5年（2021-2025）山东高考生物真题分类汇编：专题17 基因工程（解析版）

专题17基因工程

五年考情考情分析

基因工程2025年山东卷第25题近五年山东高考生物试卷，基因工程考点

2024年山东卷第13题考查频繁。重点考查基因工程的基本工具，如

2024年山东卷第25题限制酶、DNA连接酶；基本操作程序，像目

2023年山东卷第25题的基因获取、表达载体构建等，常结合实际案

2022年山东卷第13题例，考查学生知识运用与分析能力。题目难度

2022年山东卷第25题系数大；其中启动子的插入位点和插入方向、

2021年山东卷第13题报告基因的表达等都需要学生有很强的理解

2021年山东卷第25题信息、获取信息的能力、以及综合运用知识解

决问题的科学思维和科学探究能力，通过基因

工程考查学生的结构与功能观。

一、单选题

1．（2024·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法正确的是（）

A．整个提取过程中可以不使用离心机

B．研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，应充分摇匀再倒入烧杯中

C．鉴定过程中DNA双螺旋结构不发生改变

D．仅设置一个对照组不能排除二苯胺加热后可能变蓝的干扰

【答案】A

【难度】0.65

【知识点】DNA的粗提取及鉴定

【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成

分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可

以将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的;②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋

白质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离;③在沸水浴的条件

下DNA遇二苯胺会呈现蓝色。

【详解】A、在DNA的粗提取与鉴定实验中，可将获得的研磨液用纱布过滤后，在4℃的

冰箱中放置几分钟，再取上清液，也可以直接将研磨液用离心机进行离心后取上清液，A正

确；

B、研磨液在4℃冰箱中放置几分钟后，DNA在上清液中，应取上清液倒入烧杯中，B错误；

C、鉴定过程中用沸水浴加热，DNA双螺旋结构会发生改变，C错误；

D、加入二苯胺试剂后沸水浴处理的时间要在5分钟以上，且要等到冷却后再观察结果，这

样才可以观察到较为明显的显色反应，仅设置一个对照组可以排除二苯胺加热后可能变蓝的

干扰，D错误。

故选A。

2．（2022·山东·高考真题）关于“DNA的粗提取与鉴定”实验，下列说法错误的是（）

A．过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA降解

B．离心研磨液是为了加速DNA的沉淀

C．在一定温度下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色

D．粗提取的DNA中可能含有蛋白质

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】DNA的粗提取及鉴定

【分析】DNA的粗提取与鉴定的实验原理是：①DNA的溶解性，DNA和蛋白质等其他成

分在不同浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同，利用这一特点可以选择适当浓度的盐溶液可以

将DNA溶解或析出，从而达到分离的目的；②DNA不溶于酒精溶液，细胞中的某些蛋白

质可以溶解于酒精，利用这一原理可以将蛋白质和DNA进一步分离；③在沸水浴的条件下

DNA遇二苯胺会呈现蓝色。

【详解】A、低温时DNA酶的活性较低，过滤液沉淀过程在4℃冰箱中进行是为了防止DNA

降解，A正确；

B、离心研磨液是为了使细胞碎片沉淀，B错误；

C、在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺试剂呈现蓝色，C正确；

D、细胞中的某些蛋白质可以溶解于酒精，可能有蛋白质不溶于酒精，在95%的冷酒精中与

DNA一块儿析出，故粗提取的DNA中可能含有蛋白质，D正确。

故选B。

3．（2021·山东·高考真题）粗提取DNA时，向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，

过滤后所得滤液进行下列处理后再进行过滤，在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出

DNA相对含量较高的白色丝状物的处理方式是（）

A．加入适量的木瓜蛋白酶

B．37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟

C．加入与滤液体积相等的、体积分数为95%的冷却的酒精

D．加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0．14mol/L

【答案】A

【难度】0.85

【知识点】DNA的粗提取及鉴定

【分析】DNA粗提取和鉴定的原理：（1）DNA的溶解性：DNA和蛋白质等其他成分在不

同浓度NaCl溶液中溶解度不同；DNA不溶于酒精溶液，但细胞中的某些蛋白质溶于酒精；

DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性。（2）DNA的鉴定：在沸水浴的条件下，DNA遇二苯

