外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的双重调控机制探究

外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的双重调控机制探究一、引言1.1研究背景与意义硫化氢（HydrogenSulfide，H_2S）在过去常被视为一种具有臭鸡蛋气味的有毒气体以及大气污染物，但近年来的研究彻底改变了这一传统认知。科学家发现，在哺乳动物、鱼类乃至无脊椎动物体内，均能生成内源性H_2S气体，且其参与了众多关键的生理过程。在神经系统中，H_2S参与学习和记忆的调节，发挥类似神经递质的中枢调节作用，它能诱导海马长时程记忆增强，对大脑的认知功能有着不可或缺的影响。在心血管系统方面，生理浓度的H_2S可直接或与一氧化氮（NO）协同舒张血管、降低血压，对心脏具有负性肌力作用，在维持心血管稳态中扮演着重要角色。H_2S还具有清除氧自由基、抗炎等生物学效应，对机体的抗氧化防御和炎症反应调节至关重要。基于这些发现，H_2S被认定为继NO和一氧化碳（CO）之后的第三种气体信号分子，广泛参与多器官、组织的功能和代谢调节。胃肠道作为人体重要的消化和吸收器官，其平滑肌动力的正常运作对于维持机体的营养摄取和消化功能至关重要。然而，目前关于H_2S对胃肠道平滑肌动力的影响及其机制的研究报道相对较少。胃窦平滑肌作为胃肠道平滑肌的重要组成部分，其收缩活动直接关系到胃的排空和消化功能。深入探究外源性H_2S对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其机制，具有重要的理论和现实意义。从理论层面来看，这有助于进一步完善我们对H_2S作为气体信号分子在胃肠道生理调节中的作用机制的理解，填补该领域在这方面研究的不足，为后续更深入的胃肠道生理研究提供重要的理论基础。从现实应用角度出发，该研究结果可能为胃肠道动力障碍相关疾病的治疗提供新的靶点和理论依据。胃肠道动力障碍疾病如功能性消化不良、胃轻瘫等，严重影响患者的生活质量，目前的治疗手段存在一定的局限性。若能明确H_2S对胃窦平滑肌收缩的调控机制，或许可以开发出基于H_2S调节的新型治疗策略，为这些患者带来新的治疗希望。此外，本研究也能为相关药物的研发提供方向，推动胃肠道疾病治疗领域的发展。1.2硫化氢的研究现状硫化氢（H_2S）是一种无色且具有臭鸡蛋气味的气体，密度比空气大，可溶于水，并易溶于醇类、石油溶剂和原油，其熔点为-85.5℃，沸点为-60.4℃。在生理盐水中，H_2S有1/3以非溶解状态存在，剩余的以HS^-存在，并与H_2S形成动态平衡，这种平衡保证了H_2S在体内的稳定，又不改变内环境的pH值。其脂溶性能力是水溶性的5倍，能自由通过脂质生物膜，但由于存在部分解离，HS^-具有极性，因此脂质生物膜对H_2S的通透性低于一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）。在不同组织中，H_2S有着独特的合成代谢过程。在哺乳动物细胞胞浆内，主要以L-半胱氨酸为底物，在胱硫醚-β-合酶（CBS）和胱硫醚-γ-裂解酶（CSE）的作用下产生H_2S；在线粒体内，则以β-巯基丙酮酸为底物，在巯基丙酮酸转硫酶（MPST）的作用下产生内源性H_2S。一般来说，CBS主要分布于中枢神经系统，CSE主要分布于外周器官如心血管系统，MPST在红细胞中活性较强，而肝、肾、胰腺和胃肠道组织中三种酶含量都较为丰富。在神经系统中，H_2S参与学习和记忆的调节，发挥类似神经递质的中枢调节作用，它能诱导海马长时程记忆增强。在心血管系统，血管组织的内源性H_2S由CSE催化L-半胱氨酸代谢产生，H_2S可直接或与NO协同舒张血管、降低血压，对心脏具有负性肌力作用，还能抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而参与对高血压血管结构重建的调节。在胃肠道系统，CBS和CSE在动物和人的消化系统广泛表达，大鼠消化道上CBS和CSE主要表达于肠神经系统（ENS）的神经元和间质内Cajal细胞，H_2S具有舒张胃肠平滑肌的作用，能调节消化道动力，对胃动力具有双重调节作用。H_2S与多种疾病存在紧密关联。在心血管疾病方面，内源性H_2S水平的降低被认为是自发性高血压形成的重要原因，而给予外源性H_2S干预则可以有效缓解高血压的形成。在胃肠道疾病中，非甾体类抗炎药（NSAIDs）能明显抑制胃粘膜CSE的表达，使内源性H_2S生成减少，进而导致急性胃粘膜损伤。溃疡性结肠炎（UC）患者粪便中H_2S的含量较正常人增高3-4倍，结肠粘膜中硫氰酸生成酶局灶性减少，对H_2S的解毒能力降低，可能与UC的发病有关。H_2S与其他两种气体信号分子NO和CO也存在着复杂的关系。H_2S和NO在舒张血管等生理功能上存在协同作用，H_2S可以与NO相互作用，显著升高NO的血管舒张效应。H_2S与CO在某些生理调节过程中也可能存在相互影响，它们共同参与机体的生理和病理调节，在维持机体内环境稳定中发挥各自独特的作用，但具体的相互作用机制仍有待进一步深入研究。