DB23∕T 3188-2022 花卉用戊糖杆菌细菌素制备技术规程

ICS65.100.01

CCSG24

DB23

黑龙江省地方标准

DB23/T3188—2022

花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备技术规程

2022-05-09发布2022-06-08实施

黑龙江省市场监督管理局发布

DB23/T3188—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规

定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由黑龙江省农业标准化技术委员会提出。

本文件起草单位：哈尔滨瑞康源生物科技有限公司、黑龙江省绿色食品科学研究院。

本文件主要起草人：王英男、黄艳玲、刘容旭、吴春梅、王英鹏、刘丽、王克红。

I

DB23/T3188—2022

花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备技术规程

1范围

本文件规定了花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备的术语和定义、材料和设备、技术要求、保存方法和技

术档案。

本文件适用于花卉用戊糖乳杆菌细菌素的制备。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB4789.35—2016食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验

NY/T1114—2006微生物肥料实验用培养基技术条件

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

戊糖乳杆菌LS1

戊糖乳杆菌LS1是从发酵蔬菜中分离出来的一种乳酸菌类微生物。

4材料和设备

4.1材料

4.1.1菌种

细菌素生产菌株：戊糖乳杆菌LS1菌株；指示菌株：单核细胞性李斯特菌（Listeriamonocytogenes）

CMCC54004和大肠杆菌（Escherichiacoli）ATCC25922菌株。

4.1.2培养基

选择MRS(ManRogosaSharpe)培养基为菌株活化、计数和发酵用培养基。MRS培养基配方按照GB

4789.35—2016中附录A的规定执行，培养基的配制方法按照NY/T1114—2006中第4章的规定执行。

4.1.3试剂与耗材

硫酸铵、20mmol/L醋酸盐缓冲液（pH3.8）、牛津杯、0.22µm孔径的硝酸纤维素膜、SephadexG-10

色谱柱。

4.2设备

1

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超净工作台、细菌厌氧培养箱、pH计、真空冷冻干燥机、752紫外可见分光光度计和高效液相色谱

仪。

5技术要求

5.1菌株培养

将活化后的戊糖乳杆菌LS1接种到MRS液体培养基中，并培养至对数生长期（有效活菌数达108

CFU/mL，计数方法按照NY/T1114—2006中第6章的规定执行）作为培养物。将5%的戊糖乳杆菌LS1（18h

菌龄）培养物接种到MRS液体培养基上，37℃厌氧培养42h，8000r/min离心15min后，通过0.22µm

膜过滤得到上清液与菌体，取上清液用3.0mol/LNaOH溶液将pH值调至6.5，冻干备用。

5.2细菌素分离

取15g冻干样品溶于1000mL去离子水，用60%饱和度的硫酸铵，在转速120r/min条件下搅拌

24h，然后10000r/min、4℃离心20min，通过0.22µm孔径的硝酸纤维素膜过滤分别得到上清液

与沉淀。以单核细胞性李斯特菌CMCC54004和大肠杆菌ATCC25922为指示菌，采用琼脂扩散牛津杯法

分别测定沉淀复溶液与上清液的抑菌圈直径，并以没有接菌的培养基经硫酸铵沉淀后的沉淀复溶液作空

白对照。

5.3细菌素纯化

5.3.1初度纯化

离心过滤后的上清液通过SephadexG-10柱液相色谱系统脱盐并纯化，以超纯水为缓冲液，流速为6

mL/min，然后在280nm紫外波长检测细菌素，采用琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。

5.3.2中度纯化

将SephadexG-10柱液相色谱系统脱盐并纯化得到的细菌素粗品在pH3.8的20mmol/L醋酸盐缓

冲液条件下进行SPSepheroseFastFlow纯化，用NaCl溶液梯度（0mol/L～0.5mol/L）线性洗脱细

菌素，流速为5.0mL/min。然后在280nm紫外波长紫外检测细菌素，并测定其抑菌活性。然后合并活

性流份，用SephadexG-10柱液相色谱系统脱盐后，真空冷冻干燥。

5.3.3精细纯化

采用Superdex30Increase作为最后一步纯化介质，通过SephadexG-10柱液相色谱系统脱盐并

纯化，用5mL醋酸盐缓冲液溶解冻干样品，使用Superdex30Increase，平衡2次柱体积，在pH5.2

条件下洗脱，洗脱的摩尔浓度乘以体积为1.5V，在280nm紫外波长处检测细菌素，流速1.0mL/min，

每6mL为一管进行收集，通过琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。

6保存方法

使用冻干机将细菌素制成冻干制品，于4℃～8℃以下保存。

7技术档案

2

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应建立技术档案，内容包括：菌种、培养基、试剂及耗材、设备、菌种培养、细菌素分离、细菌素

纯化等。

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