胺会被染成蓝色。

【详解】A、木瓜蛋白酶可以水解DNA中的蛋白质类杂质，由于酶具有专一性，不能水解

DNA，过滤后在得到的滤液中加入特定试剂后容易提取出DNA相对含量较高的白色丝状

物，A正确；

B、37～40℃的水浴箱中保温10～15分钟不能去除滤液中的杂质，应该放在60~75℃的水

浴箱中保温10～15分钟，使蛋白质变性析出，B错误；

C、向鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水并搅拌，过滤后在得到的滤液中加入与滤液体积相

等的、体积分数为95%的冷却的酒精，此时DNA析出，不会进入滤液中，C错误；

D、加入NaCl调节浓度至2mol/L→过滤→调节滤液中NaCl浓度至0．14mol/L，DNA

在0．14mol/L的NaCl溶液中溶解度小，DNA析出，不会进入滤液中，D错误。

故选A。

【点睛】

二、解答题

4．（2025·山东·高考真题）种子休眠是抵御穗发芽的一种机制。通过对Ti质粒的改造，利用

农杆菌转化法将Ti质粒上的T-DNA随机整合到小麦基因组中，筛选到2个种子休眠相关基

因的插入失活纯合突变体。与野生型相比，突变体种子的萌发率降低。小麦基因组序列信息

已知。

(1)Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关的结构为。选用图甲中的SmaI对抗除草

剂基因X进行完全酶切，再选择SmaI和对Ti质粒进行完全酶切，将产生的黏性末端

补平，补平时使用的酶是。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基因X的片段

与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌；经卡那霉素筛选并提取

质粒后再选用限制酶进行完全酶切并电泳检测，若电泳结果呈现一长一短2条带，较

短的条带长度近似为bp，则一定为正向重组质粒。

(2)为证明这两个突变体是由于T-DNA插入到小麦基因组中同一基因导致的，提取基因组

DNA，经酶切后产生含有T-DNA的基因组片段（图乙）。在此酶切过程中，限于后续PCR

难以扩增大片段DNA，最好使用识别序列为（填“4”“6”或“8”）个碱基对的限制酶，

且T-DNA中应不含该酶的酶切位点。需首先将图乙的片段，才能利用引物P1和P2

成功扩增未知序列。PCR扩增出未知序列后，进行了一系列操作，其中可以判断出2条片

段的未知序列是否属于同一个基因的操作为（填“琼脂糖凝胶电泳”或“测序和序列比

对”）。

(3)通过农杆菌转化法将构建的含有野生型基因的表达载体转入突变植株，如果检测到野生

型基因，（填“能”或“不能”）确定该植株的表型为野生型。

【答案】(1)复制原点XbaIDNA聚合酶SmaI和SpeI550bp

(2)4环化测序和序列比对

(3)不能

【难度】0.15

【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目

的基因的检测与鉴定

【分析】基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、

终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞；

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否

插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；

③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术；个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗

病鉴定、活性鉴定等。

【详解】（1）DNA复制的起点是复制原点，因此Ti质粒上与其在农杆菌中的复制能力相关

的结构为复制原点。根据SmaI限制酶识别序列可知，酶切形成的是平末端，若质粒仅用SmaI

酶切，抗除草剂基因和质粒可以正向接入也可以反向接入，且无法区分，为了确定是否是正

向重组质粒，因此在构建重组质粒时需要用到另一种限制酶，抗除草剂因需要插入到启动子

和终止子之间，因此不能选择BamHI，因为该限制酶会破坏终止子，因此可选择XbaI和SmaI

进行酶切，XbaI酶切会形成黏性末端，需要用DNA聚合酶聚合脱氧核糖核苷酸单体将产生

的黏性末端补平（可使重组质粒最小，同时PstI酶切后产生的黏性末端无法用DNA聚合酶

抹平，因为DNA聚合酶只能从3'延伸子链）。利用DNA连接酶将酶切后的包含抗除草剂基

因X的片段与酶切并补平的Ti质粒进行连接，构建重组载体，转化大肠杆菌。重组的T-DNA

片段上含有一个SmaI酶切位点和一个SpeI酶切位点，可以选择用SmaI和SpeI进行酶切，

转录的方向是从模板的3'→5'，和质粒对应的方向相同，经过两种酶的酶切后并电泳呈现一

长一短2条带，较短的条带长度近似为550bp，若反向接，较短的条带长度近似为200bp。

（2）由于后续PCR难以扩增大片段DNA，所以最好选择识别序列为4个碱基的限制酶，

原因是识别序列越短，酶切位点越多，切割产生的片段可能越小，更有利于后续的PCR扩

增。由于引物是根据已知序列设计的，但此时需要扩增未知序列，因此可以将图乙的片段环

化，这样就可以利用现有引物扩增出未知序列。为了确定未知序列是否是同一基因，需要准

确比对其上的碱基序列，因此对同一个基因的操作为测序和序列比对。

（3）突变植株成功导入野生型基因，但野生型基因未必可以正常表达，因此不能确定该植

株的表型为野生型。

5．（2024·山东·高考真题）研究发现基因L能够通过脱落酸信号途径调控大豆的逆境响应。

利用基因工程技术编辑基因L，可培育耐盐碱大豆品系。在载体上的限制酶BsaI切点处插

入大豆基因L的向导DNA序列，将载体导入大豆细胞后，其转录产物可引导核酸酶特异性

结合基因组上的目标序列并发挥作用。载体信息、目标基因L部分序列及相关结果等如图

所示。

(1)用PCR技术从大豆基因组DNA中扩增目标基因L时，所用的引物越短，引物特异性越

（填“高”或“低”）。限制酶在切开DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI

酶切大豆基因组DNA，理论上可产生的黏性末端最多有种。载体信息如图甲所示，

经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'--3'和5'--3'。

(2)重组载体通过农杆菌导入大豆细胞，使用抗生素筛选到具有该抗生素抗性的植株

①～④。为了鉴定基因编辑是否成功，以上述抗性植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标

基因L，部分序列信息及可选用的酶切位点如图乙所示，PCR产物完全酶切后的电泳结果如

图丙所示。据图可判断选用的限制酶是，其中纯合的突变植株是（填序号）。

(3)实验中获得1株基因L成功突变的纯合植株，该植株具有抗生素抗性，检测发现其体细

胞中只有1条染色体有T-DNA插入。用抗生素筛选这个植株的自交子代，其中突变位点纯

合且对抗生素敏感的植株所占比例为，筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。

【答案】(1)低2565'-CAAT-3'5'-GTTT-3'

