植物组织培养 （第四版）课件 项目6 植物脱毒技术

项目六植物脱毒技术Unit6PlantDetoxificationTechnology目录任务二植物脱毒的方法任务一植物脱毒的意义任务三脱毒苗的鉴定任务四脱毒苗的繁殖与保存任务五

植物脱毒与检测实例目的要求教学目标1.掌握热处理和微茎尖培养脱毒的方法、无病毒植物的鉴定和利用2.一般掌握其他途径脱毒方法3.理解微茎尖脱毒的原理、无毒苗培养的重要意义4.了解无病毒苗木的保存和利用方法一、病毒在植物上的危害二、植物脱毒的意义任务一植物脱毒的意义一、病毒在植物上的危害危害植物的病毒有几百种，并且随着生产栽培时间的延长，危害程度越来越严重种类越来越多一、病毒在植物上的危害严重无药可治生产损失大一、病毒在植物上的危害例如1955年，遍布欧美的马铃薯退化并病毒被带入我国薯区后，仅河北省中部地区就减产50%~70%，造成当地马铃薯不能流种，产量低，造成巨大损失。1966年和1967年PMTV在秘鲁曾引起产量损失30－40％和75％一、病毒在植物上的危害被花叶病毒感染的黄瓜一、病毒在植物上的危害植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类植物种类感染病毒种类菊花19矮牵牛5苹果36康乃馨11百合6柑橘23水仙4马铃薯17葡萄26唐菖蒲5大蒜24草莓24风信子3豌豆15桃23月季10樱桃44梨11一、病毒在植物上的危害内部症状组织细胞增生，肥大细胞和筛管坏死等外部症状系统症状：叶小、产生黄白色斑点、畸形坏死等，叶脉隆起，植株矮小等二、植物脱毒的意义（一）生物、物理、化学等途径防治病毒病收效甚微，甚至毫无成效（二）用组织培养方法生产无毒苗是一个积极有效的途径，由于排除了使用药剂，所以对减少污染，防止公害，保护环境都有积极的意义无毒苗不含该种植物的主要危害病毒。亦称“检定苗”任务二植物脱毒的方法一、茎尖培养脱毒二、热处理脱毒三、其他脱毒方法一、茎尖培养脱毒1.染病植株体内病毒的分布不均匀，越靠近茎顶病毒含量越少，生长点（约0.1－1.0）几乎不含或含病毒很少。原因是无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，不及细胞不断分裂和生长的速度因此可利用微茎尖培养脱毒2.茎尖大小与脱毒效果反比一、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒方法1、材料选择、消毒在植株上直接取或在室内培养一段时间的植株上取顶芽或侧芽（3-5mm）然后消毒2、微茎尖的剥取解剖镜下剥取，注意勿损伤生长点一、茎尖培养脱毒茎尖培养脱毒方法3、接种随剥随接尽快接种4、培养22℃左右，每天以16h、1500－5000lx光照下培养。保证较高温度和充足光照时间5、继代、生根培养同器官培养一、茎尖培养脱毒一、茎尖培养脱毒常用培养基：MS

