为了避免动脉壁疲劳和失效，这些功能可能取决于弹性蛋白的弹性，这可以阻止传输的能量向热的耗散\o"LeiHuang,Macromolecules2000,33,2989-2997#96"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>LeiHuang</Author><Year>Macromolecules2000,33,2989-2997</Year><RecNum>96</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">2</style></DisplayText><record><rec-number>96</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">96</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LeiHuang,</style><styleface="normal"font="default"charset="128"size="100%">R.AndrewMcMillan,RobertP.Apkarian,BenhamPourdeyhimi,</style></author><author><styleface="normal"font="default"size="100%">VincentP.Conticello,</style><styleface="normal"font="default"charset="128"size="100%">andElliotL.Chaikof</style></author></authors></contributors><titles><title>GenerationofSyntheticElastin-MimeticSmallDiameterFibersandFiberNetworks</title></titles><dates><year>Macromolecules2000,33,2989-2997</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>2。弹性蛋白交联度很高，水溶性很差，但其前体原弹性蛋白溶解度较好。原弹性蛋白含有700-760个氨基酸残基，其中95％的氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸等非极性氨基酸。原弹性蛋白从细胞中分泌出来后包覆在细胞表面，在赖氨酰氧化酶的催化下氧化成有特殊交联结构的弹性蛋白。弹性蛋白与微原纤维共同组成弹性纤维。由于弹性蛋白中的主要成分是甘、脯等氨基酸，形成的β-螺旋结构中，外部有较多的亲水基团——甘氨酸，疏水基团包在螺旋结构内部，使得弹性蛋白具有亲水性、弹性和坚韧性；同时，弹性蛋白的特殊结构也使得它不溶于稀酸、碱、醇和盐溶液，仅在一些极性溶剂中出现溶胀现象；弹性蛋白的热稳定性很好，热分解过程发生在220℃～380℃；并且弹性蛋白还有很强的物理、化学和某些酶的耐受能力\o"Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．,1989#92"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．</Author><Year>1989</Year><RecNum>92</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">3</style></DisplayText><record><rec-number>92</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">92</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">Robert</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，WilliamHomebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．</style></author><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">CRCPress，；2：169</style></author></authors></contributors><titles></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">1989</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>3。1.2弹性蛋白的应用1.弹性蛋白基生物医用材料：弹性蛋白良好的弹性和具有稳定性的交联结构，这些使其成为组织工程中令人期待的材料。弹性蛋白能够在体外研究中改变血管平滑肌细胞的增殖、迁移和分化，并能有效减少细胞增殖引起动脉损伤的炎症反应\o"KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．,2003；30：411#94"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．</Author><Year>2003；30：411</Year><RecNum>94</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">4</style></DisplayText><record><rec-number>94</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">94</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">KarnikSK</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Developmerit，Acriticalroleforelastinsiginvascularmorphogenesisanddisease．