(2)卡那霉素SacⅠ④

(3)1/4

【难度】0.65

【知识点】基因分离定律的实质和应用、DNA重组技术的基本工具、目的基因的检测与鉴

定

【分析】【关键能力】

（1）信息获取与加工

题干关键信息所学知识信息加工

BsaI切割产生的黏性末端是

黏性末端的种类基因工程的工具NNNN，四个碱基最多可能有256

种排列顺序

重组载体通过农杆菌导入大豆细

胞当中的片段包含了卡那霉素抗

目的基因的检测与鉴

抗生素筛选性基因，因此可以通过使用卡那

定

霉素筛选到具有该抗生素抗性的

植株

（2）逻辑推理与论证

【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，用于PCR

的引物长度通常为20~30个核苷酸。由此可知，在利用PCR技术从大豆基因组DNA中扩

增目的基因时，所用的引物越短，则引物的特异性就越低。根据题意可知，限制酶在切开

DNA双链时，形成的单链突出末端为黏性末端，若用BsaI酶切大豆基因组DNA，图中给

出的只是载体信息，大豆基因组无法从图中看出。只能根据理论来推测，BsaI切割产生的

黏性末端是NNNN，四个碱基最多可能有256种排列顺序，故答案应为256。根据图甲所

示的载体信息，经BsaI酶切后，载体上保留的黏性末端序列应为5'-CAAT-3'、5'-GTTT-3'。

（2）根据图示信息可知，重组载体通过农杆菌导入大豆细胞当中的片段包含了卡那霉素抗

性基因，因此可以通过使用卡那霉素筛选到具有该抗生素抗性的植株。根据图甲可知，目标

基因L的目标序列跟突变序列之间的差异只有在SacⅠ酶切位点上存在差异，BamHⅠ和EcoR

Ⅰ这两个酶切位点完全相同，根据图丙及题意可知，所展示的电泳结果可知，要以上述抗性

植株的DNA为模板，通过PCR扩增目标基因L，并对PCR产物完全酶切后进行电泳从而

判断植株含有的是目标序列还是突变序列，因此只能选用限制酶SacⅠ，限制酶SacⅠ在突变

序列存在酶切位点，但是目标序列没有，因此经过该酶酶切后突变序列的电泳条带会出现两

条，目标序列是一条带，根据图丙结果可知，只有④为纯和突变的植株。

（3）根据题意可知，在实验当中获得了一株基因l成功突变的纯合之中，已知该植株具有

抗生素抗性，经过检测发现其体细胞中只有一条染色体含有T-DNA插入。根据图示可知，

抗生素抗性基因在T-DNA片段上，因此如果用抗生素来筛选该植株进行自交，可知其配子

中含有抗生素抗性基因的比例为1/2，不含T-DNA（对抗生素敏感）的配子比例为1/2，因

此突变位点纯合且对抗生素敏感的植株所占比例应该为1/2×1/2=1/4，纯突变位点纯合且具

有抗生素抗性的植株所占比例应该为3/4，可以筛选出的敏感植株可用于后续的品种选育。

6．（2023·山东·高考真题）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，

该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。

(1)与图甲中启动子结合的酶是。除图甲中标出的结构外，作为载体，质粒还

需具备的结构有（答出2个结构即可）。

(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若

仅用一对引物，应选择图甲中的引物。已知J基因转录的模板链位于b链，由

此可知引物F1与图甲中J基因的（填“a链”或“b链”）相应部分的序列相同。

(3)重组质粒在受体细胞内正确表达后，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测相应蛋白是否

表达以及表达水平，结果如图乙所示。其中，出现条带1证明细胞内表达了，条

带2所检出的蛋白（填“是”或“不是”）由重组质粒上的J基因表达的。

【答案】(1)RNA聚合酶限制酶切割位点、标记基因、复制原点等

(2)F2和R1或F1与R2

a链

(3)J-V5融合蛋白不是

【难度】0.65

【知识点】PCR扩增的原理与过程、DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建、目

的基因的检测与鉴定

【分析】基因工程的关键步骤是构建基因表达载体，基因表达载体主要由启动子、目的基因、

标记基因和终止子组成，其中标记基因用于筛选重组DNA分子，可以是四环素、氨苄青霉

素等抗性基因，也可以是荧光蛋白基因或产物能显色的基因。

【详解】（1）基因表达载体的构建启动子是为了启动下游基因的“表达”，表达首先需要转录，

因此RNA聚合酶识别和结合的部位才是转录的起始。作为运载体必须具备的条件：①要具

有限制酶的切割位点；②要有标记基因（如抗性基因），以便于重组后重组子的筛选；③能

在宿主细胞中稳定存在并复制；④是安全的，对受体细胞无害，而且要易从供体细胞分离出

来，图中甲有启动子和终止子等，因此质粒还需具备的结构有限制酶的切割位点、标记基因、

复制原点等。

（2）据图甲可知，引物F2与R1或F1与R2结合部位包含J基因的碱基序列，因此推测为了

确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，进行PCR检测时，若仅用一对引物，应选择图

甲中的引物F2和R1或F1与R2。b是模板链，而根据图上启动子和终止子的位置可知转录方

向是图上从左向右，对应的模板链方向应该是3’-5'，非模板链（也就是a链）是5'-3'；考虑

到DNA复制的方向是子链的5’-3'，引物基础上延伸的方向肯定是5'-3'，所以引物结合的单

链其方向是3'-5'；图中F1是前引物，在左侧，所以其配对的单链是3’-5'的b链，故其序列

应该与a链相应部分的序列相同。

（3）据图乙可知，用抗J蛋白抗体和抗V5抗体分别检测，均出现条带1，说明条带1是J-V5

融合蛋白。抗J蛋白抗体检测出现条带2，抗V5抗体检测不出现条带2，说明条带2所检

出的蛋白不是由重组质粒上的融合的J基因表达的。

7．（2022·山东·高考真题）某种类型的白血病由蛋白P引发，蛋白UBC可使P被蛋白酶识

别并降解，药物A可通过影响这一过程对该病起到治疗作用。为探索药物A治疗该病的机

理，需构建重组载体以获得融合蛋白FLAG-P和FLAG-P△。P△是缺失特定氨基酸序列的P，

FLAG是一种短肽，连接在P或P△的氨基端，使融合蛋白能与含有FLAG抗体的介质结合，

但不影响P或P△的功能。

(1)为构建重组载体，需先设计引物，通过PCR特异性扩增P基因。用于扩增P基因的引物

需满足的条件是、为使PCR产物能被限制酶切割，需在引物上添加相应的限制酶识

别序列，该限制酶识别序列应添加在引物的（填“3'端”或“5'端”）。

(2)PCR扩增得到的P基因经酶切连接插入载体后，与编码FLAG的序列形成一个融合基因，

如图甲所示，其中“ATGTGCA”为P基因编码链起始序列。将该重组载体导入细胞后，融合

基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，但P基因