White、Morel（一）提高钾盐的含量会有利于茎尖生长。在用MS培养基时，其中有些离子的浓度过高应适当稀释（二）严格控制糖浓度，一般2-4%，蔗糖、葡萄糖较好（三）适当提高生长素与细胞分裂素浓度。有时可加活性炭用NAA或IBA，Kt或BA，不用2,4－D。GA适当（四）培养基一、茎尖培养脱毒培养方式固体培养液体培养一、茎尖培养脱毒一、茎尖培养脱毒影响茎尖成活的因素一、茎尖培养脱毒1.外植体大小：通常以带1-3个幼叶原基的茎尖（约0.3-0.5mm)作外植体为宜。不同植物脱毒适宜的茎尖大小不同2.培养条件：增加光照3.外植体的生理状态：茎尖最好在活跃生长的芽上切取，取芽的时间最好是在萌动期较好一、茎尖培养脱毒一、茎尖培养脱毒一、病毒在植物上的危害二、热处理脱毒原理当植物组织处于高于正常温度的环境（35-40℃）时，组织内部的病毒部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。热处理脱毒方法二、热处理脱毒（一）温汤（浸渍）处理：适用于离体材料（如接穗）和休眠器官的处理。在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，使病毒失活热处理脱毒方法二、热处理脱毒（二）热风（热空气）处理：1.恒温处理：将生长的植物移入温热疗室内，一般在35－40℃。对活跃生长的茎尖效果较好，处理时间因植物而异2.变温处理：如马铃薯每天40℃处理4h，可清除芽眼中马铃薯的叶片病毒，而且保持芽眼的活力缺陷不能脱除所有病毒，例如在马铃薯中只能消除卷叶病毒注：热处理需与其它方法配合应用二、热处理脱毒二、热处理脱毒三、其他脱毒方法愈伤组织脱毒原理（一）愈伤组织分化植株，40%单细胞含有病毒，病毒的复制赶不上细胞的增殖速度（二）有些细胞突变获得了抗病毒性后代变异的几率大；有的愈伤组织不能分化成苗三、其他脱毒方法茎尖微体嫁接木本植物茎尖培养难以生根成植株，将实生苗砧木在人工培养基上种植培养，再从成年无病树枝上切取0.4-1.0mm茎尖，在砧木上进行微体嫁接，以获得无病毒植株，果树上应用多。三、其他脱毒方法选幼年树花蕾取下花蕾（镜检）取花药接种再生接种再生花药培养脱毒四、化学方法脱毒许多化学药品（包括嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗菌素等）对离体组织和原生质体具有脱毒效任务三脱毒苗的鉴定一、指示植物三、分子生物学二、血清学四、电子显微镜一、指示植物法利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒种类的方法，也即为枯斑和空斑测定法一、指示植物法（一）指示植物的确定1.专门用以产生局部病斑的寄主植物即为指示植物，又称寄主植物。它只能鉴定靠汁液传染的病毒。2.应根据不同的病毒选择适合的指示植物。并且一年四季都可栽培。一、指示植物法（二）草本指示植物鉴定1.汁液涂抹一、指示植物法（1）采取汁液在被鉴定植物上取1－3g幼叶，在研钵中加入10ml水及少量磷酸缓冲液（PH7.0），研碎后用双层纱布过滤，再在汁液中加入少量的500－600目金钢砂（摩擦剂）一、指示植物法（2）接种用棉球蘸取汁液在指示植物叶面上轻轻涂沬2－3次，后用清水冲洗叶面一、指示植物法（3）培养在防蚜虫温室内培养，15－25C，2－6天观察病症一、指示植物法病毒类型指示植物症状马铃薯X病毒千日红、曼陀罗、心叶烟脉间花叶马铃薯S病毒苋色藜、千日红、昆诺阿藜叶脉深陷、粗缩马铃薯Y病毒野生马铃薯、洋酸菜轻微花叶，粗缩或坏死马铃卷叶病毒洋酸菜叶淡黄白色或呈紫色、红色几种马铃薯病毒的指示植物及其症状一、指示植物法（二）草本指示植物鉴定2、小叶嫁接一、指示植物法（三）木本指示植物鉴定双重芽接法1~2cm指示植物待测植物一、指示植物法（三）木本指示植物鉴定直接嫁接待测植物一、指示植物法待测植物指示植物一、指示植物法部分苹果病毒的木本指示植物及相应症（引自NY329—1997标准）病毒种类木本指示植物症状苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）苏俄苹果（R12740-7A）5月中下旬以后，在苏俄苹果叶片上出现褪绿斑点，多发生于叶片一侧，病株叶片较健康株叶片小。有的向一侧弯曲呈舟形叶，植株矮化或生长衰弱苹果茎痘病毒（ASPV）司派227（Spy227）或光辉（Radiant）在Spy227指示植物上出现叶片反卷、皮层坏死等症状；在光辉指示植物上出现叶片反卷，植株矮化苹果茎沟病毒（ASGV）弗吉尼亚小苹果（Virginiacrab）在温室鉴定中，表现叶部黄斑或环状斑、叶片扭曲变形苹果花叶病毒（ApMV）兰蓬王、红玉和金冠叶片上产生黄斑、沿叶脉条斑苹果锈果类病毒（ASSV）国光（Ralls）弯叶、茎干锈斑或坏死斑二、血清学鉴定法植物病毒作为抗原，给动物注射后会在血清之中产生的抗体称抗血清。不同的病毒产生的抗血清有各自的特异性。用已知抗血清可以鉴定未知病毒的种类,是目前最有用的方法之一二、血清学鉴定法三、分子生物学法（一）植物体内的RNA都是单链，而病毒在植物体内自我复制，以双链存在（二）将已知病毒的核酸序列制成分子标记探针，与待测病原核酸杂交，放射自显影后可以指示病原的存在四、电子显微镜观察任务四脱毒苗的保存与繁殖脱毒苗的保存与繁殖本节请自行学习任务五植物脱毒与检测实例一、马铃薯茎尖脱毒（一）茎尖剥离前的准备工作1、配制植物激素2、制作诱导培养基3、配制消毒剂5、灭菌4、物品准备6、外植体马铃薯薯块取芽一、马铃薯茎尖脱毒解剖镜剥取马铃薯茎尖（二）茎尖剥离步骤（来自薯块）马铃薯茎尖分生组织（来自无菌苗）马铃薯茎尖分生组织一、马铃薯茎尖脱毒（三）普通培养条件（四）无菌苗的再次剥离（五）变温钝化培养条件二、马铃薯脱毒苗检测双抗体酶联免疫吸附测定法（DAS-ELISA）可检测8种病毒和1种细菌性病害：PVX、PVY、PLRV、PVM、PVS、PVA、TMV、TSWV和CMS（环腐）二、马铃薯脱毒苗检测植物生物芯片（GeneTopPVBKit）可检测