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">2003；30：411</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>4。由此，弹性蛋白受到了组织工程的关注，并出现了相关应用。其中包括具有良好生物相容性，能防血栓的弹性蛋白支架材料\o"ul．,2004；25：5227#95"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>ul．</Author><Year>2004；25：5227</Year><RecNum>95</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">5</style></DisplayText><record><rec-number>95</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">95</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LuQJ</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，GsnesanK，Simionescu</style><styleface="normal"font="default"size="100%">DT</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，</style><styleface="normal"font="default"size="100%">erul</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">．</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，Novelpo</style><styleface="normal"font="default"size="100%">ro</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">usaorticelastinandcollagenscaffoldsfortissueengineering．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">2004；25：5227</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>5。但这种支架材料强度不足，由此产生了弹性蛋白-胶原蛋白联合支架材料，弥补了弹性蛋白支架材料强度不足的问题。此外，还有通过聚二恶烷酮增强了材料力学性能的弹性蛋白-聚二恶烷酮支架，这种材料的机械性能与动脉组织相近，常常用于组织重建通过\o"CP，,Biomed．Mater，2006；1：72#97"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>CP，</Author><Year>Biomed．Mater，2006；1：72</Year><RecNum>97</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">6</style></DisplayText><record><rec-number>97</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">97</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">SellSA</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，McClureMJ，BarnesCP，</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Electrospunpolydioxanone—elastinblend：potentialforbioresorbablevasculargrafts．</style></title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">Biomed</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">．Mater，2006；1：72</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>6。2.弹性蛋白水解产物基生物医用材料：将不溶性的弹性蛋白用80％乙醇和1mol／LNa0H处理可得κ-elastin，用草酸处理可得α-e1astin。κ-elastin和α-elastin是弹性蛋白的可溶形式，尽管与弹性蛋白本身的结构不同，但其仍然保持了一些主要的物理化学性能，如可以凝聚到原纤维上、调节动脉平滑肌细胞的迁移和增殖速率等。因此，可溶性的弹性蛋白水解产物材料也获得了较大的发展。例如，将胶原蛋白、明胶、α-elastin电纺制成组织工程支架，该材料随着溶液给料速率的增加，呈现出伪弹性波动型形态，细胞培养结果显示：此支架能够支持人体胚胎腭突间充质细胞的黏附和增殖\o"MR．,Biomaterials，2005；26(3O)：5999#98"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>MR．</Author><Year>Biomaterials，2005；26(3O)：5999</Year><RecNum>98</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">7</style></DisplayText><record><rec-number>98</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">98</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LiMY</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，MondrinosMJ，GandhiMR．