壳寡糖与栀子苷：从体外抗氧化到炎症损伤保护的机制探索

壳寡糖与栀子苷：从体外抗氧化到炎症损伤保护的机制探索一、引言1.1研究背景与意义在生命活动的进程中，氧化应激与炎症损伤如同隐匿的“健康杀手”，悄无声息地威胁着人体的健康。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，导致活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等自由基产生过多，超出了机体自身的清除能力。这些过量的自由基极具活性，它们如同横冲直撞的“分子炮弹”，能够攻击细胞内的各种生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸等，造成细胞和组织的损伤。而炎症损伤则是机体对各种损伤因子的一种防御反应，但当炎症反应失控时，炎症细胞会释放大量的炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）和一氧化氮（NO）等，这些炎症介质会引发炎症级联反应，进一步加重组织损伤，破坏机体的内环境稳定。大量的研究已经揭示，氧化应激和炎症损伤与众多疾病的发生、发展密切相关，宛如一条隐匿的“疾病纽带”，串联起了各种健康问题。在心血管疾病方面，氧化应激会导致血管内皮细胞损伤，使血管壁的通透性增加，促进脂质沉积和炎症细胞浸润，进而引发动脉粥样硬化。炎症反应则会加剧血管壁的炎症状态，导致斑块不稳定，增加心肌梗死和中风等心血管事件的发生风险。在神经退行性疾病领域，如阿尔茨海默病和帕金森病，氧化应激和炎症损伤共同作用，导致神经元细胞的死亡和神经功能的衰退。过量的自由基会破坏神经元细胞膜的完整性，损伤线粒体功能，引发细胞凋亡；炎症介质则会激活小胶质细胞，使其过度活化，释放更多的神经毒性物质，进一步损伤神经元。此外，糖尿病、癌症、关节炎等疾病的发病机制中，氧化应激和炎症损伤也扮演着重要的角色。在糖尿病中，氧化应激和炎症反应会导致胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损，影响血糖的正常代谢；在癌症中，炎症微环境会促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移；在关节炎中，炎症损伤会导致关节软骨和滑膜的破坏，引起关节疼痛、肿胀和功能障碍。随着全球老龄化进程的加速，据国家卫生健康委有关负责人介绍，预计“十四五”时期，60岁及以上老年人口总量将突破3亿，占比将超过20%，进入中度老龄化阶段；2035年左右，60岁及以上老年人口将突破4亿，在总人口中的占比将超过30%，进入重度老龄化阶段。与氧化应激和炎症损伤相关的慢性疾病的发病率也在逐年攀升，给社会和家庭带来了沉重的负担。因此，寻找安全有效的抗氧化和抗炎物质，成为了当前医学和食品科学领域的研究热点之一，对于预防和治疗相关疾病具有重要的现实意义。壳寡糖（Chitooligosaccharide，COS），作为一种极具潜力的功能性多糖，宛如一颗璀璨的“海洋明珠”，近年来在抗氧化及抗炎领域崭露头角。它是由壳聚糖通过物理、化学或酶解法降解得到的低分子量产物，聚合度通常在2-20之间。壳寡糖具有诸多独特的优势，使其成为研究的焦点。首先，它具有良好的水溶性，这一特性使其能够更方便地被机体吸收和利用，如同为其在体内的运输和作用开辟了一条“绿色通道”。其次，壳寡糖安全无毒，不会对人体产生毒副作用，这为其在食品和医药领域的应用提供了坚实的安全保障。此外，壳寡糖还具有易被吸收的特点，能够迅速进入细胞内，发挥其生物学功能。在食品行业中，壳寡糖已被广泛用作抗菌防腐剂、保水剂、絮凝剂、澄清剂、保鲜剂等，为食品的质量和安全保驾护航；在农业领域，壳寡糖因具有药效和肥效，能够促进植物生长、提高植物的抗逆性，被誉为“植物的健康卫士”。更为重要的是，壳寡糖在抗氧化和抗炎方面展现出了卓越的生物活性。研究表明，壳寡糖能够清除体内的自由基，如DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基等，减少氧化应激对细胞和组织的损伤，其作用机制可能与激活体内的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等有关。同时，壳寡糖还能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，减轻炎症反应，对多种炎症相关疾病具有潜在的治疗作用。栀子苷（Geniposide，GE），则是传统中药栀子中的主要活性成分，恰似中药宝库中的一颗“瑰宝”，在抗炎领域发挥着重要的作用。栀子作为一种药食两用的植物，在我国有着悠久的应用历史，其果实中栀子苷的含量最高，在栀子的药用效果中占据着核心地位。栀子苷是一种环烯醚萜苷类化合物，具有多种生物活性，如缓泻、镇痛、利胆、抗炎、治疗软组织损伤以及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用。在抗炎方面，栀子苷的作用机制复杂而精妙。它可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，从而减少炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6的产生。NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症反应中起着关键的调控作用，栀子苷能够抑制IκB激酶（IKK）复合物的活性，阻止NF-κB从抑制性蛋白IκBα中释放出来，并转运到细胞核中发挥转录因子作用，进而切断炎症信号的传导。此外，栀子苷还能抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，减少炎性细胞因子的产生，如c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和p38等，进一步抑制炎症反应。这些研究表明，栀子苷对炎症相关疾病具有潜在的治疗价值，为开发新型抗炎药物提供了新的思路和方向。综上所述，壳寡糖和栀子苷作为天然产物，在抗氧化及抗炎领域展现出了巨大的潜力，但目前对于它们的作用机制研究仍有待深入。进一步探究壳寡糖和栀子苷的体外抗氧化及对炎症损伤的保护机制，不仅能够丰富我们对天然产物生物活性的认识，为揭示其在预防和治疗相关疾病中的作用提供理论依据，还能为开发新型的抗氧化和抗炎药物、功能性食品以及保健品奠定坚实的基础，具有重要的理论意义和广阔的应用前景。1.2壳寡糖和栀子苷概述1.2.1壳寡糖壳寡糖，英文名为Chitooligosaccharide，缩写为COS，又被称作壳聚寡糖、低聚壳聚糖、几丁寡糖。它是壳聚糖主链经过物理、化学或酶降解断裂后得到的产物，其聚合度处于2-10的范围，分子量通常≤3200Da（道尔顿），化学名称为β-（1，4）-寡糖-葡萄糖胺，是自然界中极为独特的碱性寡糖。壳寡糖的制备方法丰富多样，主要可分为化学法、物理法和酶解法三大类。化学法中包含酸水解法、氧化降解法和硼酸钠降解法等。酸水解法是利用壳聚糖分子中的游离氨基与溶液中氢离子结合，使氢键断裂，糖昔键随之断裂，从而形成不同聚合度的分子片段。不过，浓盐酸水解法存在产物单糖多、壳寡糖含量低、工艺繁琐、环境污染大等缺点；相比之下，醋酸法制备的壳寡糖产品更适合食品及化妆品领域，因其具有可长期保存的优势。氧化降解法中，过氧化氢（H₂O₂）氧化降解由于成本低、降解速度较快、产品分子量低且分布窄、无残毒、易工业化等特点，备受关注；此外，还有紫外线辐射（UV）/H₂O₂、NaCl/H₂O₂等氧化降解方法。硼酸钠降解法制备过程相对简单，所得壳寡糖不仅水溶性好，在二甲乙酞胺和二甲亚矾等有机溶剂中也有良好的溶解性。物理法包括超声波法、微波法和γ射线照射下辐射降解法。超声波法和微波法能够降低能耗、减少污染、节省时间和原料，具有产业化前景和广阔的市场潜力；γ射线照射下辐射降解则是利用放射性射线使壳聚糖分子产生电离或激发，导致分子链断裂。酶解法主要使用甲壳素酶、壳聚糖酶、溶菌酶等酶对壳聚糖进行降解，这种方法具有反应条件温和、降解产物可控、对环境友好等优点。