对应的氨基酸序列与P不同。据图甲分析，出现该问题的原因是。修改扩增P基因

时使用的带有EcoRⅠ识别序列的引物来解决该问题，具体修改方案是。

(3)融合蛋白表达成功后，将FLAG-P、FLAG-P△、药物A和UBC按照图乙中的组合方式

分成5组。各组样品混匀后分别流经含FLAG抗体的介质，分离出与介质结合的物质并用

UBC抗体检测，检测结果如图丙所示。已知FLAG-P和FLAG-P△不能降解UBC，由①②③

组结果的差异推测，药物A的作用是；由②④组或③⑤组的差异推测，P△中缺失的

特定序列的作用是。

(4)根据以上结果推测，药物A治疗该病的机理是。

【答案】(1)能与P基因母链的一段碱基序列互补配对、短单链核酸

5'端

(2)P基因编码链的第一个碱基与EcoRⅠ识别序列的最后两个碱基编码一个氨基酸，导

致mRNA的密码子被错位读取。

在引物中的EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱基

(3)增强FLAG-P与UBC的结合参与P与UBC的结合

(4)药物A通过增强P与UBC结合促进P降解。

【难度】0.15

【知识点】遗传信息的转录、遗传信息的翻译、PCR扩增的原理与过程、目的基因的检测

与鉴定

【分析】PCR过程：①变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链；②温度

下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；③延伸：当温度上

升到72℃左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互

补配对原则合成新的DNA链。

【详解】（1）引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核苷酸，因此

设计扩增P基因的引物，需要两种引物分别与两条模板链3'端的碱基序列互补。DNA聚合

酶延伸时，是将脱氧核苷酸加到引物的3'端，为了不破坏目的基因，该限制酶识别序列应添

加在引物的5'端。

（2）融合基因转录出的mRNA序列正确，翻译出的融合蛋白中FLAG的氨基酸序列正确，

但P基因对应的氨基酸序列与P不同，说明P基因翻译时出错。由图可看出，在转录出的

mRNA中，限制酶识别序列对应的最后两个碱基与P基因对应的第一个碱基构成一个密码

子，导致读码框改变，翻译出的氨基酸序列改变，可通过在EcoRⅠ识别序列3'端添加1个碱

基，使其碱基数目加上FLAG的碱基数目为3的倍数，这样能保证P基因转录出的mRNA

上的读码框不改变，能够正常翻译。

（3）①组仅添加UBC，处理后，用UBC抗体检测，不出现杂交带；②组添加UBC和FLAG-P，

出现杂交带；③组添加UBC、药物A和FLAG-P，杂交带更加明显，说明药物A的作用是

促进UBC与FLAG-P的结合。由②④组或③⑤组的差异在于②③组使用FLAG-P，出现杂

交带；④⑤组使用FLAG-P△，不出现杂交带，据此推测P△中缺失的特定序列是与UBC

结合的关键序列。

（4）根据（3）的分析推测，药物A促进UBC与FLAG-P的结合，从而促进蛋白P被蛋白

酶识别并降解，达到治疗的目的。

【点睛】本题难点在于分析翻译出错的原因，需要结合翻译相关知识对图进行仔细分析方可

得出结论。

8．（2021·山东·高考真题）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，

该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ

基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长

度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结

合位点的具体位置。相关信息如图所示。

（1）为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识

别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是，在R末端添加的

序列所对应的限制酶是。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要

种酶。

（2）将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩

增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。

含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是。

（3）向培养液中添加适量的雌激素，含F1～F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，而

含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光。若γ基因上游调控序列上与引物序列所对应

的位置不含有BCL11A蛋白的结合位点序列，据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位

于，理由是。

【答案】SalIEcoRI6F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋白

基因不表达引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上根据有无荧

光情况判断，F1～F4与R扩增产物上均有结合位点，因此结合位点位于F4所对应调控

序列的下游（右侧）；F5～F6与R扩增产物上均无结合位点，可知结合位点位于F5所对

应调控序列的上游（左侧），所以结合位点位于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之

间的区段上

【难度】0.4

【知识点】DNA重组技术的基本工具、基因表达载体的构建

【分析】1、据题意可知，科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，据图中注释可知，F1~F7

以及R位置均为引物，故扩增的序列分别是引物F1和引物R之间的序列，引物F2和引物

R之间的序列，引物F3和引物R之间的序列，引物F4和引物R之间的序列，引物F5和引

物R之间的序列，引物F6和引物R之间的序列，引物F7和引物R之间的序列；

2、据图中对限制酶的注释可知，限制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识

别并切割后的黏性末端相同，限制酶XhoⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶SalⅠ识别并

切割后的黏性末端相同。

【详解】（1）据题意可知，需要将扩增后的产物定向插入并指导荧光蛋白基因的表达，则含

有启动子的扩增后的产物读取方向与荧光蛋白基因的读取方向一致，故扩增后的产物中的R

端与荧光蛋白基因中限制酶MunⅠ识别序列端结合，才能保证扩增后的产物定向插入并指

导荧光蛋白基因的表达。要做到定向插入，需要引物末端两端添加限制酶的识别序列，且被

限制酶识别并切割后，两端的黏性末端不能相同。而扩增后的产物中可能含有MunⅠ和Xho

Ⅰ的识别位点，故在引物末端添加限制酶的识别序列不能被限制酶MunⅠ和XhoⅠ所识别，

故应该选用添加限制酶EcoRⅠ和限制酶SalⅠ识别序列，据图中对限制酶的注释可知，限

制酶MunⅠ识别并切割后的黏性末端与限制酶EcoRⅠ识别并切割后的黏性末端相同，故R

末端添加的序列所对应的限制酶是EcoRⅠ，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是

SalⅠ；荧光蛋白基因中含有限制酶EcoRⅠ的识别位点，故对载体使用限制酶MunⅠ和Xho

Ⅰ切割。综上所述，对载体使用限制酶MunⅠ和XhoⅠ切割，对扩增后的产物用限制酶EcoR

Ⅰ和限制酶SalⅠ识别序列，然后在DNA连接酶的催化作用下，连接形成重组载体；产物

扩增中需要使用Taq酶催化，合成更多的产物，故从产物扩增到载体构建完成的整个过程共

需要6种酶，分别是Taq酶、限制酶EcoRⅠ、限制酶SalⅠ、限制酶MunⅠ、限制酶XhoⅠ、

DNA连接酶；

（2）受体细胞中已经除去BCL11A基因，故扩增产物中的BCL11A蛋白结合位点，不会

抑制荧光蛋白基因的表达；基因的表达需要RNA聚合酶与启动子结合，才能完成荧光蛋白

基因的转录过程；含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7

与R扩增产物的受体细胞无荧光，则可能是F7与R扩增产物不含完整的启动子，荧光蛋

白基因不表达；

（3）向培养液中添加适量的雌激素，此时重组载体上的BCL11A基因表达，产生BCL11A蛋

白，BCL11A蛋白与BCL11A蛋白结合位点结合后，导致荧光蛋白基因被抑制；含F1～

F4与R扩增产物的受体细胞不再有荧光，则说明BCL11A蛋白结合位点结合后在引物F4

与引物R之间的序列上；含F5～F6与R扩增产物的受体细胞仍有荧光，则说明BCL11A

蛋白结合位点结合后在引物F5的上游序列，故据此结果可推测，BCL11A蛋白结合位点位

于引物F4与F5在调控序列上所对应序列之间的区段上。

【点睛】对基因工程中PCR技术的掌握，对基因工程的第二步，基因表达载体的构建的过

程的分析，双酶切法的应用，限制酶的作用和切割特点，是解决本题的关键。

一、单选题

1．（2025·山东潍坊·三模）融合PCR技术采用具有互补末端的引物，形成具有重叠链的PCR

产物，通过PCR产物重叠链的延伸，从而将不同来源的任意DNA片段连接起来（如图）。

下列说法错误的是（）

A．基因甲至少经3个循环才能获得含引物P2的双链等长DNA

B．不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系

C．图中融合PCR第一步的两条链重叠部位可互相作为另一条链的引物

D．经融合PCR获得64个融合基因至少消耗63个引物P4

【答案】D

【难度】0.65

【知识点】PCR扩增的原理与过程

【分析】PCR是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）

时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左

右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实

际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。

【详解】A、我们根据PCR扩增后的产物类型分类可知，构成DNA的两条链的长度不同，

将PCR技术中的DNA分成三种（第一种是：两条链都是最短的（即等长的DNA）；第二种