</style></author></authors></contributors><titles><title>Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering</title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，2005；26(3O)：5999</style></year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>MR．</Author><Year>Biomaterials，2005；26(3O)：5999</Year><RecNum>98</RecNum><record><rec-number>98</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">98</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"size="100%">LiMY</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">，MondrinosMJ，GandhiMR．</style></author></authors></contributors><titles><title>Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering</title></titles><dates><year><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">Biomaterials，2005；26(3O)：5999</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>7\o"MR．,Biomaterials，2005；26(3O)：5999#98"。1.3类弹性蛋白概述类弹性蛋白多肽(ELPs)是一种以弹性蛋白结构为模板通过基因工程技术重组的蛋白质聚合物,它源自于原弹性蛋白的疏水区域\o"张光亚，陈智山，李红春，黄凯宗,2011.4.8.#99"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>张光亚，陈智山，李红春，黄凯宗</Author><Year>2011.4.8.</Year><RecNum>99</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">8</style></DisplayText><record><rec-number>99</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">99</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">张光亚，陈智山，李红春，黄凯宗</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">类弹性蛋白多肽的分子动力学研究</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">计算机与应用化学</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>计算机与应用化学</full-title></periodical><dates><year>2011.4.8.</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>8。类弹性蛋白多肽由五肽重复序列单元(VPGXG)n组成(X可以是除了脯氨酸以外的任意一种氨基酸)\o"陈榕英,2011,18(1):085～088#100"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>陈榕英</Author><Year>2011,18(1):085～088</Year><RecNum>100</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">9</style></DisplayText><record><rec-number>100</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">100</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">陈榕英,徐希明,余江南</style></author></authors></contributors><titles><title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">类弹性蛋白聚合物(ELPs)水凝胶的药物控释研究进展</style></title><secondary-title><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology</style></secondary-title></titles><periodical><full-title>药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology</full-title></periodical><number></number><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2011,18(1):085</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">～088</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>9。