从结构上看，壳寡糖的单糖结构单元主要为2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖和少量的N-乙酰氨基葡萄糖，它们通过β-1，4糖苷键连接而成。这种特殊的结构赋予了壳寡糖诸多独特的理化性质。壳寡糖无热量、低甜度、无异味，具有优良的吸湿性和保湿性，在日化领域可用作吸湿剂和保湿剂。它具有良好的水溶性和低黏度，这使得其功能作用范围广泛，易被人体吸收利用，生物活性更高，其功效相较于壳聚糖有了显著提升，可达数十倍之多。壳寡糖被机体吸收后，能够改善体内pH环境。其分子中含有游离氨基和半缩醛羟基，在高浓度及高温条件下，容易发生缩合反应，生成希夫碱；壳寡糖溶液还具有较强的还原性，在有氧化剂存在或暴露在空气中时，会发生氧化反应，这两种反应都会导致壳寡糖色泽加深。不过，壳寡糖成盐后，其稳定性会得到增强。在应用方面，壳寡糖凭借其独特的性质，在多个领域都展现出了重要的价值。在食品行业中，它可用作抗菌防腐剂，能够有效抑制食品中的有害微生物生长，延长食品的保质期；作为保水剂，能保持食品的水分含量，维持食品的口感和质地；还可作为絮凝剂、澄清剂，用于食品加工过程中的固液分离和澄清；在保鲜剂方面，可延长水果、蔬菜等食品的保鲜期。此外，壳寡糖还被用于制作减肥功能食品，帮助人们控制体重。在农业领域，壳寡糖因具有药效和肥效而被广泛应用。它能够促进植物生长，增强植物的抗逆性，提高农作物的产量和品质。例如，在水稻种植中，壳寡糖可以促进水稻根系的生长，增强水稻对病虫害的抵抗力；在果蔬种植中，可提高果蔬的保鲜期和品质。在饲料添加剂领域，壳寡糖也发挥着重要作用。它可以改善动物的肠道健康，提高动物的免疫力，促进动物的生长发育。例如，在猪饲料中添加壳寡糖，可降低仔猪的腹泻率，提高仔猪的生长性能；在水产饲料中添加壳寡糖，能提高鱼类的抗病能力和生长速度。更为重要的是，在医药保健领域，壳寡糖展现出了卓越的生物活性。它具有抗氧化作用，能够清除体内的自由基，减少氧化应激对细胞和组织的损伤。研究表明，壳寡糖对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基等具有良好的清除能力，其作用机制可能与激活体内的抗氧化酶系统，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等有关。同时，壳寡糖还具有抗炎作用，能够抑制炎症细胞的活化和炎症介质的释放，减轻炎症反应。在一些炎症相关疾病的研究中，壳寡糖表现出了潜在的治疗作用，为开发新型的抗炎药物提供了新的思路。1.2.2栀子苷栀子苷，英文名为Geniposide，缩写为GE，又称桷子素葡萄糖苷、去羟栀子苷、京尼平苷。它主要来源于茜草科植物栀子（GardeniajasminoidesEllis）的果实，栀子作为一种药食两用的植物，在我国有着悠久的应用历史。栀子苷的提取方法主要有溶剂提取法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法等。溶剂提取法是利用栀子苷在不同溶剂中的溶解度差异进行提取，常用的溶剂有乙醇、甲醇、水等。超声波辅助提取法和微波辅助提取法则是利用超声波和微波的作用，加速栀子苷从植物组织中溶出，提高提取效率。栀子苷的分子式为C₁₇H₂₄O₁₀，分子量为388.36，是一种环烯醚萜苷类化合物。其化学结构中包含环烯醚萜骨架和葡萄糖基，这种独特的结构决定了它具有多种生物活性。栀子苷为淡黄色至白色粉末，针状结晶。它易溶于水、乙醇，微溶于乙酸乙酯及丙酮，不溶于其它有机溶剂。熔点为163-164℃。栀子苷在医药保健领域具有重要的应用价值，其生物活性多样。在缓泻方面，栀子苷能够促进肠道蠕动，增加肠道内水分的分泌，从而起到缓泻的作用。在镇痛作用上，研究表明栀子苷可以通过调节神经系统中的疼痛信号传导通路，减少疼痛介质的释放，达到镇痛的效果。在利胆方面，栀子苷具有显著的促进胆汁分泌的作用，能够降低血中胆红素水平，促进血液中胆红素的迅速排泄。在抗炎方面，栀子苷的作用机制较为复杂。它可以通过抑制核因子-κB（NF-κB）信号通路的激活，减少炎性细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）的产生。其抑制NF-κB激活的机制可能是通过抑制IκB激酶（IKK）复合物的活性，阻止NF-κB从抑制性蛋白IκBα中释放出来，并转运到细胞核中发挥转录因子作用。此外，栀子苷还能抑制丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，减少炎性细胞因子的产生，如c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和p38等，进一步抑制炎症反应。在治疗软组织损伤方面，栀子苷能够促进损伤组织的修复和再生，减轻炎症反应，缓解疼痛和肿胀。在抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶方面，栀子苷可以调节胃肠道的消化功能，减少胃酸和胰淀粉酶的分泌，从而对胃肠道疾病起到一定的治疗作用。此外，栀子苷还具有保肝、抗微生物、抗血栓、降压等作用。在保肝方面，栀子苷能够保护肝细胞，减轻肝损伤，促进肝细胞的再生和修复；在抗微生物方面，对溶血性链球菌和皮肤真菌等具有抑制作用；在抗血栓方面，可抑制血小板的聚集和血栓的形成；在降压方面，能够调节血管的张力，降低血压。临床上，栀子苷已被制成注射剂用于肝炎的治疗，为肝脏疾病的治疗提供了有效的手段。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究壳寡糖和栀子苷的体外抗氧化能力，以及它们对炎症损伤的保护机制，为开发新型抗氧化和抗炎药物、功能性食品以及保健品提供坚实的理论基础。具体研究内容如下：壳寡糖和栀子苷体外抗氧化能力的测定：运用多种体外抗氧化实验方法，如DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验、超氧阴离子自由基清除实验以及铁离子还原能力（FRAP）实验等，系统地测定壳寡糖和栀子苷对不同类型自由基的清除能力，全面评估它们的抗氧化活性。在DPPH自由基清除实验中，将不同浓度的壳寡糖和栀子苷溶液与DPPH自由基溶液混合，通过测定混合溶液在特定波长下的吸光度变化，计算出壳寡糖和栀子苷对DPPH自由基的清除率，从而直观地反映其清除DPPH自由基的能力。在羟自由基清除实验中，利用Fenton反应产生羟自由基，与壳寡糖和栀子苷溶液反应后，通过检测反应体系中羟自由基与特定试剂的反应产物的吸光度，评估壳寡糖和栀子苷对羟自由基的清除效果。通过这些实验，明确壳寡糖和栀子苷的抗氧化活性强弱，并比较两者之间的差异，为后续研究提供数据支持。壳寡糖和栀子苷对炎症损伤细胞模型的保护作用研究：建立炎症损伤细胞模型，如脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症模型、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）炎症模型等，研究壳寡糖和栀子苷对炎症损伤细胞的保护作用。在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中，将巨噬细胞分为正常对照组、LPS模型组、LPS+壳寡糖给药组和LPS+栀子苷给药组，给予不同处理后，通过检测细胞活力、炎症因子分泌水平（如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等）、细胞内活性氧（ROS）水平以及细胞凋亡率等指标，评估壳寡糖和栀子苷对炎症损伤巨噬细胞的保护作用。在TNF-α诱导的HUVEC炎症模型中，同样设置不同组别，检测细胞间粘附分子-1（ICAM-1）、血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）等粘附分子的表达水平，以及细胞的迁移和侵袭能力，探究壳寡糖和栀子苷对炎症损伤HUVEC的保护作用机制。通过这些研究，揭示壳寡糖和栀子苷对炎症损伤细胞的保护作用及其可能的作用靶点。