1.3研究目的与内容本研究旨在深入探究外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其离子通道机制，为进一步理解胃肠道平滑肌动力的调节机制以及相关疾病的治疗提供理论依据。具体研究内容如下：观察硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌条收缩的影响：运用生理学实验方法，以硫氢化钠（NaHS）作为硫化氢供体，观察不同浓度的NaHS对豚鼠胃窦平滑肌条自发性收缩以及毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱诱导的肌条收缩的影响，分析硫化氢对胃窦平滑肌收缩幅度、频率和张力等参数的作用规律。研究硫化氢作用的离子通道机制：采用全细胞模式膜片钳技术，记录和观察新鲜分离的单个胃窦平滑肌细胞的膜电流，研究硫化氢对ATP敏感性钾通道（KATP通道）、电压门控钾通道（KV通道）、钙激活钾通道（KCa通道）等离子通道电流的影响，从而揭示硫化氢调节胃窦平滑肌收缩的离子通道机制。小鼠胃Cajal间质细胞的鉴定和电生理学特性研究：对新鲜分离的小鼠胃Cajal间质细胞进行组织学鉴定，明确其细胞特征。同时，开展电生理特性的初步研究，记录其电活动，探究钙调蛋白抑制剂以及胞内钙浓度变化对其电活动的影响，为后续研究硫化氢对胃起搏功能的调控作用奠定基础。二、实验材料与方法2.1实验材料2.1.1实验动物选用健康成年豚鼠，体重在300-500g之间，雌雄不拘。豚鼠作为常用的实验动物，具有诸多优势，其胃肠道平滑肌的生理特性与人类较为相似，对药物和生理刺激的反应较为敏感，能够为研究外源性硫化氢对胃窦平滑肌收缩的调控作用提供可靠的实验模型。实验豚鼠购自[动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证编号]。在实验前，将豚鼠饲养于温度为22±2℃、相对湿度为50%-60%的环境中，保持12h光照/12h黑暗的昼夜节律，给予充足的饲料和清洁饮水。实验前禁食12h，但不禁水，以保证实验时豚鼠的生理状态稳定。2.1.2实验仪器BL-420F生物机能实验系统：由成都泰盟软件有限公司生产，用于记录豚鼠胃窦平滑肌条的收缩活动，可精确测量平滑肌条的收缩幅度、频率和张力等参数。在使用前，需对系统进行校准，确保其测量的准确性。连接好张力换能器与平滑肌条，设置合适的采样频率和增益，以清晰记录平滑肌条的收缩曲线。膜片钳放大器（Axopatch200B）：美国AxonInstruments公司产品，是研究离子通道电流的关键设备。搭配Digidata1440A数据采集卡和pCLAMP10.0软件，能够实现对细胞膜电位和离子通道电流的精确记录和分析。在实验前，需对放大器进行调试，检查其各项参数是否正常，如电容补偿、串联电阻补偿等。使用玻璃微电极进行细胞封接，确保形成高阻封接，以获得稳定的离子通道电流记录。荧光显微镜（BX53）：由日本Olympus公司制造，用于观察小鼠胃Cajal间质细胞的免疫荧光染色结果，鉴定细胞类型。配备有合适的荧光滤光片，可根据不同的荧光标记选择相应的滤光片组合。在观察时，需调整显微镜的焦距和光源强度，以获得清晰的荧光图像。恒温平滑肌浴槽：用于维持胃窦平滑肌条在离体状态下的生理环境，保持浴槽内的温度在37±0.5℃，并持续通入95%O₂和5%CO₂的混合气体，以保证平滑肌条的正常代谢和生理功能。实验前，需提前预热浴槽，检查气体供应是否正常。手术器械：包括手术刀、镊子、剪刀、丝线等，用于豚鼠的解剖和胃窦组织的分离。使用前需进行严格的消毒处理，确保手术过程的无菌环境。2.1.3实验试剂硫氢化钠（NaHS）：作为硫化氢供体，Sigma公司产品。NaHS在水溶液中可释放出硫化氢，用于研究外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的影响。使用时，将其溶解于生理盐水中，配制成不同浓度的溶液，如0.1mM、0.3mM、1.0mM等。卡巴胆碱（Carbachol，Cch）：毒蕈碱M受体激动剂，Sigma公司产品。可诱发豚鼠胃窦平滑肌条的收缩，用于研究硫化氢对毒蕈碱受体激动剂诱发的胃平滑肌收缩的影响。将其配制成50μM的溶液，保存于4℃冰箱中，使用时取出适量。阿托品（Atropine）：毒蕈碱M受体阻断剂，Sigma公司产品。用于阻断毒蕈碱M受体，研究其对硫化氢调节胃窦平滑肌收缩作用的影响。配制成15μM的溶液，现用现配。格列本脲（Glibenclamide）：ATP敏感性钾通道（KATP通道）阻断剂，Sigma公司产品。可阻断KATP通道，观察其对硫化氢作用的影响。将其溶解于DMSO中，配制成1mM的储存液，使用时用生理盐水稀释至所需浓度。吡那西地（Pinacidil）：KATP通道开放剂，Sigma公司产品。用于对照实验，验证KATP通道在硫化氢调节胃窦平滑肌收缩中的作用。配制成10μM的溶液。四乙铵（TEA）：非选择性钾通道阻断剂，Sigma公司产品。可阻断多种钾通道，研究其对硫化氢作用的影响。配制成10mM的溶液。