类弹性蛋白拥有以下特殊的性质：当处于低温条件时，类弹性蛋白多肽在水溶液中具有比较好的溶解性质，且随着该溶液温度的升高，类弹性蛋白多肽的溶解性质会降低。当该溶液达到一个临界温度的时候，类弹性蛋白多肽会变成聚合状态，从而在溶液中析出，这个温度被称为相变温度，并且这个过程具有可逆性质，当温度重新回到相变温度之下后，类弹性蛋白多肽又会重新溶解在溶液中。这种特殊的性质可能是由于类弹性蛋白多肽的二级结构——β-螺旋。在分子尺度上，随着温度来到相变温度之上后，类弹性蛋白多肽会发生构象转变，即相变温度之下的部分无序构象β-螺旋的链间交联度逐渐升高，转变成了链间β-折叠结构，进一步导致了不同类弹性蛋白多肽链之间的交联\o"AluriS,2009,61:940.#101"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>AluriS</Author><Year>2009,61:940.</Year><RecNum>101</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">10</style></DisplayText><record><rec-number>101</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">101</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>AluriS,JanibSM,MackayJA.</author></authors></contributors><titles><title>Environmentallyresponsivepeptidesasanticancerdrugcarriers[J].</title><secondary-title>AdvancedDrugDeliveryReviews</secondary-title></titles><periodical><full-title>AdvancedDrugDeliveryReviews</full-title></periodical><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2009,61:940</style><styleface="normal"font="default"charset="134"size="100%">.</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>10。Urry从振动熵的形成及疏水性聚集两方面来阐述(GVGVP)n的相变机理。在(GVGVP)n疏水区域内有序体运动链节会产生相互作用,由于疏水区域内部运动链的阻尼作用,疏水性区域聚集会引起振动熵的上升,疏水性区域聚集的发生是伴随着蛋白疏水部位共振,而温度在一定范围内上升时有助于疏水作用加强。在相变发生时,增加温度会使在水环境中的聚合物有序性得到加强，而包围在疏水性残基的有序水分子变成无序状态,此时疏水性基团将与水溶液相分离,结果在整个变化过程中是趋于无序性的,这与热力学第二定律相吻合\o"UrryDW,2002,357:169-184#102"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>UrryDW</Author><Year>2002,357:169-184</Year><RecNum>102</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">11</style></DisplayText><record><rec-number>102</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">102</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>UrryDW,HugelT,SeitzM,etal.</author></authors></contributors><titles><title>Elastin:arepresentativeidealproteinelastomer</title><secondary-title>TheRoyalSociety.</secondary-title></titles><periodical><full-title>TheRoyalSociety.</full-title></periodical><dates><year>2002,357:169-184</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>11。此外，类弹性蛋白多肽还拥有很多优点：1、类弹性蛋白多肽的相变温度可以通过控制链段长度、氨基酸组成和序列在0摄氏度到100摄氏度之间调节，因此可以用于药物装运或者是蛋白质的纯化\o"RaucherD,2008,5(3):#103"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>RaucherD</Author><Year>2008,5(3):</Year><RecNum>103</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">12</style></DisplayText><record><rec-number>103</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">103</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>RaucherD,MassodiI,BidwellGL.</author><author>353.</author></authors></contributors><titles><title>Thermallytargeteddeliveryofchemotherapeuticsandanti-cancerpeptidesbyelastinlikepolypeptide[J].</title><secondary-title>ExpertOpinDrugDeliv.