T-CITS 609-2025 病原宏基因组高通量测序临床检测技术规范

团病原宏基因组高通量测序临床检测技术规范Technicalspecificationsforcl中国检验检测学会发布I 1范围 12规范性引用文件 13术语和定义 14基本要求 24.1结构布局和环境 24.2生物安全防护 24.3设备设施 24.4人员配置 35检测要求 35.1检测方法 35.2样本盘制备 36实验流程 36.1湿实验流程搭建 36.2干实验流程搭建 47性能确认 57.1干实验性能确认 57.2全流程性能确认 57.3性能参数确认 58报告解读 68.1报告内容 68.2病原体物种解读 78.3耐药/毒力基因解读 79质量管理 79.1分析前质量控制 79.2分析中质量控制 89.3分析后质量控制 8附录A(资料性)模拟参考品示例 9附录B(资料性)临床常见标本的mNGS检测适用性及采集建议 参考文献11本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规本文件由中山大学孙逸仙纪念医院和国军标(北京)标准化技术研究院提出。本文件起草单位：中山大学孙逸仙纪念医院、广州市红十字会医院、国军标(北京)标准化技术研究院、中山大学附属第一医院、广州金域医学检验中心有限公司、长沙金域医学检验实潍坊市第二人民医院(潍坊呼吸病医院)、威海市立医院、西安区域医学检验中心、西南医科大学附属医院、新疆维吾尔自治区人民医院、右江民族医学院附属医院、云南省曲靖中心医院(曲靖市第一人民医院)。本文件主要起草人：张寅、张述耀、刘万阳、欧阳能太、林1范围本文件规定了病原宏基因组高通量测序的基本要求、检测要求、实验流程和性能确认等方面的要求。本文件适用于医疗机构、第三方医学检测机构和相关科研机构开展病原宏基因组高通量测序的临床检测活动。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T40458用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范GB/T40974核酸样本质量评价方法WS/T640临床微生物学检验样本的采集和转运3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。能侵犯人、动物，引起其感染甚至传染病的微生物，也称为病原体。[来源：GB/T43429—2023,3.1,有修改]通过对临床标本中提取的核酸进行文库构建、高通量测序及生物信息学分析，检测标本中病原微生物种类及其耐药/毒力基因的技术。对临床标本进行物理、化学或生物学的处理，以获取测序数据的实验室操作过程。利用计算工具和数据库对测序数据进行生物信息学分析，鉴定病原体并解读其生物学意义的过程。通过生物来源、人工合成或克隆技术等所得的一个重建分子群，如基因组文库、互补DNA文库、噬菌体展示肽文库等。2将通过质量控制的非宿主序列与微生物参考数据库比对，或经过从头组装成重叠4.1.2对于不涉及PCR扩增步骤的建库方法，实验4.1.3实验室内应保持干净整洁，减少噪音和振动。对于高洁净度区域及噪音设备，应采取相应的措4.1.4实验室应保持温湿度稳定(温度宜为20℃~25℃,相对湿度宜为40%～60%),特殊仪器和设4.2.2应定期进行清洁消毒和生物安全检查，选用经批准4.2.3废弃物应分类收集处理。所有可能含有病原微生物的废弃物(如标本、耗材、培养物)均应视4.3.1实验设备和器材应满足湿实验、干实验和质量控制的需求，具备合格证明和使用说明书，并按34.3.2宜优先采用自动化设备，投入使用前应对其进行性能确认。对于核酸提取、建库等关键环节，4.4.1应根据标本量、工作流程和班次设置，配备数量充足且具有相应专业背景和技术能力的工作人4.4.2所有人员应通过相关岗位的理论、实操培训和考核，并通过定期能力评估后方可上岗。应保存a)湿实验：具备分子生物学、微生物学或医学检验等相关专业背景与b)干实验：具备生物信息学专业背景的研发及数5.1.1实验室引入病原宏基因组高通量测序检测方法或流程时，应完成全流5.1.2检测方法及实验参数(如核酸投入量、测序深度、生物信息学分析参数等)应经过筛选和验证。