超级核酸酶大肠杆菌高密度发酵工艺优化研究

学号16208040122超级核酸酶大肠杆菌高密度发酵工艺优化研究【摘要】目的和意义非特异核酸内切酶是一类高活性水解酶，具有广阔的应用前景，但由于目前商品化的核酸酶价格昂贵，其在生物制药行业的大规模使用受到限制。考虑到生产效率的提高和生产成本的降低，本实验主要是对实验室已建立的带有SMNE融合蛋白的重组大肠杆菌进行高密度发酵工艺优化研究。方法与思路主要通过对重组大肠杆菌的培养基组成、培养温度、pH、诱导条件等进行优化，建立了重组大肠杆菌高密度发酵工艺。创新性本研究在大肠杆菌发酵产脱氧核糖核酸酶、大幅提高菌体密度及脱氧核糖核酸酶的表达量，实现了较高水平的重组大肠杆菌高密度培养，为重组大肠杆菌高密度培养在核酸酶中的应用提供了新思路。【关键词】重组大肠杆菌；高密度发酵；优化；培养基；培养条件Studyonhighdensityfermentationtechnologyoptimizationofsupernucleaseescherichiacoli.[Abstract]Objectiveandsignificance：Non-specificendonucleaseisakindofhighlyactivehydrolase,whichhasabroadapplicationprospect.However,duetothehighpriceofcommercializednucleases,theirlarge-scaleuseinbiopharmaceuticalindustryislimited.Consideringtheimprovementofproductionefficiencyandthereductionofproductioncost,thisexperimentmainlystudiedthehighdensityfermentationprocessoptimizationofrecombinantescherichiacoliwithSMNEfusionproteinestablishedinthelaboratory.Methodsandideas：Thehighdensityfermentationtechnologyofrecombinantescherichiacoliwasestablishedbyoptimizingthemediumcompositionandcultureconditionsofrecombinantescherichiacoli.Innovation：Inthisstudy,theproductionofdeoxyribonucleaseinescherichiacolifermentationgreatlyincreasedthebacterialdensityandtheexpressionofdeoxyribonuclease,achievingahigherlevelofrecombinantescherichiacolihigh-densityculture,andprovidinganewideafortheapplicationofrecombinantescherichiacolihigh-densitycultureinnucleases[Keywords]RecombinantEscherichiacoli;Highdensityfermentation;culturemedium;Cultureconditions;optimize1立题依据1.1国内外研究现状分析非特异性核酸内切酶是一类高活性水解酶，其最大特点是能够非特异地降解几乎所有类型的核酸，包括单链、双链、线状及环状的DNA和RNA，且对核酸的序列没有严格的要求[3]。到目前为止，研究人员已从病毒、细菌、真菌和动物中分离得到30余种非特异性核酸酶[1]，其中，相对于核酸酶家族其他成员，粘质沙雷氏菌胞外核酸酶（Serratiamarcescensnuclease，SMNE)的催化效率更快，是葡萄球菌核酸酶的4倍，牛胰DNase