</secondary-title></titles><periodical><full-title>ExpertOpinDrugDeliv.</full-title></periodical><dates><year>2008,5(3):</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>12，并且可以通过基因工程技术控制聚合物的链段长度、序列和组成比可改变聚合物的物理化学、生物和材料性质,从而形成一系列ELPs,可以获得在室温下可溶、在生理条件下原位自组装成刺激响应性水凝胶的蛋白质聚合物；2、类弹性蛋白多肽可以通过大肠杆菌来进行生物合成，这种方法制备得到的类弹性蛋白多肽的纯化过程过程简单，生产成本较低，并且可以控制类弹性蛋白多肽的分子量；3、类弹性蛋白多肽还具有可生物降解性、生物相容性和低免疫原性，况且，由于类弹性蛋白多肽是大分子，也可以作为被动靶向的载药系统，这些性质有利于类弹性蛋白多肽在体内的运输、作用和降解，使类弹性蛋白多肽在生物医学的领域具有十分广阔的应用前景。1.4类弹性蛋白多肽的应用类弹性蛋白多肽在一定温度下的溶液-凝胶相变特点使它成为理想的控制药物释放的载体。1、对温度敏感的类弹性蛋白-药物的结合物：类弹性蛋白多肽的特殊性质让它具有了对温度敏感的特性，而控制类弹性蛋白多肽的相变温度在人体可接受的治疗温度范围之间也使它在医学治疗肿瘤方面有很多研究。类弹性蛋白-阿霉素结合物可以显著降低多耐药肿瘤细胞P-糖蛋白转运体耐药机制的作用，以增强阿霉素对肿瘤细胞的毒性。而加热后的类弹性蛋白可以更深入地渗透进肿瘤内部，充分展示了温度敏感的类弹性蛋白在医学治疗的巨大前景。2、多肽-类弹性蛋白融合蛋白：室温下呈溶解状态的可凝胶化的多肽-类弹性蛋白融合蛋白可在生理温度的刺激下聚集凝胶，形成凝胶状的药物贮库，并且能随着该类弹性蛋白融合蛋白的解聚而慢慢清除，延长了药物释放，增强了关节疾病的治疗效果。多肽-类弹性蛋白融合蛋白可以防止药物发生严重的副反应，避免了免疫抑制的出现。3、环境敏感型高分子水凝胶：环境敏感型高分子水凝胶是一类很有前途的材料，可用于微驱动、传感器和细胞-材料相互作用的控制。可通过化学反应（例如，具有可电离、氧化还原或光活性基团的聚电解质）、离子交换现象、相变和由pH、离子强度引起的“有序无序”转变而发生体积变化的各种类弹性蛋白多肽等的聚合物水凝胶。这类聚合物水凝胶通过物理化学引起的溶胀变化产生作用力，从而改变凝胶-溶剂之间的相互作用。这些水凝胶的生产能力有可能满足新兴技术领域对微执行器材料的需求，如机器人技术和微机械系统（MEMS）。基因工程ELP聚合物可以通过精确间隔的反应基团进行化学交联，从而产生具有“可调”物理性能的热响应水凝胶。水凝胶的结构差异与组成ELP配方的参数（如分子量、溶液浓度和赖氨酸含量）直接相关。在低温下，ELP水凝胶本质上是完全弹性的，通过扩展的ELP片段和化学交联反应形成的功能性分子间交联来传递力。随着温度的升高，凝胶收缩、脱水，缩合多肽段之间的分子间相互作用产生粘滞摩擦能\o"KimberlyTrabbic-Carlson,2003,4,572-580#105"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>KimberlyTrabbic-Carlson</Author><Year>2003,4,572-580</Year><RecNum>105</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">13</style></DisplayText><record><rec-number>105</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">105</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>KimberlyTrabbic-Carlson,LoriA.Setton,andAshutoshChilkoti</author></authors></contributors><titles><title>SwellingandMechanicalBehaviorsofChemicallyCross-LinkedHydrogelsofElastin-likePolypeptides</title><secondary-title>Biomacromolecules</secondary-title></titles><periodical><full-title>Biomacromolecules</full-title></periodical><dates><year>2003,4,572-580</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>13。4、类弹性蛋白多肽及其共聚物自组装：类弹性蛋白多肽的序列可以通过化学合成技术而实现精确控制，从而满足不同的设计需求，还可以加入非天然氨基酸进行进一步的功能化修饰。金属离子和特定配体之间的相互作用，可以用于调控多肽的自组装，从而制备性质可控的多肽仿生材料。Chmielewski等人设计了两种胶原多肽HisCol和IdaCol，它们中间都包含(Pro-Hyp-Gly)9序列，以保证其形成三重螺旋结构\o"Pires,2011,133(37):14469-14471.1#106"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pires</Author><Year>2011,133(37):14469-14471.1</Year><RecNum>106</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">14</style></DisplayText><record><rec-number>106</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">106</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pires,M.M.,Przybyla,D.E.,RubertPerez,C.M.,Chmielewski,J.