是：最长的+中长的；第三种是：中长的+最短的；那么要求等长的DNA的数量，我们就用

n轮后产生的所有DNA的数量减掉第二种和第三种情况的DNA的数量即可，而第二中和

第三种都含有中长的链，所有我们只要找到中长链的数量即可。在第一次复制完成后，中长

的有2个，在第二次复制完成后，中长的有2+2个，在第三次复制完成后，中长链有2+2+2

个，那么，n次复制完成后共有2+2+2+2+2+2+2+2+2............=2n，既为n个2相加，也就是

经过n次复制后，不符合要求的（就是两条链不等长的DNA）共有2n个，而总的DNA为

2n，所有经过n轮循环后，等长的DNA为2n-2n＞0，即n≥3，所以基因甲至少经3个循环

才能获得含引物P2的双链等长DNA，A正确；

B、在融合PCR技术里，甲基因扩增依赖引物P1、P2，乙基因扩增依赖引物P3、P4。不

同基因扩增所需引物特异性结合各自模板链，且反应条件（如引物与模板的适配性等）有

差异，若放同一反应体系，引物间易相互干扰（P2和P3存在互补序列），无法精准、高效

完成甲、乙基因各自扩增，所以不能为提高扩增效率把四种引物同时加入一个扩增体系，B

正确；

C、结合图示可知，融合PCR的第一步两条链重叠部位即互补配对，可互为另一条链的引物，

C正确；

D、若融合PCR获得了64个融合基因，引物数目和新合成的子链数目相同，即该过程消耗

了64×2-2=126个引物，该过程消耗了126÷2=63个引物P4，但在融合PCR的第一步前还进

行了一次利用引物P4扩增DNA链的过程，所以该过程共消耗了引物63+1=64个，D错误。

故选D。

2．（2025·山东临沂·三模）下列有关“DNA粗提取与鉴定”、“DNA片段的扩增及电泳鉴定”

实验的叙述，错误的是（）

A．设置一组加二苯胺但是不加DNA的对照组用来排除二苯胺受热变蓝的可能

B．提取到的白色丝状物直接与一定浓度的二苯胺溶液混合，沸水浴5min后变蓝

C．电泳实验中待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时停止电泳

D．琼脂糖凝胶中加入核酸染料，便于在300nm的紫外灯下检测扩增产物

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】DNA的粗提取及鉴定的方法

【分析】DNA不溶于酒精，而某些蛋白质溶于酒精；鉴定DNA时，需要先将DNA溶解在

NaCl溶液中，再与二苯胺溶液混合，并在水浴加热条件下呈现蓝色。

【详解】A、设置对照组的目的是为了排除二苯胺试剂本身或其他实验条件可能产生的颜色

变化，从而确保实验结果的特异性，A正确；

B、将丝状物溶于2moL的5mL的NaCl溶液中，然后向试管中加入4mL的二苯胺试剂，沸

水浴加热5min，试管冷却后溶液呈现蓝色，B错误；

C、电泳缓冲液加入电泳槽，待指示剂前沿迁移至凝胶边缘时停止电泳，C正确；

D、在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化，稍冷却后加入适量核酸染料混匀，便于在300nm

的紫外灯下检测扩增产物，D正确。

故选B。

3．（2025·山东济南·二模）毕赤酵母是一种能直接利用甲醇的微生物，其含有的醇氧化酶基

因(AOX1)强效启动子在甲醇存在时被激活，可以驱动外源基因的高效表达。人体蛋白

MT1-MMP定位在细胞膜上，并在多种肿瘤中被高表达出，MT1-MMP能促进肿瘤转移。为

进一步研究肿瘤转移机制，科研人员将MT1-MMP基因转化至毕赤酵母，先将转基因个体

进行低密度发酵，然后再进行高密度发酵，最终获得目标蛋白。下列相关说法正确的是（）

A．转基因毕赤酵母和大肠杆菌作为发酵菌种都具有发酵周期短的优点

B．目标蛋白的产量受发酵培养基成分、甲醇、温度、pH的影响

C．可将MT1-MMP基因插入AOX1中以便通过甲醇调控基因表达

D．甲醇的作用是作为碳源和氮源以及诱导目标蛋白的表达

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】遗传信息的翻译、基因表达载体的构建、发酵工程的基本环节