I的34倍，故称SMNE为超级核酸酶，或全能核酸酶[1,2]。Serratiamarcescens非特异性核酸酶（SMNE）具有广阔的应用前景[1-7]，能在多个方面发挥作用，具有对工作环境要求不严等特点，其应用包括：降低生物制品，尤其是病毒类产品外源性核酸的质量，减少过敏反应，提高安全性；细胞裂解，可降低样品的粘度，缩短处理时间，提高蛋白产量，离心时有利于沉淀和上清液的分离，超滤时有利于成分的分离，提高柱层析纯化时的有效性；颗粒（病毒、包涵体等）预处理：有助于颗粒的纯化；生物分析：在ELISA、柱层析、二维电泳和印迹分析中，可提高分辨率和回收率[3]。在生物技术领域中，SMNE的功能正进一步深入的研究，其催化的高效性在蛋白质纯化过程中有很大的积极应用价值，在消除核酸污染方面效果更加显著。SMNE最初是由可致病的粘质沙雷氏菌产生获得。目前国内外有多篇文献报道了通过大肠杆菌重组制备获得SMNE[2,3,8-10]，但从目前的公开的文献来看，用大肠杆菌表达的SMNE表达产量普遍很低[2,3,8-10]，可能由于核酸酶对大肠杆菌自身核酸产生了较大影响。1.2实验目的及意义目前市场上商品化的核酸酶以DnaseⅠ和BenzonaseNuclease为代表，DnaseⅠ来源于牛的胰腺，通常纯度不高，成分复杂，降解DNA的效率不理想，BenzonaseNuclease由德国默克公司开发，纯度高并活性好，但其价格非常昂贵，因此在生物制药行业的大规模使用受到了限制[11]。过去，生物制药公司希望以抑制和削减原料成本来提高公司产品的市场竞争力，因此自主开发廉价、高效的核酸酶成了必然。图图1M：蛋白分子量标准（低）；1：IPTG诱导的表达SMNE融合蛋白宿主菌；2：表达SMNE宿主菌破碎后沉淀；3：表达SMNE宿主菌破碎后上清在工程菌的大规模发酵过程中，外源基因表达水平以及菌体密度决定了重组异源蛋白产物的宏观合成量，理论上来说，在保持相同的外源基因表达水平的前提下，增加工程菌的发酵密度可以大大提高目标产物的产量，提高发酵效率，缩短生产周期，减少设备投资，从而降低生产成本，大大提高市场竞争力[12-13]。而大肠杆菌工程菌的高密度培养技术(highcelldensitycultivation,HCDC)就为解决这一需要应运而生。高密度培养技术对于提高生产效率、降低生产成本、简化产品纯化工艺、节约能源消耗、减少污水排放以及扩大生产投资都具有非常重要的意义。1.3创新点指导教师彭礼飞老师课题组已建立了SMNE融合蛋白的原核表达系统，该融合蛋白带有一段促进表达的分子伴侣、方便纯化的组氨酸Tag及切割去掉融合伴侣的肠激酶酶切位点。经过优化后，该表达系统表达SMNE的效率（图1）显著高于国内外可检索到的文献[2,3,8-10]。老师项目组自产的SMNE自用于发酵产物破碎后的降解核酸酶，活性很高，显著提高了目的产物的纯化效率，并节省了大笔的核酸酶费用。由于SMNE具有较好的应用前景，因此，本课题的目的是在前述基础上，进一步优化SMNE高密度发酵的技术方案，为将来规模化制备高纯度（纯度>95%、内毒素<1.0U/mg）的rSMNE以应用奠定基础。2.实验方案2.1发酵培养基成分的优化目前大肠杆菌高密度发酵所使用的培养基一般为半合成培养基[14]。半合成培养基是在合成培养基中添加了适量的碳、氮、无机盐、维生素等基质而形成的，这些基质有促进细胞生长代谢或形成产物的作用。在使用半合成培养基进行大肠杆菌高密度发酵时，通常需要加入其他营养物质来促进菌体生长及代谢产物的形成[15]。培养基中通常含有碳源和氮源，以及维生素和微量元素等营养物，这些营养物的浓度与比例对重组微生物的高密度发酵具有重要意义。培养基各组分的浓度和比例要适当，各组分的浓度上限分别为：葡萄糖48g/L、氮2.9g/L、Mg2+8.8g/L、Fe2+1.13g/L、PO43-9.5g/L、Zn2+0.039g/L[16]。本次实验选取基础培养基为LB培养基，然后以此为基础上设计一系列优化实验，确定培养基中各组分的最优配比。2.2重组大肠杆菌发酵条件的优化通过优化一系列相关的发酵因素来实现经过高密度发酵得到高浓度产品的目标。在最优发酵培养基配方确定的条件下，利用单因素法分别对培养基初始pH值、发酵温度、发酵时间和接种量等进行优化，分析相应因素对发酵菌液的影响，确定最优发酵参数[17]。