</author></authors></contributors><titles><title>Metal-mediatedtandemcoassemblyofcollagenpeptidesintobandedmicrostructures[J].</title><secondary-title>JAmChemSoc.</secondary-title></titles><periodical><full-title>JAmChemSoc.</full-title></periodical><dates><year>2011,133(37):14469-14471.1</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>14(图1)。HisCol多肽的N和C末端都含有两个组氨酸，而IdaCol多肽的N和C末端都含有亚氨基二乙酸侧链修饰的赖氨酸。两个胶原多肽的混合物，在二价金属离子Ni2+、Zn2+或Cu2+的诱导下，可自组装形成纳米尺寸的花瓣状结构。不同于二价金属离子，镧系离子具有发光寿命长、毒性低、线性发射和光化学稳定性高等优良性质。2016年，我们课题组首次构建了一种胶原多肽,可以由镧系离子介导其自组装形成纳米材料\o"He,2016,22(б):1914-1917.#107"ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>He</Author><Year>2016,22(б):1914-1917.</Year><RecNum>107</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">15</style></DisplayText><record><rec-number>107</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="stvepxt9ozx0tye5adzppps5wtxpeasfx5vx">107</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>He,M.,Wang,L.,Wu,J.,Xiao,J.</author></authors></contributors><titles><title>Ln(3+)-MediatedSelf-AssemblyofaCollagenPeptideintoLuminescentBandedHelicalNanoropes[J].</title><secondary-title>Chemistry.</secondary-title></titles><periodical><full-title>Chemistry.</full-title></periodical><dates><year><styleface="normal"font="default"size="100%">2016,22(</style><styleface="normal"font="default"charset="204"size="100%">б):1914-1917.</style></year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>15(图2)。该胶原多肽的两端各包括两个天冬氨酸，可以作为镧系离子的配体。该胶原多肽在镧系离子存在的条件下，首尾相连，自组装形成螺旋纳米绳结构，并具有天然胶原特征性的周期排列。这个可逆的自组装体系对镧系离子特异，其它二价金属离子对它没有调控能力。镧系离子不仅作为一个生物相容性良好的外来调控介质，而且赋予这个材料良好的光学性能。该新型胶原多肽仿生材料具有精致的纳米结构和发光性能，它在细胞成像、医学诊断和组织培养领域的应用具有巨大潜力本项目也将其作为研究的重点。图1图2实验过程2.1材料N，N-二甲基甲酰胺（Dimethylformamide，DMF）、异丙醇（isopropanol）、二氯甲烷（Dichloridemethyl，DCM）购自天津大茂化学试剂厂，乙醚购自天津二厂，三氟乙酸、TIS、DIEA、哌啶购自百灵威（北京），合成所用氨基酸以及HBTU购自上海吉尔生化公司，HOBt购自韶远化学科技（上海）。2.2多肽合成多肽是利用2-氯三苯甲基氯树脂以0.1mmol规模合成。我们使用Fmoc氨基酸(4eq.)、DIEA(6eq.)、HBTU(4eq.)和HOBt(4eq.)通过双偶联方法进行氨基酸的逐步偶联（3h）。在每个偶联反应后，将上述反应混合物用DMF(3×3.5mL)和DCM(3×3.5mL)交替洗涤三次，然后加入20％哌啶(DMF溶液)以除去Fmoc保护基团。显色试剂(2％乙醛/DMF溶液，2％四氯苯醌/DMF溶液)用于检测每个循环的偶联反应和Fmoc脱帽反应的完成。将TFA/H2O(95:5)切割液倒入到注射器中振荡切割树脂上的多肽。然后将反应液滴入到冰乙醚中，使目标多肽沉淀，并将多肽沉淀在冰乙醚中再悬浮，超声处理和离心后收集。多肽样品溶于20%乙腈/水溶液后通过C18柱进行高效液相色谱(HPLC)分离纯化，并进一步利用质谱鉴定。多肽合成步骤的细节优化1.基质树脂可以选用胺树脂或者氯树脂，胺树脂需要在活化以后进行脱帽反应才能和氨基酸反应，而氯树脂可以在活化后直接使用。2.加入已经处理完毕的氨基酸反应后，应使用适量DMF涮洗PC管，使氨基酸尽可能地转移到反应体系中。3.反应过程必须控制好反应物溶液的量，如果反应过程中溶剂不足，很容易在反应过程中被鼓入的气体吹干，导致反应不够充分；如果溶剂过多，液面高于油浴，反应体系温度不足，反应速率进一步降低，进而影响产率。4.在进行脱帽反应和氨基酸连接反应的间隔洗涤时，需要在DMF洗涤和DCM洗涤之间加一步异丙醇洗涤，便于进一步洗涤干净残余反应物，并减少DMF残余。5.在进行脱帽反应和氨基酸连接反应的间隔洗涤时，也要用溶剂将反应管内壁冲洗干净。用DCM洗涤时要格外注意不要把树脂溅到合成管内壁。因为被DCM冲到合成管内壁后会在抽干过程中粘在内壁上。6.随着多肽链的长度增加，氨基酸连接反应时间需要适当加长（氨基酸每连接五个，反应时间增加20%）。7.在脱帽反应和氨基酸连接反应结束后，需要用滤纸擦净合成管管口，避免被溶剂蒸汽裹挟的反应物残留在管口，在下一步反应的时候落入合成管，造成污染。8.显色剂中和四氯苯醌有关的部分都要现用现配，使用前再进行混合分装，不可过夜使用。