经确认的检测方法和实验参数应形成标准操作程序(standardoperationprocedure,SOP)文件，由5.1.3已确认的检测方法及实验参数如有变更，应经过重新验证和性能确认，评估其影响后5.2.1用于性能确认的样本盘应包含模拟参考品和已知病原检测结果的真实临床标本，覆盖临床预期5.2.2模拟参考品应至少包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、分枝杆菌、丝状真菌、酵母、脱氧核糖 (deoxyribonucleicacid,DNA)病毒、核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)病毒及寄生虫等病原微5.2.3应针对样本盘中的代表性病原微生物进行检测限研究，确认其检测性能是否满足预期用途的要5.2.4应根据不同标本类型，合理设置模拟参考品中的人源细胞浓度。模拟参考品示例见附录A。6.1.1.1标本选择应结合患者情6.1.1.2标本的采集、转运和接收应符合WS/T640的要求。6.1.1.3从无菌部位采集标本应严格执行无菌操作。从有菌部位采集标本时，应采取相应的防46.1.2.1宜在标本前处理过程中对病原微生物或其核酸进行富集，可选择正向富集法或反向富集法。6.1.2.2富集方法应经过性能确认，综合考虑标本类型、预期用途、检测性能、成本和操作时效性等。6.1.3.1应综合考虑不同方法对不同病原体核酸的释放效果，可采取物理、化学或酶解等方法联合使用。核酸提取操作应遵循GB/T40458的要求，并制定相应的SOP文件。6.1.3.2手工操作应考虑标本差异、试剂盒效率、纯度及片段大小等因素；自动化核酸提取系统应综合考虑通量、自动化程度和核酸质量等因素。6.1.3.3核酸纯化后应检测其浓度与纯度，质量评价宜遵循GB/T40974的规定。6.1.4文库构建流程6.1.4.1选择建库方法前，应评估核心环节质量(如单/双标签测序、连接效率等),确定核酸投入量范围，并确认构建的文库满足测序与生物信息学分析要求。6.1.4.3制备好的文库应使用生物分析仪、定量聚合酶链式反应(quantitativepolymerasechainreaction,qPCR)或荧光计等方法进行浓度和片段分布的质量评价，并设定明确的质量接受标准。6.1.5高通量测序6.1.5.2条件允许的情况下，可增加测序数据量，并通过数据抽样，模拟分析不同测序数据量、不同物种的LoD,确定不同标本类型的最佳测序数据量。6.2干实验流程搭建6.2.1.1应基于临床预期用途及标本量计算所需要的服务器性能，确定下机数据能够在预期时间内完成分析。6.2.1.2宜优先使用本地服务器进行数据的存储和管理。若选择云端分析系统，应明确数据访问、使用、修改、保密和中止等权限和责任。6.2.1.3应规定数据存储的数量、媒介、位置和储存时限，数据传输过程中应设置只读访问与防篡改监控。6.2.2.1应明确原始数据及FASTQ文件的存储位置与唯一命名规则。6.2.2.2文件命名宜包含数据检测/分析日期、检测实验室名称、标本类型、测序批次及唯一的标本编码等。命名规则应文件化并保持稳定。6.2.3数据预处理6.2.3.1可通过生物信息分析软件评估测序数据质量、总数据量、碱基质量值(Q20和Q30)等，并设定质量控制点。6.2.3.2数据过滤参数宜根据实验室对mNGS检测的敏感性和特异性需求进行调整，如Q30碱基数量占比>75%、有效序列长度≥50bp、含N碱基比例<10%等。6.2.4过滤宿主序列6.2.4.1人源基因序列数据库的构建应参考最新版国际人类参考基因组、转录组、核酸多态性及线粒体，并补充中国人标准基因组序列。6.2.4.2应评估宿主过滤的运行时间、去除效率与非特异性去除(非人源序列而被错误过滤)的序列56.2.5.1应使用近缘物种的基因序列评估分析软件的物种注释准确性。数据库或分析算法有变更时，6.2.5.2选择物种注释工具时，应基于预期用途，评估运行速度、准确率、精确率和召回率等性能。b)确认参考基因组注释的准确性和序列的完整性；c)及时并定期更新数据库(尤其是RNA病毒),更新后应重新进行性能验证；d)每年对微生物数据库进行全面审核，审核内容包括新发病原体的纳入、分类6.2.7.1宜将每百万测序读长中匹配到病原微生物基因组的特异读长作6.2.7.2RPM可用于同一标本中不同病原体之间的半定量比较，不可作为不同标本间病原微生物核酸6.2.7.3.1应明确每次测试所使用的软件及数据库的版本，并率和F1-Score等指标。a)临床标本测序数据：注释充分、特征明确的临床标本测序数据(FASTQ或其他格式)。7.2.2全流程性能确认应至少包括革兰色等)作为参比方法，必要时，可采用一代测序进行复核。67.3.1.2选取5例阴性标本，5例阳性标本，与参比方法平行检测，计算方法符合率。