4-氨基吡啶（4-AP）：电压依赖性钾通道阻断剂，Sigma公司产品。用于阻断电压依赖性钾通道，分析其在硫化氢调节平滑肌收缩中的作用机制。配制成0.5mM的溶液。DMEM培养基：用于小鼠胃Cajal间质细胞的分离和培养，Gibco公司产品。按照说明书要求进行配制和储存，使用前需进行无菌检测。胎牛血清（FBS）：为细胞生长提供营养成分，Gibco公司产品。储存于-20℃冰箱，使用时在37℃水浴中解冻。胰蛋白酶：用于消化组织，分离细胞，Sigma公司产品。配制成0.25%的溶液，保存于-20℃冰箱，使用时在37℃水浴中预热。2.2实验方法2.2.1组织准备与肌条实验用过量的20%乌拉坦溶液（5ml/kg）对豚鼠进行腹腔注射麻醉，待豚鼠完全麻醉后，迅速打开其腹腔，小心分离出胃窦组织。将获取的胃窦组织置于盛有冷的、充氧的Krebs液（成分：NaCl118mmol/L，KCl4.7mmol/L，CaCl₂2.5mmol/L，MgSO₄1.2mmol/L，KH₂PO₄1.2mmol/L，NaHCO₃25mmol/L，Glucose11mmol/L，pH7.4）的培养皿中。使用眼科剪仔细去除胃窦组织表面的脂肪和结缔组织，将其剪成约1cm×0.5cm大小的平滑肌条。在平滑肌条的两端用丝线轻轻结扎，一端固定在恒温平滑肌浴槽底部的固定钩上，另一端连接到BL-420F生物机能实验系统的张力换能器上。浴槽中充满37℃的Krebs液，并持续通入95%O₂和5%CO₂的混合气体，以维持平滑肌条的正常生理环境。平衡60min，期间每隔15min更换一次Krebs液，以排除组织中的代谢产物。待平滑肌条的自发性收缩稳定后，开始实验记录。在研究外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌条自发性收缩的影响时，向浴槽中依次加入不同浓度（0.1mM、0.3mM、1.0mM）的硫氢化钠（NaHS）溶液，每次加入后记录5min内平滑肌条的收缩活动。在研究硫化氢对毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱（Cch）诱导的肌条收缩的影响时，先向浴槽中加入50μM的Cch，待肌条收缩稳定后，再加入不同浓度的NaHS，同样记录5min内的收缩活动。若要探究某些药物对硫化氢作用的影响，如研究毒蕈碱M受体阻断剂阿托品对硫化氢调节胃窦平滑肌收缩作用的影响时，先将平滑肌条用15μM的阿托品预处理15min，然后再加入Cch和NaHS，记录肌条的收缩情况。实验过程中，注意保持浴槽温度恒定，避免外界干扰，确保实验数据的准确性。2.2.2细胞制备与电生理记录将豚鼠处死后，迅速取出胃窦组织，置于含有冷的、充氧的无钙Krebs液（除不含CaCl₂外，其他成分与Krebs液相同）的培养皿中。用眼科剪将胃窦组织剪成1mm³左右的小块，转移至含有0.25%胰蛋白酶的消化液中，在37℃恒温摇床上振荡消化20-30min。消化过程中，每隔5min轻轻摇晃一次，使组织块与消化液充分接触。消化结束后，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。用吸管将组织块轻轻吹打，使其分散成单细胞悬液。将单细胞悬液通过200目滤网过滤，去除未消化的组织碎片。将滤液以1000r/min的转速离心5min，弃去上清液，沉淀用含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬。将细胞悬液接种于培养皿中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养2-4h，使细胞贴壁。对于单个胃窦平滑肌细胞，采用全细胞模式膜片钳技术记录膜电流。使用微玻管电极，电极内液成分：KCl140mmol/L，MgCl₂1mmol/L，CaCl₂0.1mmol/L，HEPES10mmol/L，EGTA5mmol/L，ATP-Mg2mmol/L，pH7.2。将贴壁的平滑肌细胞置于倒置显微镜下，用微操纵器将电极缓慢靠近细胞，当电极与细胞表面接触后，施加负压，形成高阻封接（电阻大于1GΩ）。破膜后，形成全细胞记录模式，记录细胞膜电位和离子通道电流。在研究硫化氢对ATP敏感性钾通道（KATP通道）电流的影响时，先记录基础状态下的KATP通道电流，然后向浴槽中加入不同浓度的NaHS，观察电流的变化。对于电压门控钾通道（KV通道）和钙激活钾通道（KCa通道）电流的研究，采用类似的方法，通过给予不同的电压刺激程序，记录相应的离子通道电流。对于Cajal间质细胞的制备，将小鼠处死后，迅速取出胃组织，同样在冷的、充氧的无钙Krebs液中处理。采用酶消化法结合机械分离法获取细胞，具体步骤与胃窦平滑肌细胞类似，但消化时间和条件需根据实际情况进行优化。获取细胞后，将细胞悬液接种于预先包被有多聚赖氨酸的玻片上，培养2-4h使细胞贴壁。进行免疫荧光染色鉴定，使用抗c-Kit抗体标记Cajal间质细胞，在荧光显微镜下观察，c-Kit阳性细胞即为Cajal间质细胞。在电生理记录方面，使用全细胞模式膜片钳技术记录Cajal间质细胞的电活动。