如果显色反应不够明显，可以微热静置几分钟。如果显色反应依然不满足要求，则需再次进行反应。2.3质谱检测取少量样品装在小PC管里，溶于200μL水中，进行质谱检测，确定其序列是否为所需序列。对符合目标序列的多肽进行相变能力检测。多肽自组装能力检测2.3.1多肽自组装概述多肽可以在镧系金属离子介导下自组装形成纳米材料。产品多肽的两末端都分别包括两个天冬氨酸（D）作为镧系金属离子的配体。弹性多肽在镧系金属离子存在下，首尾相连，自组装形成纳米结构。自组装材料具有良好的光学性能和细胞粘附特性，这种新型的弹性多肽自组装体系可以很好地模拟天然弹性蛋白的结构、组装和功能。2.3.2缓冲溶液的配制配制50mL20mmol/L浓度的HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲溶液，用15mol/L的HCl溶液调节缓冲溶液的pH=7.4。2.3.2样品溶液的制备在PC管中配制编号为1、2、3、4的硝酸镧溶液（用HEPES缓冲溶液溶解）各2mL，它们的浓度依次为500mg/mL、200mg/mL、100mg/mL和50mg/mL；再在PC管中配制编号为1、2、3、4的多肽样品溶液（用HEPES缓冲溶液溶解）各1mL,它们的浓度依次为50mg/mL、20mg/mL、10mg/mL和5mg/mL。放在摇床上充分振摇溶解，使得所有溶液都澄清透明，且对比没有透明度差别为止。将两种溶液相同编号对应等体积混合，充分混合，观察是否有沉淀产生。如果都没有沉淀产生，将浓度最高的一份混合溶液加热至50℃后再观察。实验结果与分析3.1多肽产品的质谱分析结果由图1可知：序列DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD的多肽相对分子质量应该在3880左右，但是质谱检测结果的分子离子峰只有3471.33，说明这个序列合成失败，不满足进一步检测的要求。而由图2和图3可知：序列DD（VPGVG）6DD和DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD的相对分子质量分别在3777和3808左右，与质谱中分子离子峰在3777.48和3808.45吻合，说明DD（VPGVG）6DD和DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD两条多肽合成成功，满足进一步检测其性能的要求。溶剂峰溶剂峰图3-1DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列质谱检测图3-2DD（VPGVG）2VPGDG(VGVAPG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列质谱检测图4DD（VPGVG）6DD序列质谱检测图5DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD序列质谱检测3.2多肽的性能测试结果将两份合成成功，满足测试要求的多肽产品按照多肽相变能力检测方法进行制样检测，两份产品的样品-硝酸镧全浓度混合溶液均不产生沉淀，加热至50℃后依然都不产生沉淀。在离心机中（2℃，12000r,6min）离心后依然无法观察到沉淀，说明样品无法满足在人体可适应温度下发生自组装反应的要求，这两种序列设计不满足要求。小结与展望本项目制备的DD（VPGVG）2VPGDG(VPGVG)2VPGDG(VPGVG)2DD和DD（VPGVG）6DD两种序列没能在适宜的温度下发生组装，这有可能是序列设计本身的问题导致的。一种可能是在设计的过程中，为了兼顾弹性蛋白质的序列特征，以及分散介质和反应物质的溶解能力，序列中选择了大量的疏水性氨基酸(缬氨酸V、丙氨酸A)。这可能会导致多肽亲水能力较弱，在水中分散后仍以分子形式为主要存在形体，难以利用静电作用与镧离子结合实现自组装反应。另一种可能是设计的多肽等电点较低，在pH值较高的情况下才能使羧基电离，有利于与镧正离子结合实现自组装反应，但是pH值过高（pH>9）会导致镧离子沉淀。因此，自组装体系的适用pH区间较小，也会导致自组装反应难以进行。针对本次出现的情况，可以调整氨基酸序列，插入更多的极性强，易给出质子并携带负电荷的氨基酸如天冬氨酸（D）或者谷氨酸（E），增强其更强的配位结合能力与亲水性，提高自组装的成功率。也可以选用其他静电作用性强的重金属离子，比如其他稀土金属元素。还可以尝试进行改性处理，比如让多肽的螺旋结构包覆磁性材料纳米粒子，形成包覆溶解物，用磁性辅助实现自组装反应等。致谢一年的创新创业经历在这个季节即将划上一个句号，而于我的人生却只是一个逗号，我将面对又一次征程的开始。在论文即将付梓之际，思绪万千，心情久久不能平静。我的导师肖建喜教授，您治学严谨，学识渊博，思想深邃，视野雄阔，为我营造了一种良好的科研氛围。从论文题目的选定到论文写作的指导,经由您悉心的点拨,再经思考后的领悟,常常让我茅塞顿开。朋辈导师孙秀霞老师和李佳楠师兄，也在我科研生活的细节中给予了我很多的帮助。我还要感谢我的父母，您们的支持是我努力前行最坚实的后盾。在论文即将完成之际，我的心情无法平静，从开始进入课题到论文的顺利完成，有多少可敬的师长、同学、朋友给了我无言的帮助，在这里请接受我诚挚谢意！同时也感谢学院为我提供良好的做毕业设计的环境。最后再一次感谢所有在毕业设计中曾经帮助过我的良师益友和同学，以及在设计中被我引用或参考的论著的作者。参考文献ADDINEN.REFLIST1. 常德才,弹性蛋白在生物医用材料中的应用.2008.12.2. LeiHuang,R.A.M.,RobertP.Apkarian,BenhamPourdeyhimi,;VincentP.Conticello,a.E.L.C.,GenerationofSyntheticElastin-MimeticSmallDiameterFibersandFiberNetworks.Macromolecules2000,33,2989-2997.3. Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．,R.W.;Press，；2：169,C.,1989.4. KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．