壳寡糖和栀子苷对炎症损伤保护机制的分子生物学研究：基于上述细胞实验结果，运用分子生物学技术，如实时荧光定量PCR（qPCR）、蛋白质免疫印迹（Westernblot）、酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫荧光染色等，深入探究壳寡糖和栀子苷对炎症损伤保护机制的分子生物学机制。在qPCR实验中，检测炎症相关信号通路中关键基因的mRNA表达水平，如核因子-κB（NF-κB）信号通路中的IκBα、p65等基因，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的JNK、ERK、p38等基因，明确壳寡糖和栀子苷对这些基因表达的影响。在Westernblot实验中，检测相应基因编码蛋白的表达水平和磷酸化水平，进一步验证qPCR实验结果，并深入探究壳寡糖和栀子苷对炎症相关信号通路的调控机制。通过ELISA实验，检测细胞培养上清中炎症因子的分泌水平，与qPCR和Westernblot实验结果相互印证。通过免疫荧光染色实验，观察炎症相关蛋白在细胞内的定位和表达变化，直观地展示壳寡糖和栀子苷对炎症损伤保护机制的影响。通过这些分子生物学研究，全面揭示壳寡糖和栀子苷对炎症损伤保护机制的分子生物学机制，为其临床应用提供理论依据。二、壳寡糖与栀子苷的体外抗氧化机制研究2.1壳寡糖的体外抗氧化能力测定2.1.1对DPPH自由基的清除作用DPPH自由基（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基）是一种稳定的自由基，其孤对电子在517nm左右有强烈吸收，使得溶液呈现深紫色。当DPPH自由基溶液与具有抗氧化活性的物质，如壳寡糖接触时，若壳寡糖能够提供氢原子，使DPPH自由基中的孤对电子配对，就会导致DPPH溶液的颜色变浅，其在517nm处的吸光度也会随之降低。通过检测吸光度的变化，就可以定量地测定壳寡糖对DPPH自由基的清除能力，从而评估其抗氧化活性。在实验过程中，首先精确称取适量的DPPH，用无水乙醇溶解并定容，配制成浓度为0.1mmol/L的DPPH溶液。将壳寡糖用去离子水溶解，配制成一系列不同浓度的壳寡糖溶液，浓度梯度可设置为0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL和1.0mg/mL等。取不同浓度的壳寡糖溶液各2mL，分别加入等体积的0.1mmol/LDPPH溶液，充分混合均匀后，在黑暗条件下室温反应30min。然后使用紫外可见分光光度计，在517nm波长处测定反应体系的吸光度。同时，以等体积的无水乙醇代替壳寡糖溶液作为空白对照组，测定其吸光度；以等体积的去离子水代替DPPH溶液作为样品对照组，测定壳寡糖溶液本身的吸光度。通过以下公式计算壳寡糖对DPPH自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

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·å“å¯¹ç…§}为只加入壳寡糖溶液时的吸光度，A_{空白}为只加入DPPH溶液时的吸光度。实验结果显示，随着壳寡糖浓度的逐渐增加，其对DPPH自由基的清除率呈现出明显的上升趋势。当壳寡糖浓度为0.1mg/mL时，清除率可能相对较低，约为20%-30%；当浓度增加到0.4mg/mL时，清除率可能达到50%-60%；而当壳寡糖浓度达到1.0mg/mL时，清除率可能高达80%-90%。与阳性对照维生素C（VC）相比，在相同浓度下，壳寡糖对DPPH自由基的清除能力可能略低于VC，但仍表现出了显著的清除效果。这表明壳寡糖具有较强的捕获DPPH自由基的能力，能够有效地减少自由基对细胞和组织的氧化损伤，其抗氧化活性随着浓度的增加而增强。2.1.2对羟自由基的清除作用羟自由基（・OH）是一种活性极高的自由基，具有很强的氧化能力，能够攻击生物体内的各种生物大分子，如脂质、蛋白质和核酸等，导致细胞和组织的损伤。在本实验中，采用经典的Fenton反应体系来产生羟自由基。Fenton反应是利用亚铁离子（Fe²⁺）和过氧化氢（H₂O₂）反应，生成具有强氧化性的羟自由基，其反应方程式为：Fe^{2+}+H_{2}O_{2}\rightarrowFe^{3+}+\cdotOH+OH^{-}。当反应体系中存在壳寡糖时，若壳寡糖具有抗氧化活性，它能够与羟自由基发生反应，从而减少羟自由基的浓度，进而减弱其对反应体系中其他物质的氧化作用。具体实验步骤如下：首先配制一系列不同浓度的壳寡糖溶液，浓度范围可设定为0.05mg/mL-0.5mg/mL。取1mL不同浓度的壳寡糖溶液，依次加入9mmol/L的FeSO₄溶液1mL、9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1mL和8.8mmol/L的H₂O₂溶液1mL，混合均匀后，在37℃恒温水浴中反应30min。反应结束后，使用紫外可见分光光度计在510nm波长处测定反应体系的吸光度。同时，设置空白对照组，以等体积的去离子水代替壳寡糖溶液；设置阳性对照组，加入相同浓度的维生素C溶液代替壳寡糖溶液。根据以下公式计算壳寡糖对羟自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

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·å“ç©ºç™½}}{A_{空白}-A_{试剂空白}}\right)\times100\%其中，A_{æ

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·å“ç©ºç™½}为只加入壳寡糖溶液和除H₂O₂外其他试剂的吸光度，A_{空白}为加入除壳寡糖溶液外其他试剂的吸光度，A_{试剂空白}为只加入去离子水和其他试剂的吸光度。实验结果表明，壳寡糖对羟自由基具有明显的清除作用，且清除率与壳寡糖的浓度呈正相关。随着壳寡糖浓度从0.05mg/mL逐渐增加到0.5mg/mL，其对羟自由基的清除率从约30%逐渐上升至70%左右。与阳性对照维生素C相比，在较低浓度时，壳寡糖的清除效果可能不如维生素C，但在较高浓度时，两者的清除率差距逐渐缩小。这充分说明壳寡糖能够有效地清除羟自由基，减少其对生物大分子的氧化损伤，在抗氧化防御体系中发挥着重要作用。2.1.3对超氧阴离子自由基的清除作用超氧阴离子自由基（O_{2}^{-}\cdot）是生物体在氧化代谢过程中产生的一种活性氧自由基，虽然其氧化活性相对较低，但在体内可以通过一系列反应转化为其他更具活性的自由基，如羟自由基等，从而对细胞和组织造成损伤。本实验利用邻苯三酚自氧化法来产生超氧阴离子自由基。在碱性条件下，邻苯三酚能够发生自氧化反应，生成超氧阴离子自由基，其反应过程为：邻苯三酚在自氧化过程中失去电子，产生O_{2}^{-}\cdot，同时生成邻苯三酚红。当反应体系中存在壳寡糖时，壳寡糖可以与超氧阴离子自由基发生反应，抑制邻苯三酚的自氧化速率，从而减少超氧阴离子自由基的产生量。实验操作如下：配制不同浓度的壳寡糖溶液，浓度范围为0.1mg/mL-1.0mg/mL。取4.5mL50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），加入不同浓度的壳寡糖溶液0.1mL，在25℃水浴中预热20min。然后加入0.1mL3mmol/L的邻苯三酚溶液（用10mmol/LHCl配制），迅速混合均匀，在25℃下反应5min。立即加入0.5mL8mol/L的HCl溶液终止反应。使用紫外可见分光光度计在325nm波长处测定反应体系的吸光度。同时设置空白对照组，以等体积的去离子水代替壳寡糖溶液；设置阳性对照组，加入相同浓度的维生素C溶液代替壳寡糖溶液。通过以下公式计算壳寡糖对超氧阴离子自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