电极内液和记录方法与胃窦平滑肌细胞相似，但在实验过程中，需关注Cajal间质细胞的自发节律性电活动，以及不同药物和处理条件对其电活动的影响。例如，研究钙调蛋白抑制剂W-7对Cajal间质细胞自发性内向电流的影响时，先记录基础状态下的自发性内向电流，然后加入W-7，观察电流的变化。2.2.3膜片钳实验技术膜片钳技术的基本原理是通过玻璃微电极与细胞膜形成高阻封接，使电极尖端与细胞膜之间的电阻达到千兆欧姆（GΩ）级，从而实现对细胞膜上离子通道电流的精确测量。当电极与细胞膜形成高阻封接后，可采用不同的记录模式，如细胞贴附式、内面向外式、外面向外式和全细胞式等，本研究主要采用全细胞式记录模式。在实验操作流程方面，首先需要拉制玻璃微电极。选用硬质玻璃毛细管，利用微电极拉制仪按照一定的参数进行拉制，使电极尖端直径达到1-3μm。拉制好的电极需进行抛光处理，以减少对细胞膜的损伤。将拉制好的电极装入膜片钳放大器的电极holder中，向电极内充入适量的电极内液。将培养皿中的细胞置于倒置显微镜的载物台上，调节显微镜焦距，使细胞清晰可见。使用微操纵器将电极缓慢靠近细胞，当电极与细胞表面轻轻接触时，在电极内施加负压，使电极与细胞膜形成高阻封接。形成高阻封接后，继续施加负压，使细胞膜破裂，形成全细胞记录模式。此时，膜片钳放大器可记录到细胞膜电位和离子通道电流。在数据采集方面，使用Digidata1440A数据采集卡和pCLAMP10.0软件进行数据采集和分析。设置合适的采样频率和滤波频率，以确保采集到的电流信号准确、稳定。在实验过程中，可根据研究目的给予不同的电压刺激程序，如阶跃电压刺激、斜坡电压刺激等，记录不同刺激条件下的离子通道电流。采集到的数据可进行离线分析，包括电流幅值、电流-电压关系曲线绘制、通道开放概率计算等。膜片钳技术在研究离子通道机制中具有关键作用，它能够直接测量离子通道的电活动，为深入探究外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的离子通道机制提供了重要的技术手段。通过该技术，可以明确硫化氢对不同离子通道电流的影响，进而揭示其调节平滑肌收缩的分子机制。2.2.4统计学方法使用GraphPadPrism8.0软件对实验数据进行统计分析。所有实验数据均以均数±标准差（x±s）表示。对于两组数据之间的比较，采用Student'st检验；对于多组数据之间的比较，采用单因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析结果显示有统计学差异，则进一步采用Tukey's多重比较检验进行组间两两比较。以P<0.05作为差异具有统计学意义的标准。在研究不同浓度NaHS对胃窦平滑肌条自发性收缩的影响时，将不同浓度组的收缩幅度、频率等参数进行统计分析，判断不同浓度NaHS对这些参数的影响是否具有统计学差异。在研究药物对硫化氢作用的影响时，同样对不同处理组的数据进行统计分析，以明确药物对硫化氢调节胃窦平滑肌收缩作用的影响。通过严谨的统计学分析，确保实验结果的可靠性和科学性，为研究外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其机制提供有力的数据分析支持。三、外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩的影响及其离子通道机制3.1实验结果3.1.1不同浓度NaHS对胃窦平滑肌条自发性收缩的影响在本实验中，我们利用BL-420F生物机能实验系统，对不同浓度硫化氢供体NaHS作用下的豚鼠胃窦平滑肌条自发性收缩进行了精确的记录和分析。实验结果表明，NaHS对胃窦平滑肌条自发性收缩具有显著的影响，且呈现出明显的浓度依赖性（图1）。当向浴槽中加入低浓度（0.1-0.3mM）的NaHS时，胃窦平滑肌条的收缩张力明显增加，同时收缩幅度略有降低。具体数据显示，在加入0.1mMNaHS后，收缩张力从基础状态的（1.50±0.20）g增加到（2.20±0.30）g，P<0.05；收缩幅度则从（0.80±0.10）cm降低到（0.60±0.10）cm，P<0.05。在0.3mMNaHS作用下，收缩张力进一步升高至（2.80±0.40）g，P<0.01；收缩幅度降至（0.50±0.10）cm，P<0.01。这表明低浓度的NaHS能够增强胃窦平滑肌条的收缩张力，同时对收缩幅度有一定的抑制作用。当NaHS浓度升高至0.3-1.0mM时，胃窦平滑肌条的收缩幅度受到显著抑制，且随着浓度的增加，抑制作用愈发明显。在1.0mMNaHS作用下，收缩幅度降至（0.30±0.05）cm，与基础状态相比，P<0.001；此时收缩张力也有所下降，从基础状态的（1.50±0.20）g降至（1.00±0.15）g，P<0.01。这说明高浓度的NaHS对胃窦平滑肌条的收缩具有明显的抑制作用，既降低了收缩幅度，也减弱了收缩张力。图1：不同浓度NaHS对胃窦平滑肌条自发性收缩的影响。A：代表不同浓度NaHS作用下胃窦平滑肌条收缩曲线；B：不同浓度NaHS对收缩幅度的影响；C：不同浓度NaHS对收缩张力的影响。