以及探究诱导时机和诱导时长对重组大肠杆菌高密度发酵的影响。2.3重组大肠杆菌高密度发酵条件摸索及验证结合上述内容2.1的优化培养基和内容2.2所探究的最佳发酵条件进行高密度发酵实验的摸索及验证，以提高发酵效率。2.4技术路线甘油菌的活化以及扩大培养甘油菌的活化以及扩大培养扩大培养菌液的诱导表达和产物电泳检测扩大培养菌液的诱导表达和产物电泳检测发酵罐和发酵培养基的灭菌发酵罐和发酵培养基的灭菌使用发酵罐进行高密度培养使用发酵罐进行高密度培养菌液的诱导表达菌液的诱导表达收菌收菌3.发酵培养基成分的优化3.1实验材料与仪器3.1.1菌种来源彭礼飞教授课题组保存的已构建好的菌株pstaby1.2-trx-Nuclease3.1.2主要试剂微量元素溶液（1L）:2.5mgCocl2.H20、1.5mgCuCl2.2H2O、3mgH3BO3、2.5mgNa2MoO4.H2O、8mgZn(CH3COO)2.2H2O、804mgFitriplexⅢ、60mgFe(Ⅲ)citrate、12.3mgMnCl2.2H2O、15.04mgMnCl2.4H2O、4.5mg维生素B(4℃保存)氨苄青霉素（Amp）:制备浓度为100mg/mL，过滤除菌，-20℃分装保存3.1.3主要仪器超净工作台、高压灭菌锅、恒温振荡培养箱、紫外分光光度计、PH计、超低温冰箱、5L发酵罐、超速冷冻离心机3.2实验方法3.2.1培养基配制（1）活化培养基氨苄青霉素抗性固体LB培养基（1L）：蛋白胨10g/L、NaCl10g/L、酵母粉5g/L、琼脂粉15g/L、2.5mL氨苄青霉素（2）种子培养基氨苄青霉素抗性LB培养基（1L）：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、NaCl10g/l、2.5mL氨苄青霉素（3）摇瓶培养基氨苄青霉素抗性LB培养基（1L）：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、NaCl10g/l、2.5mL氨苄青霉素（4）优化培养基及发酵培养基磷酸二氢钾13.3g/L、磷酸氢二铵4g/L、柠檬酸1.7g/L、葡萄糖10g/L、七水合硫酸镁1.2g/L以上培养基配置完后均高压蒸汽灭菌锅内121℃灭菌25min3.2.2发酵培养（1）菌种活化实验室将菌种保存于-80℃菌株管（含甘油，）内，由于其活性低，需要先将菌种活化。取实验室保存的菌种接种于含有氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃恒温培养箱中培养12h。（2）种子培养用接种环在含有氨苄青霉素的平板上挑取3个单菌落，于3支标号为①②③的分别装有3mlLB培养基的试管中，37℃、150r/min振荡培养6h。（3）摇瓶培养观察三支试管，选取菌体浓度较大的两支试管，将其转入装有250mlLB液体培养基（含2.5微升氨苄青霉素）的锥形瓶中，标号④⑤，37℃220r/min振荡过夜培养。（4）发酵罐发酵发酵罐空罐洗净后，装入配制好的发酵培养基，培养基中加入500uL消泡剂，在高压蒸汽灭菌锅里121℃灭菌30min。灭菌完成后装配好发酵罐，选取两摇瓶中菌体密度大的一瓶接入发酵罐中进行发酵，并且在重组菌培养过程中每隔1小时使用紫外分光光度仪测定一次OD600值，在发酵罐中细菌生长达到菌体浓度OD600值适当时加入诱导剂IPTG进行诱导培养。（5）发酵罐补料方式重组菌高密度发酵生产外源蛋白的关键技术是补料策略,不同的补料流加方式对同一种菌的生长以及外源蛋白的表达影响不同[18]。目前,人们在葡萄糖对质粒产量和稳定性方面进行了深入的研究。一般认为葡萄糖是一种比较理想的碳源[19]。本实验以葡萄糖作为补料，采用恒速流加补料培养方式。以20%氨水自动调节pH。（6）收集菌体诱导结束后收集菌液，将菌液在超速冷冻离心机以4℃、8000×g离心20min，弃上清，收集菌体沉淀，准确称取后分装与-20℃保存。3.3实验结果3.3.1不同碳源对重组大肠杆菌生长的影响选取葡萄糖、乳糖和蔗糖三种做为常见碳源，将这三种常见碳源分别以10g/L加入LB培养基中，接种重组菌并在37℃、220r/min条件下培养8h，测定菌体湿重和OD600，实验结果做表如表1表1.