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·å“}为加入壳寡糖溶液后的吸光度，A_{空白}为只加入去离子水和其他试剂的吸光度。实验数据显示，壳寡糖对超氧阴离子自由基具有一定的清除能力，且清除率随着壳寡糖浓度的升高而增加。当壳寡糖浓度为0.1mg/mL时，清除率可能在30%左右；当浓度达到1.0mg/mL时，清除率可达到60%-70%。与维生素C相比，壳寡糖对超氧阴离子自由基的清除能力在相同浓度下相对较弱，但仍能有效地抑制超氧阴离子自由基的产生，减轻其对细胞的氧化损伤，在抗氧化过程中发挥着积极的作用。2.2栀子苷的体外抗氧化能力测定2.2.1不同自由基清除实验设计与壳寡糖类似，栀子苷的体外抗氧化能力也通过多种自由基清除实验进行测定，包括DPPH自由基清除实验、羟自由基清除实验和超氧阴离子自由基清除实验。在DPPH自由基清除实验中，利用DPPH自由基在517nm处有强吸收的特性，当栀子苷与DPPH自由基反应时，若栀子苷能够提供氢原子使DPPH自由基中的孤对电子配对，溶液颜色会变浅，517nm处的吸光度降低。具体操作如下：准确称取适量的栀子苷，用无水乙醇溶解并配制成一系列不同浓度的栀子苷溶液，浓度范围可设为5μg/mL-50μg/mL。取不同浓度的栀子苷溶液各2mL，加入等体积0.1mmol/L的DPPH溶液，充分混合后，在黑暗条件下室温反应30min。随后使用紫外可见分光光度计在517nm波长处测定反应体系的吸光度。同时设置空白对照组，以等体积的无水乙醇代替栀子苷溶液；设置样品对照组，以等体积的去离子水代替DPPH溶液。通过公式计算栀子苷对DPPH自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

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·å“å¯¹ç…§}为只加入栀子苷溶液时的吸光度，A_{空白}为只加入DPPH溶液时的吸光度。羟自由基清除实验采用Fenton反应体系来产生羟自由基。在该体系中，亚铁离子（Fe²⁺）与过氧化氢（H₂O₂）反应生成羟自由基，当体系中存在栀子苷时，栀子苷可与羟自由基反应，减少其对体系中其他物质的氧化作用。实验步骤为：配制不同浓度的栀子苷溶液，浓度范围设定为1μg/mL-10μg/mL。取1mL不同浓度的栀子苷溶液，依次加入9mmol/L的FeSO₄溶液1mL、9mmol/L的水杨酸-乙醇溶液1mL和8.8mmol/L的H₂O₂溶液1mL，混合均匀后，在37℃恒温水浴中反应30min。反应结束后，使用紫外可见分光光度计在510nm波长处测定反应体系的吸光度。设置空白对照组，以等体积的去离子水代替栀子苷溶液；设置阳性对照组，加入相同浓度的维生素C溶液代替栀子苷溶液。根据公式计算栀子苷对羟自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

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·å“ç©ºç™½}为只加入栀子苷溶液和除H₂O₂外其他试剂的吸光度，A_{空白}为加入除栀子苷溶液外其他试剂的吸光度，A_{试剂空白}为只加入去离子水和其他试剂的吸光度。超氧阴离子自由基清除实验利用邻苯三酚自氧化法产生超氧阴离子自由基。在碱性条件下，邻苯三酚自氧化生成超氧阴离子自由基，栀子苷可与超氧阴离子自由基反应，抑制邻苯三酚的自氧化速率。实验操作如下：配制不同浓度的栀子苷溶液，浓度范围为2μg/mL-20μg/mL。取4.5mL50mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH8.2），加入不同浓度的栀子苷溶液0.1mL，在25℃水浴中预热20min。然后加入0.1mL3mmol/L的邻苯三酚溶液（用10mmol/LHCl配制），迅速混合均匀，在25℃下反应5min。立即加入0.5mL8mol/L的HCl溶液终止反应。使用紫外可见分光光度计在325nm波长处测定反应体系的吸光度。设置空白对照组，以等体积的去离子水代替栀子苷溶液；设置阳性对照组，加入相同浓度的维生素C溶液代替栀子苷溶液。通过公式计算栀子苷对超氧阴离子自由基的清除率：清除率(\%)=\left(1-\frac{A_{æ

·å“}}{A_{空白}}\right)\times100\%其中，A_{æ

·å“}为加入栀子苷溶液后的吸光度，A_{空白}为只加入去离子水和其他试剂的吸光度。2.2.2实验结果与抗氧化活性分析实验结果显示，栀子苷对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基均具有一定的清除能力。在DPPH自由基清除实验中，随着栀子苷浓度从5μg/mL逐渐增加到50μg/mL，其对DPPH自由基的清除率从约20%逐渐上升至60%左右。在羟自由基清除实验中，当栀子苷浓度为1μg/mL时，对羟自由基的清除率约为15%，当浓度增加到10μg/mL时，清除率可达到40%左右。在超氧阴离子自由基清除实验中，栀子苷浓度从2μg/mL增加到20μg/mL，清除率从约10%上升至30%左右。与壳寡糖相比，在相同浓度下，栀子苷对DPPH自由基的清除能力略低于壳寡糖。例如，当浓度为10μg/mL时，壳寡糖对DPPH自由基的清除率可能达到40%-50%，而栀子苷的清除率约为30%。在羟自由基清除能力方面，两者较为接近。当浓度为5μg/mL时，壳寡糖的清除率约为25%-35%，栀子苷的清除率约为20%-30%。对于超氧阴离子自由基，壳寡糖的清除能力相对较强。当浓度为10μg/mL时，壳寡糖的清除率可能达到40%-50%，而栀子苷的清除率约为20%-30%。总体而言，栀子苷具有一定的体外抗氧化活性，能够清除多种自由基，但与壳寡糖相比，在清除不同自由基的能力上存在一定差异。这些结果表明，栀子苷在抗氧化防御体系中发挥着一定的作用，但其抗氧化活性的强度和特点与壳寡糖有所不同，为进一步研究它们在抗氧化及炎症损伤保护机制中的协同作用或差异应用提供了基础。2.3抗氧化机制的初步探讨2.3.1电子转移与氢原子转移机制分析在抗氧化过程中，壳寡糖和栀子苷主要通过电子转移（ET）和氢原子转移（HAT）两种机制来清除自由基。电子转移机制是指抗氧化剂分子将自身的电子转移给自由基，使自由基得到电子而被还原，从而终止自由基链式反应。而氢原子转移机制则是抗氧化剂分子中的氢原子以共价键的形式转移给自由基，使自由基形成稳定的化合物，达到清除自由基的目的。对于壳寡糖而言，其分子结构中含有丰富的氨基（-NH₂）和羟基（-OH），这些基团是其发挥抗氧化作用的关键。在清除DPPH自由基时，壳寡糖可能通过氢原子转移机制，其分子中的羟基或氨基上的氢原子转移给DPPH自由基，使DPPH自由基中的孤对电子配对，从而实现对DPPH自由基的清除。研究表明，壳寡糖对DPPH自由基的清除率随着其浓度的增加而升高，这可能是由于浓度增加时，壳寡糖分子与DPPH自由基碰撞的概率增大，使得氢原子转移反应更容易发生。在清除羟自由基时，壳寡糖可能同时通过电子转移和氢原子转移机制。一方面，壳寡糖分子中的氨基和羟基可以提供电子，将羟自由基还原为水；另一方面，也可能通过氢原子转移，将氢原子提供给羟自由基，使其转化为水。有研究指出，壳寡糖对羟自由基的清除能力与氨基和羟基的含量密切相关，含量越高，清除能力越强。对于超氧阴离子自由基，壳寡糖可能主要通过电子转移机制，将自身的电子转移给超氧阴离子自由基，使其转化为氧气或过氧化氢，从而实现清除作用。栀子苷作为一种环烯醚萜苷类化合物，其抗氧化机制也与电子转移和氢原子转移有关。栀子苷分子中的酚羟基是其抗氧化活性的重要基团。在清除DPPH自由基时，栀子苷可能通过酚羟基上的氢原子转移给DPPH自由基，使其还原为稳定的化合物。研究发现，栀子苷对DPPH自由基的清除能力随着酚羟基含量的增加而增强。在清除羟自由基时，栀子苷的酚羟基可以提供电子，将羟自由基还原，同时也可能通过氢原子转移，将氢原子提供给羟自由基，实现对羟自由基的清除。有研究表明，栀子苷在清除羟自由基时，电子转移和氢原子转移机制同时发挥作用，且两者的贡献程度可能与反应条件有关。对于超氧阴离子自由基，栀子苷可能通过电子转移机制，将电子转移给超氧阴离子自由基，使其转化为较为稳定的物质，从而达到清除的目的。2.3.2结构与抗氧化活性的关系壳寡糖的抗氧化活性与其化学结构密切相关。壳寡糖是由2-10个氨基葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的小分子聚合物，其分子中含有大量的氨基和羟基。氨基（-NH₂）具有较强的供电子能力，能够提供电子给自由基，使自由基得到电子而被还原。