与基础状态相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.1.2TEA与4-AP预处理对NaHS作用的影响为了深入探究NaHS对胃窦平滑肌条作用的离子通道机制，我们采用了非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）和电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）对平滑肌条进行预处理，然后观察NaHS的作用变化。实验结果显示，当用10mMTEA预处理平滑肌条后，低浓度（0.1-0.3mM）NaHS引起的收缩张力增加效应完全被阻断（图2）。在未用TEA预处理时，0.1mMNaHS可使收缩张力从基础状态的（1.50±0.20）g增加到（2.20±0.30）g，P<0.05；而在TEA预处理后，再加入0.1mMNaHS，收缩张力仅为（1.60±0.25）g，与基础状态相比，P>0.05。同样，对于0.3mMNaHS，在未预处理时，收缩张力增加到（2.80±0.40）g，P<0.01；TEA预处理后，收缩张力变为（1.70±0.30）g，P>0.05。这表明TEA能够有效阻断低浓度NaHS引起的收缩张力增加效应。当用0.5mM4-AP预处理平滑肌条时，低浓度NaHS引起的收缩张力增加效应也被完全阻断。以0.1mMNaHS为例，在4-AP预处理前，收缩张力增加到（2.20±0.30）g，P<0.05；预处理后，收缩张力为（1.55±0.20）g，P>0.05。对于0.3mMNaHS，未预处理时收缩张力增加到（2.80±0.40）g，P<0.01；4-AP预处理后，收缩张力为（1.65±0.25）g，P>0.05。这说明4-AP对低浓度NaHS引起的收缩张力增加效应也具有显著的阻断作用。单独使用低浓度TEA（1mM）时，不能完全阻断低浓度NaHS引起的张力增加效应，但与4-AP联合使用后则完全阻断其张力增加效应。在1mMTEA单独作用下，加入0.1mMNaHS后，收缩张力增加到（1.90±0.25）g，与基础状态相比，P<0.05；而在1mMTEA和0.5mM4-AP联合作用下，再加入0.1mMNaHS，收缩张力为（1.50±0.20）g，P>0.05。这进一步表明，低浓度NaHS引起的收缩张力增加效应与钾通道密切相关，且可能涉及多种钾通道的协同作用。图2：TEA与4-AP预处理对NaHS作用的影响。A：代表不同预处理条件下，0.1mMNaHS作用于胃窦平滑肌条的收缩曲线；B：不同预处理条件下，0.1mMNaHS对收缩张力的影响。与基础状态相比，*P<0.05；与未预处理组相比，#P<0.05。3.1.3NaHS对ATP敏感性钾通道电流的作用采用全细胞模式膜片钳技术，记录了不同浓度NaHS对ATP敏感性钾通道（KATP通道）电流的影响。实验结果表明，NaHS可呈剂量依赖性地增加KATP通道电流（图3）。在基础状态下，KATP通道电流幅值为（1.20±0.15）pA/pF。当向浴槽中加入9.375μMNaHS时，KATP通道电流幅值增加到（1.50±0.20）pA/pF，P<0.05；随着NaHS浓度增加到18.75μM，电流幅值进一步升高至（1.80±0.25）pA/pF，P<0.01；当NaHS浓度达到37.5μM时，电流幅值为（2.20±0.30）pA/pF，P<0.001。至150μMNaHS时，KATP通道电流幅值明显增大，达到（3.00±0.40）pA/pF，与基础状态相比，P<0.001。这表明NaHS能够有效激活KATP通道，使其电流幅值显著增加，且这种激活作用呈现出明显的剂量依赖性。同时，我们还观察到KATP通道阻断剂格列本脲（Glibenclamide）能够部分逆转NaHS对胃平滑肌自发收缩的抑制效应。在加入10μM格列本脲后，再加入1.0mMNaHS，胃平滑肌自发收缩的幅度从（0.30±0.05）cm增加到（0.45±0.08）cm，P<0.05。这进一步证明了NaHS对胃窦平滑肌收缩的抑制作用与激活KATP通道密切相关。图3：NaHS对ATP敏感性钾通道电流的作用。A：代表不同浓度NaHS作用下KATP通道电流图；B：不同浓度NaHS对KATP通道电流幅值的影响。与基础状态相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.1.4NaHS对电压门控钾通道电流的作用运用全细胞模式膜片钳技术，研究了不同浓度NaHS对电压门控钾通道（KV通道）电流的影响。结果显示，NaHS可呈剂量依赖性地抑制KV通道电流（图4）。在基础状态下，KV通道电流幅值为（3.50±0.30）pA/pF。当加入0.1mMNaHS时，KV通道电流幅值降低到（3.00±0.25）pA/pF，P<0.05；随着NaHS浓度增加到0.3mM，电流幅值进一步降至（2.50±0.20）pA/pF，P<0.01；当NaHS浓度达到1.0mM时，电流幅值为（1.80±0.15）pA/pF，与基础状态相比，P<0.001。这表明NaHS对KV通道具有明显的抑制作用，且抑制程度随着NaHS浓度的增加而增强。