【分析】微生物发酵受温度、pH、溶解氧以及发酵培养基的成分等的影响。

【详解】A、大肠杆菌是原核生物，无法对合成的目标蛋白进行加工，不能作为该实验的目

标菌种，A错误；

B、发酵培养基的成分可以提供微生物生长和代谢所需的营养物质，甲醇可以激活醇氧化酶

基因强效启动子从而影响目标蛋白的表达，温度和pH会影响微生物细胞内酶的活性，进而

影响微生物的代谢，所以发酵培养基成分、甲醇、温度、pH均会影响目标蛋白的产量，B

正确；

C、将MT1-MMP基因插入AOX1中会破坏醇氧化酶基因AOX1的结构，应该将MT1-MMP

基因插入含有AOX1强效启动子的载体上，这样在甲醇存在时，AOX1启动子被激活，从

而驱动MT1-MMP基因高效表达，C错误；

D、甲醇含有的是C、H、O元素，不含氮元素，因此甲醇无法作为氮源，D错误。

故选B。

4．（2025·山东青岛·二模）CRISPR/Cas9系统包含向导RNA（gRNA）和核酸酶Cas9，可以

对哺乳动物细胞进行基因组编辑。编辑时，Cas9蛋白在gRNA的引导下，结合基因组的特

定位点并进行切割。科研人员利用图中gRNA和Cas9共表达质粒，对体外培养的小鼠细胞

中A基因的表达进行调控。下列说法错误的是（）

A．可以依据A基因的部分序列设计共表达质粒中的编码gRNA序列

B．编码gRNA的序列需要整合到受体细胞基因组DNA上才能发挥作用

C．导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基筛选受体细胞

D．用抗原—抗体杂交技术检测结果为部分细胞A蛋白表达量降低

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】基因表达载体的构建、目的基因的检测与鉴定、基因工程的操作程序综合

【分析】1、CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别

并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶

基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA

错误结合而出现脱靶现象。

2、Ti质粒是农杆菌中的一种质粒，其上有T-DNA，把目的基因插入Ti质粒的T-DNA中是

利用了T-DNA可转移至受体细胞并整合到受体细胞染色体DNA分子上。

【详解】A、由图知，gRNA序列中插入了A基因片段，故可以依据A基因的部分序列设计

共表达质粒中的编码gRNA序列，A正确；

B、编码gRNA的序列不需要整合到受体细胞基因组DNA上就能发挥作用，其作用的对象

是受体细胞DNA中的特定基因，B错误；

C、重组质粒中标记基因为潮霉素抗性基因，所以导入该质粒后使用含潮霉素的液体培养基

筛选受体细胞，能存活的即为导入了质粒的，C正确；

D、检测蛋白质的表达用抗原—抗体杂交技术，部分细胞A基因切除后A蛋白表达量降低，

D正确。

故选B。

5．（2025·山东济南·二模）单亲二体(UPD)是指体细胞中某对同源染色体来自同一亲本，其

它染色体组成正常的个体，其染色体组成是2n。微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，

重复次数和分布个数因染色体而异，可以随染色体稳定地遗传给下一代。可使用STR检测

技术对UPD进行诊断：先在各条染色体上找到STR区域，在STR区域的两侧设计PCR引

物，每对引物当中有一条是带荧光标记的，在同一体系中进行PCR得到带有不同荧光标记

的扩增产物，经电泳后被检测到，然后进行比对、确认。下列说法错误的是（）

A．同一体系中进行PCR使用的引物的复性温度应大致相同

B．用含有核酸染料的载样缓冲液来鉴定扩增得到的PCR产物

C．UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递

D．检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】PCR扩增的原理与过程

【分析】PCR技术：（1）概念：PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定

DNA的核酸合成技术。（2）原理：DNA复制。（3）条件：模板DNA、四种脱氧核苷酸、

一对引物、热稳定DNA聚合酶(Taq酶)。（4）过程：高温变性、低温复性、中温延伸。

【详解】A、PCR中复性指引物通过碱基互补配对与模板链结合，同一体系中进行PCR使

用的引物的复性温度应大致相同，A正确；

B、扩增得到的PCR产物通过电泳鉴定，核酸染料加在稍冷却的琼脂糖溶液中，制成琼脂糖

凝胶平板，将来对扩增的DNA染色，含有指示剂的凝胶载样缓冲液与扩增得到的PCR产物

混合，加到加样孔，电泳时指示剂的移动可以判断DNA分子的移动情况，B错误；

C、UPD个体的某对同源染色体来自同一亲本，可能会导致UPD个体的某种隐性致病基因

都来自同一个亲本，从而表现出病症，故UPD现象可能会导致隐性遗传病以显性方式传递，

C正确；

D、微卫星DNA(STR)的核心序列为2-6个碱基，碱基序列短，DNA存在重复，重复次数和

分布个数因染色体而异，故检测过程需要分析多个STR位点以确定是否为UPD，D正确。

故选B。

6．（2025·山东青岛·二模）为能快速找到特定抗原的高亲和力抗体，研究者构建抗体文库。

从免疫后动物的特定细胞中提取总mRNA，反转录成cDNA，经PCR扩增后，构建重组载

体，再把重组载体转化到宿主细胞，形成含不同抗体基因的细胞集合，即抗体文库。下列说

法错误的是（）

A．“特定细胞”是B淋巴细胞

B．反转录出的cDNA全部是抗体基因

C．基因需要定向插入启动子和终止子中间才能表达

D．抗体分布在宿主细胞表面有利于进行抗体筛选

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】体液免疫、基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、基因工程的操作程序