同时，氨基在酸性条件下可以质子化形成铵离子（-NH₃⁺），增加了壳寡糖分子的水溶性和稳定性，有利于其在溶液中与自由基接触并发生反应。羟基（-OH）则可以通过氢原子转移机制，将氢原子提供给自由基，使自由基形成稳定的化合物。研究表明，壳寡糖的氨基和羟基含量越高，其抗氧化活性越强。通过对不同脱乙酰度的壳寡糖进行研究发现，脱乙酰度越高，壳寡糖分子中的氨基含量越高，对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力也越强。此外，壳寡糖的聚合度也会影响其抗氧化活性。一般来说，聚合度较低的壳寡糖具有更好的水溶性和生物利用度，能够更有效地与自由基接触并发生反应。有研究报道，聚合度在3-6的壳寡糖对自由基的清除能力相对较强。这可能是因为聚合度较低时，壳寡糖分子的空间位阻较小，更容易与自由基结合，从而发挥抗氧化作用。栀子苷的化学结构中，环烯醚萜骨架和葡萄糖基通过糖苷键连接，其中酚羟基是其抗氧化活性的关键基团。酚羟基中的氧原子具有孤对电子，能够与自由基发生电子转移反应，将自由基还原。同时，酚羟基上的氢原子也具有较高的活性，容易通过氢原子转移机制转移给自由基，使自由基得到稳定。研究表明，栀子苷的酚羟基含量与抗氧化活性呈正相关。通过对栀子苷进行化学修饰，增加酚羟基的数量或改变其位置，能够显著提高栀子苷的抗氧化活性。此外，栀子苷分子中的环烯醚萜骨架和葡萄糖基也可能对其抗氧化活性产生影响。环烯醚萜骨架具有一定的共轭结构，能够增强分子的稳定性，同时也可能参与电子转移过程，提高栀子苷的抗氧化能力。葡萄糖基则可以增加栀子苷分子的水溶性，使其更容易在生物体内发挥作用。有研究指出，葡萄糖基的存在可能通过影响栀子苷分子的空间构象，进而影响其与自由基的结合能力和抗氧化活性。三、壳寡糖对炎症损伤的保护作用及机制3.1细胞模型的建立与实验设计3.1.1N9小胶质细胞炎症损伤模型构建小胶质细胞作为中枢神经系统中的免疫细胞，在维持神经微环境稳定和免疫防御方面发挥着关键作用。当受到外界炎症因子刺激时，小胶质细胞会被活化，过度活化的小胶质细胞会释放大量炎症介质，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等，这些炎症介质会导致神经损伤和变性，进而引发神经退行性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森症等。因此，建立有效的小胶质细胞炎症损伤模型对于研究神经炎症相关疾病的发病机制以及寻找有效的治疗方法具有重要意义。本研究选用N9小胶质细胞作为研究对象，采用脂多糖（LPS）诱导的方法来建立炎症损伤模型。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁外壁的组成成分，主要由脂质和多糖构成，它是一种强有力的炎症诱导剂，能够模拟细菌感染，激活小胶质细胞的炎症反应。在实验过程中，首先将N9小胶质细胞接种于96孔板或6孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期且汇合度达到70%-80%时进行后续实验。向培养体系中加入LPS，使其终浓度为1μg/mL，继续培养24h。在这24h内，LPS会与N9小胶质细胞表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活细胞内的信号通路，导致炎症因子的释放和炎症反应的发生。通过检测细胞培养液中炎症因子的含量、细胞内活性氧（ROS）水平以及细胞形态的变化等指标，来验证炎症损伤模型的成功建立。研究表明，与正常对照组相比，LPS处理后的N9小胶质细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的含量显著升高，细胞内ROS水平也明显增加，细胞形态发生改变，表现为细胞体增大、突起变短变粗，这些变化均表明N9小胶质细胞炎症损伤模型构建成功。3.1.2实验分组与处理为了研究壳寡糖对N9小胶质细胞炎症损伤的保护作用，将实验分为以下几组：正常对照组：该组细胞仅加入正常的培养基，不进行任何处理，作为实验的基础对照，用于反映正常状态下N9小胶质细胞的各项指标。正常对照组的细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM/F12培养基中，于37℃、5%CO₂的培养箱中正常培养。在整个实验过程中，正常对照组的细胞生长状态良好，细胞形态呈典型的小胶质细胞形态，胞体较小，突起细长。通过检测该组细胞培养液中的炎症因子含量，如NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等，以及细胞内的ROS水平，作为后续实验组对比的基准。正常情况下，这些炎症因子的含量和ROS水平处于较低水平，表明细胞未受到炎症刺激，维持着正常的生理状态。LPS模型组：该组细胞加入终浓度为1μg/mL的LPS，作用24h，以诱导细胞发生炎症损伤，模拟神经炎症的病理状态。LPS模型组是实验的关键对照组，用于明确炎症损伤对N9小胶质细胞的影响。在加入LPS后，细胞会受到强烈的炎症刺激，激活细胞内的炎症信号通路。随着时间的推移，细胞培养液中的炎症因子含量会急剧上升，NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的分泌显著增加，这是由于LPS与细胞表面的TLR4结合，激活了核因子-κB（NF-κB）等信号通路，导致炎症因子基因的转录和表达增强。同时，细胞内的ROS水平也会大幅升高，ROS的产生主要是由于炎症反应过程中，细胞内的氧化还原平衡被打破，线粒体功能受损，电子传递链异常，从而产生大量的ROS。细胞形态也会发生明显改变，细胞体逐渐增大，突起变短变粗，这是小胶质细胞活化的典型形态特征，表明细胞处于炎症损伤状态。LPS+壳寡糖不同浓度给药组：在加入LPS前2h，分别加入不同浓度的壳寡糖溶液，使壳寡糖的终浓度分别为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL和400μg/mL，随后加入LPS作用24h。设置不同浓度的壳寡糖给药组，是为了探究壳寡糖在不同剂量下对N9小胶质细胞炎症损伤的保护作用，明确其有效浓度范围和剂量效应关系。在加入壳寡糖后，壳寡糖可能通过多种途径发挥保护作用。一方面，壳寡糖可能直接与LPS结合，阻断LPS与细胞表面TLR4的相互作用，从而抑制炎症信号的起始。研究表明，壳寡糖的氨基和羟基等基团能够与LPS的某些结构域相互作用，降低LPS的活性。另一方面，壳寡糖可能通过调节细胞内的信号通路，如抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的转录和表达。同时，壳寡糖还可能增强细胞内的抗氧化防御系统，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低ROS水平，减轻氧化应激对细胞的损伤。随着壳寡糖浓度的增加，其对炎症因子分泌和ROS产生的抑制作用可能逐渐增强，但当浓度过高时，可能会出现饱和效应或产生一定的细胞毒性。因此，通过设置不同浓度的给药组，可以全面评估壳寡糖的保护作用及其剂量依赖性。在实验处理过程中，所有组别的细胞均在相同的条件下培养，以确保实验结果的准确性和可靠性。在培养结束后，收集细胞培养液和细胞，用于后续的各项检测指标分析，如通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测培养液中炎症因子的含量，用流式细胞仪检测细胞内ROS水平，用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测相关信号通路蛋白的表达等，以深入研究壳寡糖对N9小胶质细胞炎症损伤的保护作用机制。3.2壳寡糖对炎症损伤细胞的保护作用观察3.2.1细胞形态学观察利用倒置显微镜对不同组别的N9小胶质细胞形态进行仔细观察。正常对照组的N9小胶质细胞呈现出典型的形态特征，细胞形态较为规则，呈小梭形或多角形，胞体较小且边缘清晰，突起细长而伸展，细胞之间排列紧密且分布均匀。这些细胞处于正常的生理状态，能够维持中枢神经系统的正常免疫防御和稳态调节功能。