方法符合率按照公式(1)计算：A=(B-C)×100% (1)选取同属内近源物种(如屎肠球菌和粪肠球菌、白色念珠菌和热带念珠菌、纹菌等),将其按照一定比例进行混合测序，统计近源物种的检出情况、读长比例、相对丰度与预期一致7.3.3.1批内精密度：使用相同批次试剂，在同一批次内对阳性参考品进行不少于3次的全流程重复7.3.3.2批间精密度：用2个不同批次的试剂，在3d内各完成参考品的3次全流程重复检测。所有7.3.4.2总检测标本数应不少于20例，包含一定数量的经参比方法确认的阳性标本和阴性标本(如6例阳性参考品，每例≥4种微生物；14例临床标本，≥10例培养阳性)。7.3.4.4对于检测结果与参考结果不一致的标本，应进行复核并分析原因。7.3.5.1应针对不同标本类型，在相应宿主核酸背景浓度下评估病原体的LoD,以95%的重复检出某一7.3.5.2宜使用阳性参考品进行梯度稀释，在拟定的LoD浓度水平，进行不少于5次的重复测定，或在不同批次内进行20次重复测定。7.3.5.35次重复检测应全部检出靶核酸，或20次检测应至少检出19次靶核酸，方可确认该浓度为将投入5倍～10倍LoD病原体的临床模拟标本，在不同条件下(如在4℃、-20℃下分别保存1d、4d、7d,在-80℃下分别进行1次、2次冻融)进行检测，所有重复检测均应检出目标病原体。7.3.7.1在投入3倍～5倍LoD病原体的临床模拟标本中，分别加入更高浓度的宿主细胞，每份标本重复检测2次～3次。7.3.7.2通过试验确定在该检测体系下，弱阳性病原体能够被稳定检出时所允许的最高宿主核酸背景(可通过内标序列的RPM值来间接衡量)。此阈值可用于临床报告的解读提示。7病原体mNGS检测报告应清晰、准确，并至少包含以下内容：a)患者基本信息与唯一性标识；b)标本信息：类型、采集日期、接收日期；c)检测方法：明确为“病原宏基因组高通量测序”;d)检测结果：以列表形式清晰展示检出的病原微生物，包含中文名称、拉丁文名、唯一比对的特异读长数、相对丰度等信息；e)关键质量指标：如下机总数据量、Q30比例、宿主序列去除比例等；f)生物信息学分析所用软件与数据库版本；g)解读与注释：对结果进行必要的临床注释，提示可能的污染菌、定植菌，并对特殊病原体进行h)报告日期、报告人及审核人签字。8.2病原体物种解读8.2.1检出法定的甲类、乙类参照甲类管理的传染病病原体，或其它烈性传染病病原体时，实验室应a)核实下机数据的质量(包括特异性序列、读长数、基因组覆盖度等);b)排除背景核酸污染及特异性序列比对错误；c)启动复核程序；d)立即上报实验室负责人，并依法依规通知临床医护人员和医院感染管理部门。8.2.2对于无菌部位(如脑脊液、血液、胸水、腹水、关节液、活检组织等)的标本，检出任何病原微生物(除有明确证据表明为污染外),均应视为具有高度临床意义，应报告为“检出XX菌”或“可疑致病微生物”;报告时应提供支持该病原体存在的关键指标，如特异性序列数、基因组覆盖度等。8.2.3对于开放性腔道或存在正常菌群/定植菌部位(如呼吸道、肠道、皮肤伤口表面)的标本，检出条件致病微生物时，应谨慎区分感染与定植或污染。解读时应综合考量多项指标，包括但不限于：a)微生物序列数据：如特异读长数、相对丰度(在该标本所有检测出的微生物中的占比)、基因组覆盖度与均匀度；b)标本质量：如宿主核酸含量、内标检出情况；c)临床信息：如患者的临床症状、影像学检查、其他微生物学检查结果(如培养、涂片)及对治疗的反应；d)对于解读困难的病例，应组织微生物、感染、影像、临床等相关专业人员进行多学科会诊。8.3耐药/毒力基因解读8.3.1当报告耐药基因或毒力基因时，应明确注明其为“基因型”检测结果，并谨慎解读。8.3.2耐药基因的检出提示病原体存在潜在耐药机制，应注意基因型与表型可能不一致的情况(如基因未表达、新突变等)。8.3.3毒力基因的检出提示该病原体可能具备相应的致病潜力，其在实际感染中的表达和作用应结合临床情况综合判断。8.3.4若临床有药敏实验需求，应以表型药敏实验结果为最终治疗依据。mNGS检测出的耐药基因可作为重要补充信息。9质量管理9.1分析前质量控制9.1.1应建立标本采集与送检SOP文件，明确规范标本选择、采集时机和方式、容器/耗材、标本量、送检单信息及运送保存条件等。9.1.2实验室应通过稳定性研究或引用权威依据，明确不同标本类型的允许保存条件和运输时限。9.1.3应建立临床标本接收与前处理的SOP文件，对标本的性状(如澄清度、黏稠度、是否带血、泄漏等)、运输容器、运输时长与温度等设定明确的接收和拒收条件。9.1.4应建立试剂、耗材(包括批次、分装和储存时间等)及设备日常维护和校准的质量控制文件。89.2.1应建立核酸提取、文库、测序数据的质量控制要求，明确室内质量控制规则。每一次临床检测9.2.2阴性质控品应使用不