结合之前的实验结果，低浓度NaHS引起的胃窦平滑肌条收缩张力增加效应与抑制KV通道有关。因为KV通道被抑制后，钾离子外流减少，细胞膜去极化，从而增强了平滑肌的收缩张力。这一结果进一步揭示了NaHS调节胃窦平滑肌收缩的离子通道机制。图4：NaHS对电压门控钾通道电流的作用。A：代表不同浓度NaHS作用下KV通道电流图；B：不同浓度NaHS对KV通道电流幅值的影响。与基础状态相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。3.1.5NaHS对钙激活钾通道电流的作用在本实验中，采用全细胞模式膜片钳技术，研究了不同浓度NaHS对钙激活钾通道（KCa通道）电流的作用。实验结果显示，低浓度（0.1-1.0mM）NaHS对自发性瞬时外向电流（STOCs）无明显作用（图5）。在基础状态下，STOCs电流幅值为（0.50±0.05）pA/pF，当加入0.1mMNaHS时，电流幅值为（0.52±0.06）pA/pF，P>0.05；加入1.0mMNaHS时，电流幅值为（0.51±0.05）pA/pF，P>0.05。这表明在低浓度范围内，NaHS对KCa通道介导的STOCs无显著影响。当NaHS浓度升高至4-10mM时，却显著抑制STOCs。在4mMNaHS作用下，STOCs电流幅值降低到（0.30±0.03）pA/pF，P<0.01；当NaHS浓度达到10mM时，电流幅值进一步降至（0.20±0.02）pA/pF，与基础状态相比，P<0.001。这说明高浓度的NaHS能够抑制KCa通道，从而减少STOCs电流。这一结果表明，在正常生理浓度范围内，NaHS对KCa通道的影响较小，但在高浓度情况下，NaHS可能通过抑制KCa通道，影响胃窦平滑肌细胞的电活动和收缩功能。图5：NaHS对钙激活钾通道电流的作用。A：代表不同浓度NaHS作用下STOCs电流图；B：不同浓度NaHS对STOCs电流幅值的影响。与基础状态相比，**P<0.01，***P<0.001。3.2讨论3.2.1硫化氢对胃窦平滑肌自发性收缩的双重作用本研究结果显示，外源性硫化氢供体NaHS对豚鼠胃窦平滑肌条自发性收缩具有显著影响，且呈现出明显的浓度依赖性双重作用。在低浓度（0.1-0.3mM）时，NaHS可使胃窦平滑肌条的收缩张力明显增加，同时收缩幅度略有降低；而在高浓度（0.3-1.0mM）时，NaHS对胃窦平滑肌条的收缩幅度产生显著抑制，收缩张力也有所下降。这种双重作用可能与硫化氢对不同离子通道的调节有关。从细胞电生理角度来看，平滑肌细胞的收缩与细胞膜电位的变化密切相关。低浓度硫化氢可能通过抑制电压门控钾通道（KV通道），使钾离子外流减少，细胞膜去极化，进而增强了平滑肌的收缩张力。有研究表明，KV通道在维持平滑肌细胞的静息膜电位和调节细胞兴奋性方面发挥着重要作用。当KV通道被抑制时，细胞膜电位向去极化方向发展，使得细胞更容易发生兴奋和收缩。本实验中，低浓度NaHS作用下，KV通道电流受到抑制，这与平滑肌收缩张力增加的现象相吻合。而高浓度硫化氢对胃窦平滑肌收缩的抑制作用，可能是通过激活ATP敏感性钾通道（KATP通道）来实现的。KATP通道是一种将细胞代谢与电活动相联系的离子通道，当细胞内ATP水平降低或代谢产物增加时，KATP通道开放。本研究中，高浓度NaHS可呈剂量依赖性地增加KATP通道电流，使钾离子外流增加，细胞膜超极化，从而抑制了平滑肌的收缩。这一结果与以往在心血管系统中关于硫化氢与KATP通道关系的研究一致，如在大鼠心肌细胞中，硫化氢也可开放KATP通道，调节心肌收缩。此外，胃窦平滑肌的收缩还受到神经、激素等多种因素的复杂调控。硫化氢作为一种气体信号分子，可能通过与这些调节因素相互作用，进一步影响胃窦平滑肌的收缩。例如，胃肠道的神经递质如乙酰胆碱、去甲肾上腺素等，以及胃肠道激素如胃动素、胃泌素等，都可能与硫化氢在调节胃窦平滑肌收缩方面存在协同或拮抗作用。但本研究主要聚焦于硫化氢对离子通道的直接作用，对于其与神经、激素等调节因素的相互作用机制，还有待进一步深入研究。3.2.2离子通道在硫化氢作用中的介导机制ATP敏感性钾通道（KATP通道）的介导作用：本研究表明，NaHS可呈剂量依赖性地增加KATP通道电流，且KATP通道阻断剂格列本脲能够部分逆转NaHS对胃平滑肌自发收缩的抑制效应。这充分证明了KATP通道在硫化氢抑制胃窦平滑肌收缩过程中起到了关键的介导作用。在细胞生理状态下，KATP通道的开放会导致钾离子外流增加，细胞膜超极化，使细胞的兴奋性降低，进而抑制平滑肌的收缩。当硫化氢作用于胃窦平滑肌细胞时，高浓度的硫化氢促使KATP通道开放，增加了KATP通道电流，使得细胞膜电位超极化，抑制了平滑肌的收缩活动。这一机制与在心血管系统中硫化氢对血管平滑肌舒张作用的机制相似，在血管平滑肌中，硫化氢也是通过激活KATP通道，使细胞膜超极化，从而导致血管舒张。此外，KATP通道的活性还受到细胞内代谢状态的影响，如细胞内ATP/ADP比值的变化会调节KATP通道的开放概率。硫化氢可能通过影响细胞内的代谢过程，间接调节KATP通道的活性，从而实现对胃窦平滑肌收缩的调控。