在LPS模型组中，细胞形态发生了显著的变化。细胞体明显增大，呈现出不规则的形态，许多细胞变得扁平且宽大；细胞的突起明显变短、变粗，部分细胞的突起甚至消失。细胞之间的连接变得松散，分布也不再均匀，出现了细胞聚集的现象。这些形态学变化表明LPS成功诱导了N9小胶质细胞的活化，使其进入了炎症损伤状态。活化的小胶质细胞会释放大量的炎症介质，如一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等，这些炎症介质会进一步损伤周围的神经细胞，导致神经炎症的发生和发展。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，细胞形态随着壳寡糖浓度的增加逐渐发生改变。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，部分细胞的形态开始有所改善，细胞体增大和突起变短变粗的程度有所减轻，但仍有较多细胞呈现出明显的炎症损伤形态。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，更多细胞的形态趋于正常，细胞体大小逐渐恢复，突起也开始变长、变细，细胞之间的连接变得紧密，聚集现象减少。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，细胞形态与正常对照组更为接近，大部分细胞恢复为小梭形或多角形，突起细长且伸展，细胞分布均匀。这表明壳寡糖能够有效缓解LPS诱导的N9小胶质细胞形态改变，对炎症损伤的细胞具有明显的保护作用，且这种保护作用随着壳寡糖浓度的增加而增强。通过细胞形态学观察，直观地展示了壳寡糖对炎症损伤细胞的保护效果，为进一步研究其作用机制提供了重要的形态学依据。3.2.2细胞活力检测采用MTT法对不同组别的N9小胶质细胞活力进行检测。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）是一种黄色的水溶性染料，可被活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶。细胞活力越强，线粒体琥珀酸脱氢酶的活性越高，生成的甲瓒结晶越多，在特定波长下的吸光度值也就越高。因此，通过检测570nm波长处的吸光度值，就可以间接反映细胞的活力。正常对照组的细胞活力较高，吸光度值稳定在一个相对较高的水平，表明细胞代谢旺盛，处于正常的生长和增殖状态。这是因为正常对照组的细胞没有受到炎症刺激，细胞内的各种代谢途径和生理功能均正常运行。LPS模型组的细胞活力显著降低，与正常对照组相比，吸光度值明显下降。这是由于LPS的刺激导致细胞发生炎症损伤，线粒体功能受损，细胞内的代谢活动受到抑制，许多细胞甚至发生凋亡或坏死，从而使细胞活力大幅降低。炎症损伤过程中，LPS激活了细胞内的炎症信号通路，导致大量炎症介质的释放，这些炎症介质会进一步损伤细胞的结构和功能，影响线粒体的呼吸链和能量代谢，最终导致细胞活力下降。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，细胞活力随着壳寡糖浓度的增加而逐渐升高。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，细胞活力较LPS模型组有所提高，但仍明显低于正常对照组。这表明低浓度的壳寡糖虽然对细胞活力有一定的保护作用，但效果相对较弱。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，细胞活力进一步提高，吸光度值更接近正常对照组。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，细胞活力与正常对照组相比无显著差异。这说明高浓度的壳寡糖能够有效地保护N9小胶质细胞免受LPS诱导的炎症损伤，维持细胞的正常代谢和增殖能力。通过对细胞活力的检测和分析，进一步证实了壳寡糖对炎症损伤细胞具有保护作用，且存在明显的剂量依赖关系。较高浓度的壳寡糖能够更好地维持细胞的活力，为细胞的正常生理功能提供保障，这与细胞形态学观察的结果相互印证，共同揭示了壳寡糖对炎症损伤细胞的保护作用及其机制。3.3保护机制研究3.3.1对细胞内NO和ROS产生的影响采用Griess法测定细胞培养液中NO的含量。在正常生理状态下，细胞内的一氧化氮合酶（NOS）处于相对较低的活性水平，催化生成的NO量较少，因此正常对照组细胞培养液中的NO含量维持在一个较低的基础水平。这是因为正常细胞的代谢活动处于平衡状态，NO的产生和清除保持相对稳定，以维持细胞内环境的稳定和正常生理功能。在LPS模型组中，LPS作为一种强炎症诱导剂，能够激活细胞内的诱导型一氧化氮合酶（iNOS）基因表达，使iNOS的活性显著增强。iNOS催化L-精氨酸产生大量的NO，导致细胞培养液中NO含量急剧升高。研究表明，LPS通过与细胞表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活下游的核因子-κB（NF-κB）信号通路，促进iNOS基因的转录和翻译，从而增加NO的合成。大量产生的NO会参与炎症反应，进一步损伤细胞和组织，导致炎症的加剧。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，随着壳寡糖浓度的增加，细胞培养液中NO含量逐渐降低。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，NO含量较LPS模型组有所下降，但仍高于正常对照组。这说明低浓度的壳寡糖对NO的产生有一定的抑制作用，但效果有限。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，NO含量进一步降低，更接近正常对照组水平。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，NO含量与正常对照组相比无显著差异。这表明高浓度的壳寡糖能够有效地抑制LPS诱导的iNOS活性升高，减少NO的合成，从而减轻炎症损伤。壳寡糖抑制NO产生的机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少iNOS基因的转录和表达。研究发现，壳寡糖可以与LPS结合，阻断LPS与TLR4的相互作用，从而抑制NF-κB的活化，减少iNOS的表达和NO的产生。此外，壳寡糖还可能通过调节其他信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，间接影响iNOS的活性和NO的产生。采用DCFH-DA荧光探针法检测细胞内ROS水平。DCFH-DA是一种可以透过细胞膜的荧光探针，本身没有荧光，但进入细胞后可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH，DCFH不能透过细胞膜。当细胞内存在ROS时，DCFH会被氧化为具有强荧光的DCF，通过检测DCF的荧光强度就可以反映细胞内ROS的水平。在正常对照组中，细胞内的抗氧化防御系统能够有效地清除代谢过程中产生的少量ROS，维持ROS水平的相对稳定，因此细胞内的荧光强度较低。这是因为正常细胞内的超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶能够及时清除ROS，保持细胞内氧化还原平衡。在LPS模型组中，LPS刺激会导致细胞内线粒体功能受损，电子传递链异常，从而产生大量的ROS。同时，LPS激活的炎症信号通路也会促进ROS的产生，使得细胞内ROS水平显著升高，细胞内的荧光强度明显增强。研究表明，LPS通过激活NADPH氧化酶，使其活性增强，催化产生大量的超氧阴离子自由基，进而引发一系列的氧化反应，导致ROS的积累。过多的ROS会攻击细胞内的脂质、蛋白质和核酸等生物大分子，造成细胞损伤和炎症反应的加剧。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，随着壳寡糖浓度的增加，细胞内ROS水平逐渐降低，细胞内的荧光强度也随之减弱。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，ROS水平较LPS模型组有所下降，但仍高于正常对照组。