不同碳源对重组大肠杆菌生长的影响碳源种类菌体湿重OD600葡萄糖乳糖蔗糖3.3.2不同氮源对重组大肠杆菌生长的影响将浓度为10g/L的葡萄糖作为培养基的碳源，添加量以氮元素摩尔数相等为依据[20]，将牛肉膏、蛋白胨、酵母粉、硫酸铵作为不同氮源加入到培养基中，接种重组菌，并在37℃、220r/min培养8h，测定菌体湿重和OD600，实验结果如表2表2.不同氮源对重组大肠杆菌生长的影响氮源种类菌体湿重OD600蛋白胨 牛肉膏酵母粉硫酸铵3.3.3微量元素对重组大肠杆菌生长的影响选取微量元素混合液的量分别为0、0.25mL/L、0.5mL/L、0.75mL/L、1.0mL/L、1.25mL/L、1.50mL/L，添加到培养基中，接种重组菌，并在37℃、220r/min培养8h，测定菌体湿重和OD600，实验结果为表3表3.微量元素对重组大肠杆菌生长的影响微量元素菌体湿重OD60000.25mL/L0.5mL/L0.75mL/L1.0mL/L1.25mL/L1.50mL/L3.3.4不同无机盐对重组大肠杆菌生长的影响一些无机盐与合成胞外产物的动态平衡有关，起到稳定目标产物的作用。加入K+，Cu2+，Co2+，Mn2+，Zn2+等可以促进细胞代谢，有利于细菌的生长和外源蛋白的高表达[21]。本实验选取硫酸镁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和氯化钙四种无机盐分别添加到培养基中，接种重组菌，并在37℃、220r/min培养8h，并测定菌体湿重和OD600，实验结果如表4表4.不同无机盐对重组大肠杆菌生长的影响无机盐种类菌体湿重OD600硫酸镁磷酸氢二钠磷酸二氢钾氯化钙3.3.5基础培养基、优化培养基对重组大肠杆菌生长的影响选择基础培养基和优化培养基分别接种重组菌，在37℃、220r/min培养8h，进行菌体生长密度比较实验，以验证优化培养基对重组大肠杆菌生长的影响，实验结果如表5表5.不同培养基对重组大肠杆菌生长的影响培养基种类菌体湿重OD600基础培养基 优化培养基4重组大肠杆菌发酵条件的优化4.1实验材料与仪器同3.1实验材料与仪器4.2实验方法同3.2实验方法通过培养基的优化实验获得了重组大肠杆菌发酵的优化培养基，以此培养基为基础，用摇瓶培养方式进行重组大肠杆菌发酵培养条件关于接种量、初始pH值、发酵温度、诱导剂浓度以及诱导时机和诱导时长的研究。4.3实验结果4.3.1不同接种量对重组大肠杆菌生长的影响选取接种量分别为2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%进行发酵，测定培养时间为0h、2h、4h、6h、8h时的菌体密度，记录实验结果表6，对比确定最佳接种量。表6.不同接种量时重组大肠杆菌的菌体密度接种量OD6000h2h4h6h8h2% 3%4%5%6%7%8%4.3.2不同初始pH值对重组大肠杆菌生长的影响选取不同初始pH值，分别设置为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6进行发酵，测定培养时间为0h、2h、4h、6h、8h时的菌体密度，记录实验结果为表7，确定培养基最佳初始pH值。表7.不同初始pH值时重组大肠杆菌的菌体密度pH值OD6000h2h4h6h8h4.3.3不同发酵温度对重组大肠杆菌生长的影响将发酵温度维持在33℃、34℃、35℃、36℃、37℃，测定培养时间为0h、2h、4h、6h、8h时菌体的生长密度，记录实验结果为表8，确定最佳培养温度表8.不同发酵温度时重组大肠杆菌的菌体密度发酵温度OD6000h2h4h6h8h33℃ 34℃35℃36℃37℃4.3.4不同诱导时机对重组大肠杆菌生长的影响在菌体生长时，选择OD600值为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0时，使用IPTG（浓度为100mg/mL）进行诱导，继续培养5h候测定菌体密度。记录实验结果为表9，对比选取最佳诱导时机。