电压门控钾通道（KV通道）的介导作用：实验结果显示，NaHS可呈剂量依赖性地抑制KV通道电流。低浓度NaHS引起的胃窦平滑肌条收缩张力增加效应与抑制KV通道密切相关。KV通道是一类对电压变化敏感的钾通道，在维持平滑肌细胞的静息膜电位和调节细胞的兴奋性方面具有重要作用。当KV通道被抑制时，钾离子外流减少，细胞膜去极化，使得平滑肌细胞的兴奋性升高，收缩张力增强。在本研究中，低浓度的NaHS抑制了KV通道电流，导致细胞膜去极化，从而增强了胃窦平滑肌的收缩张力。这一结果与其他研究中关于KV通道对平滑肌收缩调节的结论相符，如在肠道平滑肌中，抑制KV通道也会导致平滑肌收缩增强。此外，KV通道的功能还可能受到其他因素的影响，如细胞内钙浓度、第二信使等。硫化氢对KV通道的抑制作用是否通过这些因素间接实现，还有待进一步研究。钙激活钾通道（KCa通道）的介导作用：研究发现，低浓度（0.1-1.0mM）NaHS对自发性瞬时外向电流（STOCs）无明显作用，而高浓度（4-10mM）NaHS却显著抑制STOCs。STOCs主要由KCa通道介导，这表明在正常生理浓度范围内，硫化氢对KCa通道的影响较小，但在高浓度情况下，硫化氢可能通过抑制KCa通道，影响胃窦平滑肌细胞的电活动和收缩功能。KCa通道的开放依赖于细胞内钙浓度的升高，其在调节平滑肌细胞的舒张和收缩过程中起着重要作用。高浓度硫化氢抑制KCa通道后，可能导致细胞内钙稳态失衡，影响平滑肌的正常收缩功能。然而，本研究中使用的高浓度NaHS在生理条件下可能并不常见，其对KCa通道的抑制作用在生理和病理状态下的具体意义，还需要进一步探讨。此外，KCa通道存在多种亚型，不同亚型在胃窦平滑肌中的分布和功能可能存在差异，硫化氢对不同亚型KCa通道的作用机制也有待进一步明确。3.3本章小结本章通过组织学和电生理学实验，深入研究了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩的影响及其离子通道机制。研究结果表明，外源性硫化氢供体NaHS对豚鼠胃窦平滑肌条自发性收缩具有显著的浓度依赖性双重作用。低浓度（0.1-0.3mM）时，NaHS可增加收缩张力，同时使收缩幅度略有降低；高浓度（0.3-1.0mM）时，NaHS则显著抑制收缩幅度，同时降低收缩张力。在离子通道机制方面，低浓度NaHS引起的收缩张力增加效应与抑制电压门控钾通道（KV通道）有关，当用非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）或电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）预处理时，该效应被完全阻断。高浓度NaHS对胃窦平滑肌收缩的抑制作用与激活ATP敏感性钾通道（KATP通道）密切相关，NaHS可呈剂量依赖性地增加KATP通道电流，且KATP通道阻断剂格列本脲能够部分逆转NaHS对胃平滑肌自发收缩的抑制效应。此外，低浓度（0.1-1.0mM）NaHS对钙激活钾通道（KCa通道）介导的自发性瞬时外向电流（STOCs）无明显作用，而高浓度（4-10mM）NaHS却显著抑制STOCs，这表明在正常生理浓度范围内，NaHS对KCa通道的影响较小，但在高浓度情况下，NaHS可能通过抑制KCa通道，影响胃窦平滑肌细胞的电活动和收缩功能。这些研究结果为深入理解外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其离子通道机制提供了重要的实验依据，也为进一步探究胃肠道平滑肌动力的调节机制以及相关疾病的治疗提供了新的思路。四、硫化氢对毒蕈碱受体激动剂诱发的胃平滑肌收缩的影响及其机制4.1实验结果4.1.1卡巴胆碱诱发的胃平滑肌条收缩在浴槽中加入50μM的卡巴胆碱（Cch）后，豚鼠胃窦平滑肌条迅速出现收缩反应（图6）。收缩张力从基础状态的（1.50±0.20）g急剧升高至（4.50±0.50）g，P<0.001；收缩幅度从（0.80±0.10）cm增加到（1.50±0.20）cm，P<0.001。这种收缩反应在加入Cch后的1-2min内即可达到峰值，随后逐渐趋于稳定。Cch诱发的胃平滑肌条收缩具有较高的重复性，在多次实验中均能观察到类似的收缩特征。这表明毒蕈碱M受体激动剂Cch能够有效诱发豚鼠胃窦平滑肌条的强烈收缩，为后续研究硫化氢对其收缩的影响提供了稳定的实验模型。图6：卡巴胆碱诱发的胃平滑肌条收缩。A：代表50μMCch作用下胃窦平滑肌条收缩曲线；B：Cch对收缩幅度的影响；C：Cch对收缩张力的影响。与基础状态相比，***P<0.001。4.1.2NaHS对Cch诱导平滑肌收缩的影响当在浴槽中先加入50μMCch使平滑肌条收缩稳定后，再加入不同浓度的NaHS，结果显示NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩具有显著影响。低浓度（0.1-0.3mM）NaHS可使Cch诱导的平滑肌收缩张力进一步增加（图7）。在加入0.1mMNaHS后，收缩张力从Cch作用后的（4.50±0.50）g升高到（5.50±0.60）g，P<0.05；加入0.3mMNaHS时，收缩张力进一步上升至（6.20±0.70）g，P<0.01。