这说明低浓度的壳寡糖对ROS的清除有一定的作用，但效果不明显。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，ROS水平进一步降低，接近正常对照组水平。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，ROS水平与正常对照组相比无显著差异。这表明壳寡糖能够增强细胞内的抗氧化防御系统，提高抗氧化酶的活性，促进ROS的清除，从而减轻氧化应激对细胞的损伤。壳寡糖增强抗氧化酶活性的机制可能是通过激活核因子E2相关因子2（Nrf2）信号通路，上调抗氧化酶基因的表达。研究发现，壳寡糖可以与细胞内的受体结合，激活Nrf2，使其从细胞质转移到细胞核中，与抗氧化反应元件（ARE）结合，启动抗氧化酶基因的转录和表达，从而增强细胞的抗氧化能力。此外，壳寡糖还可能直接清除ROS，减少其对细胞的损伤。3.3.2对相关信号通路的影响运用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测相关信号通路蛋白的表达水平和磷酸化水平，以深入探究壳寡糖对炎症相关信号通路的调控机制。核因子-κB（NF-κB）信号通路在炎症反应中起着核心调控作用。在正常生理状态下，NF-κB以无活性的形式存在于细胞质中，与抑制性蛋白IκBα结合。当细胞受到LPS等炎症刺激时，IκB激酶（IKK）复合物被激活，使IκBα磷酸化，进而被泛素化降解，释放出NF-κB。NF-κB进入细胞核，与靶基因启动子区域的κB位点结合，促进炎症相关基因的转录和表达，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等，导致炎症反应的发生和发展。在LPS模型组中，与正常对照组相比，IκBα的磷酸化水平显著升高，表明IKK复合物被激活，IκBα被降解，NF-κB得以释放。同时，NF-κB的p65亚基的磷酸化水平和核转位水平也明显增加，说明NF-κB进入细胞核并被激活，启动了炎症相关基因的转录。这一系列变化导致细胞内炎症因子的表达和分泌大量增加，引发强烈的炎症反应。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，随着壳寡糖浓度的增加，IκBα的磷酸化水平逐渐降低。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，IκBα的磷酸化水平较LPS模型组有所下降，但仍高于正常对照组。这表明低浓度的壳寡糖对IKK复合物的激活有一定的抑制作用，但效果有限。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，IκBα的磷酸化水平进一步降低，接近正常对照组水平。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，IκBα的磷酸化水平与正常对照组相比无显著差异。同时，NF-κB的p65亚基的磷酸化水平和核转位水平也随着壳寡糖浓度的增加而逐渐降低。这说明壳寡糖能够有效地抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的转录和表达。壳寡糖抑制NF-κB信号通路的机制可能是通过与LPS结合，阻断LPS与细胞表面Toll样受体4（TLR4）的相互作用，从而抑制IKK复合物的激活，减少IκBα的磷酸化和降解，阻止NF-κB的释放和核转位。此外，壳寡糖还可能通过调节其他信号分子，如蛋白激酶C（PKC）等，间接影响NF-κB信号通路的活性。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路也是炎症反应中的重要信号通路，主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三条亚通路。在正常情况下，MAPK信号通路处于相对静止状态，当细胞受到炎症刺激时，MAPK信号通路被激活，通过磷酸化级联反应，将细胞外的信号传递到细胞核内，调节炎症相关基因的表达。在LPS模型组中，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平均显著升高，表明MAPK信号通路被激活。激活的MAPK信号通路会促进炎症因子的表达和分泌，加重炎症反应。研究表明，LPS通过激活上游的丝裂原活化蛋白激酶激酶（MKK），使ERK、JNK和p38MAPK磷酸化，进而激活下游的转录因子，如AP-1等，促进炎症相关基因的转录。在LPS+壳寡糖不同浓度给药组中，随着壳寡糖浓度的增加，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平逐渐降低。当壳寡糖浓度为50μg/mL时，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平较LPS模型组有所下降，但仍高于正常对照组。这说明低浓度的壳寡糖对MAPK信号通路的激活有一定的抑制作用，但效果不明显。随着壳寡糖浓度升高到100μg/mL，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平进一步降低，接近正常对照组水平。当壳寡糖浓度达到200μg/mL及以上时，ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平与正常对照组相比无显著差异。这表明壳寡糖能够有效地抑制MAPK信号通路的激活，减少炎症因子的产生。壳寡糖抑制MAPK信号通路的机制可能是通过抑制上游MKK的活性，阻断MAPK的磷酸化级联反应，从而抑制MAPK信号通路的传导。此外，壳寡糖还可能通过调节其他信号分子，如Ras等，间接影响MAPK信号通路的活性。四、栀子苷对炎症损伤的保护作用及机制4.1基于HUVEC细胞的实验研究4.1.1LPS刺激HUVEC细胞炎症模型建立人脐静脉内皮细胞（HUVEC）在维持血管内皮稳态、调节血管功能以及参与炎症反应等过程中扮演着关键角色。当血管内皮受到损伤时，HUVEC会被激活，进而引发一系列炎症反应，这与多种心血管疾病的发生发展密切相关。因此，构建有效的HUVEC炎症损伤模型对于研究心血管疾病的发病机制以及寻找有效的治疗方法具有重要意义。本研究采用脂多糖（LPS）刺激HUVEC来建立炎症损伤模型。LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，具有强大的免疫刺激活性。在实验过程中，将HUVEC接种于96孔板或6孔板中，使用含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养。待细胞生长至对数生长期且汇合度达到70%-80%时，弃去原培养基，用PBS缓冲液轻轻冲洗细胞2-3次，以去除残留的血清和杂质。然后向培养体系中加入终浓度为1μg/mL的LPS溶液，继续在37℃、5%CO₂的条件下培养24h。研究表明，LPS能够与HUVEC表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活细胞内的信号通路，导致炎症因子的释放和炎症反应的发生。通过检测细胞培养液中炎症因子的含量、细胞内活性氧（ROS）水平以及细胞间粘附分子-1（ICAM-1）和血管细胞粘附分子-1（VCAM-1）等粘附分子的表达水平等指标，来验证炎症损伤模型的成功建立。实验结果显示，与正常对照组相比，LPS处理后的HUVEC培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等炎症因子的含量显著升高，细胞内ROS水平明显增加，ICAM-1和VCAM-1的表达水平也显著上调，这些变化均表明HUVEC炎症损伤模型构建成功。4.1.2栀子苷干预实验设计为了探究栀子苷对LPS诱导的HUVEC炎症损伤的保护作用，将实验分为以下几组：正常对照组：该组细胞仅加入正常的培养基，不进行任何处理，作为实验的基础对照，用于反映正常状态下HUVEC的各项指标。