,Developmerit，Acriticalroleforelastinsiginvascularmorphogenesisanddisease．.2003；30：411.5. ul．,L.Q.G.K.S.D.e.,Biomaterials，Novelporousaorticelastinandcollagenscaffoldsfortissueengineering．.2004；25：5227.6. CP，,S.S.M.M.B.,Electrospunpolydioxanone—elastinblend：potentialforbioresorbablevasculargrafts．.Biomed．Mater，2006；1：72.7. MR．,L.M.M.M.G.,Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering.Biomaterials，2005；26(3O)：5999.8. 张光亚，陈智山，李红春，黄凯宗,类弹性蛋白多肽的分子动力学研究.计算机与应用化学20. 陈榕英,徐.,余江南,类弹性蛋白聚合物(ELPs)水凝胶的药物控释研究进展.药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2011,18(1):085～088,().10. AluriS,J.S.,MackayJA.Environmentallyresponsivepeptidesasanticancerdrugcarriers[J].AdvancedDrugDeliveryReviews2009,61:940.11. UrryDW,H.,SeitzM,etal.Elastin:arepresentativeidealproteinelastomer.TheRoyalSociety.2002,357:169-184.12. RaucherD,M.I.,BidwellGL.;353.,Thermallytargeteddeliveryofchemotherapeuticsandanti-cancerpeptidesbyelastinlikepolypeptide[J].ExpertOpinDrugDeliv.2008,5(3):.13. KimberlyTrabbic-Carlson,L.A.S.,andAshutoshChilkoti,SwellingandMechanicalBehaviorsofChemicallyCross-LinkedHydrogelsofElastin-likePolypeptides.Biomacromolecules2003,4,572-580.14. Pires,M.M.,Przybyla,D.E.,RubertPerez,C.M.,Chmielewski,J.,Metal-mediatedtandemcoassemblyofcollagenpeptidesintobandedmicrostructures[J]..JAmChemSoc.2011,133(37):14469-14471.1.15. He,M.,Wang,L.,Wu,J.,Xiao,J.,Ln(3+)-MediatedSelf-AssemblyofaCollagenPeptideintoLuminescentBandedHelicalNanoropes[J]..Chemistry.2016,22(б):1914-1917.1. 常德才,弹性蛋白在生物医用材料中的应用.2008.12.2. LeiHuang,R.A.M.,RobertP.Apkarian,BenhamPourdeyhimi,;VincentP.Conticello,a.E.L.C.,GenerationofSyntheticElastin-MimeticSmallDiameterFibersandFiberNetworks.Macromolecules2000,33,2989-2997.3. Homebeck，ElastinandElastases，BocaRaton．,R.W.;Press，；2：169,C.,1989.4. KarnikSK，BrookeBS，Bayes—GenisAS，eta1．,Developmerit，Acriticalroleforelastinsiginvascularmorphogenesisanddisease．.2003；30：411.5. ul．,L.Q.G.K.S.D.e.,Biomaterials，Novelporousaorticelastinandcollagenscaffoldsfortissueengineering．.2004；25：5227.6. CP，,S.S.M.M.B.,Electrospunpolydioxanone—elastinblend：potentialforbioresorbablevasculargrafts．.Biomed．Mater，2006；1：72.7. MR．,L.M.M.M.G.,Electrospunproteinfibersasmatricesfortissueenginering.Biomaterials，2005；26(3O)：5999.8. 张光亚，陈智山，李红春，黄凯宗,类弹性蛋白多肽的分子动力学研究.计算机与应用化学20. 陈榕英,徐.,余江南,类弹性蛋白聚合物(ELPs)水凝胶的药物控释研究进展.药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2011,18(1):085～088,().10. AluriS,J.S.,MackayJA.Environmentallyresponsivepeptidesasanticancerdrugcarriers[J].AdvancedDrugDeliveryReviews2009,61:940.11. UrryDW,H.,SeitzM,etal.Elastin:arepresentativeidealproteinelastomer.TheRoyalSociety.2002,357:169-184.12. RaucherD,M.I.,BidwellGL.;353.,Thermallytargeteddeliveryofchemotherapeuticsandanti-cancerpeptidesbyelastinlikepolypeptide[J].ExpertOpinDrugDeliv.2008,5(3):.1