综合

【分析】基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成；

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、

终止子和标记基因等；

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样；

（4）目的基因的检测与鉴定。

【详解】A、抗体是由浆细胞（效应B细胞）产生的，而浆细胞是由B淋巴细胞分化而来，

从免疫后动物中提取能产生抗体相关mRNA的“特定细胞”是B淋巴细胞，A正确；

B、从B淋巴细胞中提取的总mRNA包含了该细胞内多种基因转录形成的mRNA，反转录

出的cDNA不全部是抗体基因，还有其他基因对应的cDNA，B错误；

C、启动子是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动基因转录，终止子终止转录，基因需要

定向插入启动子和终止子中间才能正常表达，C正确；

D、如果抗体分布在宿主细胞表面，就可以利用抗原-抗体特异性结合的原理，方便地进行

抗体筛选，D正确。

故选B。

7．（2025·山东青岛·二模）DNA因构象不同在电泳时的迁移速率有所差异。超螺旋DNA以

超螺旋形式存在，分子体积小；线性DNA分子伸展，在凝胶中移动时受到的摩擦力较大；

开环DNA是由环状DNA双链中的一条链发生断裂形成，分子更松散。下列说法正确的是

（）

A．电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物

B．电泳时电泳指示剂加在凝胶中，核酸染料与PCR产物混合加入加样孔

C．电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈蓝色

D．三种构象的DNA在不同浓度的凝胶中迁移速率一定不同

【答案】A

【难度】0.85

【知识点】电泳鉴定

【分析】DNA分子具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团可以带上正电荷或负电

荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电

泳。PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的

浓度、DNA分子的大小和构象等有关。

【详解】A、电泳时需要留一个加样孔加入标准参照物，A正确；

B、配制琼脂糖凝胶时，待凝胶融化稍冷却后，加入适量的核酸染料混合；电泳时，将扩增

得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注

入凝胶的加样孔内，B错误；

C、电泳后的凝胶置于紫外灯下，看到的DNA条带呈桔红色，C错误；

D、DNA的迁移速率与凝胶浓度、DNA分子大小和构象有关，三种构象的DNA在不同浓

度的凝胶中迁移速率可能相同，D错误。

故选A。

8．（2025·山东青岛·二模）微生物底盘细胞是指经过基因工程改造、用于高效表达目标蛋白

的宿主细胞系统。利用合成生物学相关技术对底盘细胞进行遗传及代谢途径改造，可以构建

出较为理想的细胞工厂，具体流程见图。研究者已用毕赤酵母作为底盘细胞来生产次生代谢

产物萜类物质。下列说法错误的是（）

A．毕赤酵母生产的萜类物质是酵母生长所必需的物质

B．某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因

C．去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达

D．选择大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性

【答案】A

【难度】0.65

【知识点】基因工程在农牧业、制药及环境等方面的应用、筛选、获取合适的目的基因

【分析】1.基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启

动子、终止子和标记基因等。

2.将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植

物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效

的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

3.目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入

目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检

测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴

定、活性鉴定等。

【详解】A、毕赤酵母生产的萜类物质是次生代谢物，不是酵母生长所必需的物质，A错误；

B、某基因失活后菌株无法存活可以确定该基因是必需基因，B正确；

C、去除野生菌株的非必需基因降低底盘细胞的复杂性，保证目的基因的高效表达，避免了

非必需基因对目的基因表达的干扰，C正确。

D、大肠杆菌为原核生物，没有内质网和高尔基体等细胞器，不能对胰岛素进行修饰加工，

所以以大肠杆菌做底盘细胞直接合成的胰岛素通常不具备生物活性，D正确。

故选A。

9．（2025·山东济南·二模）农杆菌感知到植物分泌的酚类化合物后，会开启其侵染过程，胞

内蛋白V2识别并切割T-DNA的边界序列，切割后的T-DNA的一条链与V2形成复合物经通

道复合体进入植物细胞。植物细胞被农杆菌侵染后会合成磷酸化的蛋白(VIP1-P)激活抗病相

关基因的表达。同时，农杆菌的VF蛋白通过通道复合体进入植物细胞使VIP1-P去磷酸化

且去除T-DNA上的V2为T-DNA的整合做准备。下列说法正确的是（）

A．V2识别切割T-DNA并与其形成复合物的过程主要由线粒体供能

B．VF降低了植物的抗菌能力并促进了T-DNA与染色体DNA的整合

C．T-DNA与VF借助细胞膜上的蛋白质通过胞吞进入细胞

D．农杆菌侵染进入植物细胞的过程未涉及氢键、磷酸二酯键的断裂与形成

【答案】B

【难度】0.65

【知识点】胞吞和胞吐、将目的基因导入受体细胞

【分析】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自