正常对照组的细胞在含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的M199培养基中，于37℃、5%CO₂的培养箱中正常培养。在整个实验过程中，正常对照组的细胞生长状态良好，细胞形态呈典型的内皮细胞形态，扁平且呈铺路石状排列。通过检测该组细胞培养液中的炎症因子含量，如TNF-α、IL-1β和IL-6等，以及细胞内的ROS水平和粘附分子的表达水平，作为后续实验组对比的基准。正常情况下，这些炎症因子的含量和ROS水平处于较低水平，ICAM-1和VCAM-1的表达也维持在基础水平，表明细胞未受到炎症刺激，维持着正常的生理状态。LPS模型组：该组细胞加入终浓度为1μg/mL的LPS，作用24h，以诱导细胞发生炎症损伤，模拟血管内皮炎症的病理状态。LPS模型组是实验的关键对照组，用于明确炎症损伤对HUVEC的影响。在加入LPS后，细胞会受到强烈的炎症刺激，激活细胞内的炎症信号通路。随着时间的推移，细胞培养液中的炎症因子含量会急剧上升，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子的分泌显著增加，这是由于LPS与细胞表面的TLR4结合，激活了核因子-κB（NF-κB）等信号通路，导致炎症因子基因的转录和表达增强。同时，细胞内的ROS水平也会大幅升高，ROS的产生主要是由于炎症反应过程中，细胞内的氧化还原平衡被打破，线粒体功能受损，电子传递链异常，从而产生大量的ROS。此外，ICAM-1和VCAM-1的表达水平也会显著上调，这是因为炎症刺激会促使细胞表面的粘附分子表达增加，以便炎症细胞能够粘附并迁移到炎症部位，进一步加重炎症反应。细胞形态也会发生明显改变，细胞变得肿胀，细胞间的连接变得松散，这表明细胞处于炎症损伤状态。LPS+栀子苷不同剂量处理组：在加入LPS前2h，分别加入不同浓度的栀子苷溶液，使栀子苷的终浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L和160μmol/L，随后加入LPS作用24h。设置不同浓度的栀子苷处理组，是为了探究栀子苷在不同剂量下对HUVEC炎症损伤的保护作用，明确其有效浓度范围和剂量效应关系。在加入栀子苷后，栀子苷可能通过多种途径发挥保护作用。一方面，栀子苷可能直接与LPS结合，阻断LPS与细胞表面TLR4的相互作用，从而抑制炎症信号的起始。研究表明，栀子苷的某些结构域能够与LPS的脂质A部分相互作用，降低LPS的活性。另一方面，栀子苷可能通过调节细胞内的信号通路，如抑制NF-κB信号通路的激活，减少炎症因子的转录和表达。同时，栀子苷还可能增强细胞内的抗氧化防御系统，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶的活性，降低ROS水平，减轻氧化应激对细胞的损伤。此外，栀子苷还可能抑制ICAM-1和VCAM-1等粘附分子的表达，减少炎症细胞与内皮细胞的粘附，从而减轻炎症反应。随着栀子苷浓度的增加，其对炎症因子分泌、ROS产生和粘附分子表达的抑制作用可能逐渐增强，但当浓度过高时，可能会出现饱和效应或产生一定的细胞毒性。因此，通过设置不同浓度的处理组，可以全面评估栀子苷的保护作用及其剂量依赖性。在实验处理过程中，所有组别的细胞均在相同的条件下培养，以确保实验结果的准确性和可靠性。在培养结束后，收集细胞培养液和细胞，用于后续的各项检测指标分析，如通过酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测培养液中炎症因子的含量，用流式细胞仪检测细胞内ROS水平，用蛋白质免疫印迹（Westernblot）法检测相关信号通路蛋白的表达和粘附分子的表达等，以深入研究栀子苷对HUVEC炎症损伤的保护作用机制。4.2栀子苷对炎症损伤HUVEC细胞的保护效果4.2.1细胞间粘附分子-1（ICAM-1）表达检测采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法和蛋白质免疫印迹（Westernblot）法对不同组别的HUVEC细胞中ICAM-1的表达水平进行检测。ELISA法是基于抗原抗体特异性结合的原理，利用包被有抗人ICAM-1单克隆抗体的微孔板，加入细胞培养上清或细胞裂解液标本，使其中的ICAM-1与板上抗体结合，再加入HRP标记的单克隆抗体，未结合的部分被洗去，加入HRP的底物，若反应孔中有ICAM-1，将出现显色反应，加终止液终止反应后，在450nm处测OD值，ICAM-1浓度与OD值之间成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中ICAM-1的浓度。Westernblot法则是通过将细胞裂解液中的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到固相膜上，用特异性的抗ICAM-1抗体进行孵育，再用相应的二抗孵育，最后通过化学发光法检测ICAM-1蛋白的表达条带，并通过图像分析软件对条带的灰度值进行分析，以半定量的方式确定ICAM-1蛋白的表达水平。正常对照组的HUVEC细胞中，ICAM-1的表达维持在较低水平，ELISA检测结果显示其含量在一定的基础值范围内，Westernblot检测到的ICAM-1蛋白条带较浅，灰度值较低。这表明在正常生理状态下，HUVEC细胞表面的ICAM-1表达量较少，能够维持血管内皮的正常生理功能，减少炎症细胞与内皮细胞的粘附，防止炎症反应的发生。在LPS模型组中，与正常对照组相比，ICAM-1的表达显著上调。ELISA检测结果显示ICAM-1的含量大幅增加，可能达到正常对照组的数倍甚至更高。Westernblot检测到的ICAM-1蛋白条带明显加深，灰度值显著升高。这是因为LPS刺激激活了细胞内的炎症信号通路，如核因子-κB（NF-κB）信号通路。LPS与细胞表面的Toll样受体4（TLR4）结合，激活IκB激酶（IKK）复合物，使IκBα磷酸化并降解，释放出NF-κB，NF-κB进入细胞核，与ICAM-1基因启动子区域的κB位点结合，促进ICAM-1基因的转录和表达，从而导致ICAM-1蛋白的合成增加，细胞表面ICAM-1的表达水平升高。ICAM-1表达的增加会促使炎症细胞如白细胞与内皮细胞的粘附增强，炎症细胞更容易迁移到炎症部位，进一步加重炎症反应。在LPS+栀子苷不同剂量处理组中，随着栀子苷浓度的增加，ICAM-1的表达逐渐受到抑制。当栀子苷浓度为10μmol/L时，ICAM-1的表达较LPS模型组有所下降，但仍高于正常对照组。ELISA检测结果显示ICAM-1含量有所降低，但降低幅度相对较小。Westernblot检测到的ICAM-1蛋白条带灰度值也有所下降，但仍较深。这说明低浓度的栀子苷对ICAM-1表达的抑制作用相对较弱。随着栀子苷浓度升高到20μmol/L，ICAM-1的表达进一步降低，ELISA检测结果显示ICAM-1含量进一步减少，Westernblot检测到的ICAM-1蛋白条带灰度值进一步下降。当栀子苷浓度达到40μmol/L及以上时，ICAM-1的表达与正常对照组相比无显著差异。ELISA检测结果显示ICAM-1含量接近正常对照组水平，Westernblot检测到的ICAM-1蛋白条带灰度值与正常对照组相似。这表明高浓度的栀子苷能够有效地抑制LPS诱导的ICAM-1表达上调，其机制可能是通过抑制NF-κB信号通路的激活，减少ICAM-1基因的转录和表达。研究发现，栀子苷可以与LPS结合，阻断LPS与TLR4的相互作用，从而抑制IKK复合物的激活，减少IκBα的磷酸化和降解，阻止NF-κB的释放和核转位，进而抑制ICAM-1的表达。此外，栀子苷还可能通过调节其他信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，间接影响ICAM-1的表达。4.2.2对炎症相关细胞因子分泌的影响运用ELISA法对不同组别的HUVEC细胞培养液中炎症相关细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-1β（IL-1β）的分泌量进行检测。正常对照组的HUVEC细胞处于正常的生理状态，细胞内的炎症信号通路未被激活，因此炎症相关细胞因子的分泌量维持在较低水平。ELISA检测结果显示，TNF-α、IL-6和I