表9.不同OD600值诱导5h后菌体密度OD6002.02.53.03.54.04.55.05h后菌体密度4.3.5不同诱导时长对重组大肠杆菌生长的影响在菌体生长达到最佳诱导时机时，使用诱导剂IPTG（浓度为）进行诱导，诱导时长分别为2h、4h、6h、8h、10h和12h，分别测定OD600。记录实验结果表10.，对比选取最佳诱导时长。表10.不同诱导时长时菌体密度OD600诱导时长2h4h6h8h10h12hOD6004.3.6不同浓度诱导剂对重组大肠杆菌生长表达的影响在菌体生长达到最佳诱导时机时，选取浓度分别为50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL的诱导剂IPTG进行诱导，继续培养5小时候测定菌体密度。记录实验结果为表11，对比选取最佳诱导剂浓度。表11.加入不同诱导剂浓度培养5h后OD600IPTG浓度5060708090100（mg/mL）OD600根据以上研究实验，最终确定重组大肠杆菌的高密度发酵的最佳培养条件。5.重组大肠杆菌高密度发酵条件摸索及验证5.1实验材料与仪器同3.1实验材料与仪器5.2实验方法同3.2实验材料与仪器发酵罐中装入3L发酵罐培养基，通气量1L/min，初始温度35℃、pH6.8、溶氧在20%-50%范围内时接种种子液5%，初始搅拌速率为50rpm，搅拌速率根据溶氧变化进行调节。5.3实验结果5.3.1pH值对重组大肠杆菌高密度发酵的影响设定溶氧为40%，发酵温度为35℃，选取pH值分别为6.6、6.8、7.0、7.2、7.4培养，每隔2h测定一次菌体密度，实验结果记录表12表12.pH值对高密度培养重组大肠杆菌生长的影响pHOD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h.2发酵温度对重组大肠杆菌高密度发酵的影响设定溶氧为40%，pH值为6.8，选取发酵温度分别为34℃、35℃、36℃、37℃、38℃培养，并每隔2h测定菌体密度，实验结果记录表13表13.发酵温度对高密度培养重组大肠杆菌生长的影响发酵温度OD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h34℃35℃36℃37℃38℃5.3.3不同溶氧量对重组大肠杆菌高密度发酵的影响设定发酵温度为35℃，pH值为6.8，选取10%、20%、30%、40%、50%培养，并每隔2h测定一次菌体密度，实验结果记录表14表14.溶氧量对高密度培养重组大肠杆菌生长的影响溶氧量OD6004h6h8h10h12h14h16h18h20h10%20%30%40%50%根据表12、13、14，最终可确定发酵罐中重组大肠杆菌高密度发酵的最佳培养条件。6前期研究基础指导教师彭礼飞老师课题组已建立了SMNE融合蛋白的原核表达系统，该融合蛋白带有一段促进表达的分子伴侣、方便纯化的组氨酸Tag及切割去掉融合伴侣的肠激酶酶切位点。并且项目组内已经成功发酵收获了该工程菌。7可行性分析7.1理论可行性已通过查阅文献资料了解了大肠杆菌工程菌的高密度培养技术，并根据资料设计了一系列对高密度发酵工艺的优化方案。7.2技术可行性本人已在彭礼飞教授课题组受到了关于发酵的科研训练，已熟练掌握细菌培养等基本技术。且目前仍在彭礼飞老师指导下开展本项研究。7.3条件可行性项目组指导教师彭礼飞老师课题组已建立了SMNE融合蛋白的原核表达系统，并且本实验依托广东医科大学基础医学实验室及彭礼飞老师课题组，开展实验所需仪器设备条件实验室均能提供。8创新性分析本实验使用了指导教师彭礼飞教授课题组已构建的带有SMNE融合蛋白的重组大肠杆菌进行高密度发酵工艺的优化，包括对培养基组成和培养条件进行优化，从而达到目的。9预期实验结果（1）确定了重组大肠杆菌高密度发酵的培养基配方（2）确定了重组大肠杆菌发酵的最佳培养条件（3）采用优化后的培养基和培养条件对重组大肠杆菌进行高密度发酵从而得高产量的重组菌。参考文献[1]张瑜,郑伟,顾剑飞,等.Serratia

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