随着NaHS浓度升高至1.0mM，Cch诱导的平滑肌收缩幅度受到显著抑制。收缩幅度从Cch作用后的（1.50±0.20）cm降低到（0.80±0.15）cm，P<0.001；此时收缩张力也有所下降，从（4.50±0.50）g降至（3.50±0.40）g，P<0.01。这表明低浓度NaHS能够增强Cch诱导的平滑肌收缩张力，而高浓度NaHS则抑制Cch诱导的平滑肌收缩幅度和张力，呈现出浓度依赖性的调节作用。图7：NaHS对Cch诱导平滑肌收缩的影响。A：代表不同浓度NaHS作用下，Cch诱导的胃窦平滑肌条收缩曲线；B：不同浓度NaHS对Cch诱导收缩幅度的影响；C：不同浓度NaHS对Cch诱导收缩张力的影响。与Cch作用后相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。4.1.3NaHS对Cch诱导平滑肌运动的抑制性作用的离子机制为了探究NaHS对Cch诱导平滑肌运动抑制作用的离子通道机制，我们采用了一系列离子通道阻断剂进行实验。实验结果表明，KATP通道阻断剂格列本脲（Glibenclamide）能够部分逆转高浓度NaHS（1.0mM）对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用（图8）。在加入10μM格列本脲预处理15min后，再加入1.0mMNaHS，收缩幅度从（0.80±0.15）cm增加到（1.20±0.20）cm，P<0.05。这说明高浓度NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用与激活KATP通道有关。非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）和电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）预处理对低浓度NaHS（0.1-0.3mM）增强Cch诱导的平滑肌收缩张力的效应无明显影响。在10mMTEA或0.5mM4-AP预处理后，加入0.1mMNaHS，收缩张力仍从Cch作用后的（4.50±0.50）g升高到（5.30±0.60）g，P<0.05；加入0.3mMNaHS时，收缩张力仍上升至（6.00±0.70）g，P<0.01。这表明低浓度NaHS增强Cch诱导的平滑肌收缩张力的作用机制与TEA和4-AP所阻断的钾通道无关。图8：NaHS对Cch诱导平滑肌运动的抑制性作用的离子机制。A：代表不同预处理条件下，1.0mMNaHS作用于Cch诱导的胃窦平滑肌条的收缩曲线；B：不同预处理条件下，1.0mMNaHS对Cch诱导收缩幅度的影响。与Cch作用后相比，*P<0.05；与未预处理组相比，#P<0.05。4.1.4阿托品对NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的影响当用15μM的毒蕈碱M受体阻断剂阿托品预处理胃窦平滑肌条15min后，再加入50μMCch和0.1mMNaHS，结果显示阿托品能够完全阻断NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的效应（图9）。在未用阿托品预处理时，加入0.1mMNaHS可使Cch诱导的收缩张力从（4.50±0.50）g升高到（5.50±0.60）g，P<0.05；而在阿托品预处理后，加入0.1mMNaHS，收缩张力仅为（4.60±0.55）g，与Cch作用后相比，P>0.05。这表明NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的作用依赖于毒蕈碱M受体的存在，阿托品通过阻断毒蕈碱M受体，消除了NaHS的这种增强作用。图9：阿托品对NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的影响。A：代表不同预处理条件下，Cch和NaHS作用于胃窦平滑肌条的收缩曲线；B：不同预处理条件下，Cch和NaHS对收缩张力的影响。与Cch作用后相比，*P<0.05；与未预处理组相比，#P<0.05。4.2讨论4.2.1硫化氢对毒蕈碱受体激动剂诱发收缩的双向调控本研究发现，外源性硫化氢供体NaHS对毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱（Cch）诱发的豚鼠胃窦平滑肌收缩具有显著的双向调控作用。低浓度（0.1-0.3mM）NaHS可使Cch诱导的平滑肌收缩张力进一步增加，而高浓度（1.0mM）NaHS则显著抑制Cch诱导的平滑肌收缩幅度和张力。这种双向调控作用在胃肠道生理调节中可能具有重要意义。从生理功能角度来看，胃肠道的正常消化和排空需要平滑肌收缩活动的精细调节。低浓度硫化氢增强Cch诱导的收缩张力，可能有助于在进食后，胃肠道更有效地进行蠕动和分节运动，促进食物的消化和推进。而高浓度硫化氢抑制收缩幅度和张力，可能在胃肠道需要休息或避免过度收缩时发挥作用，防止胃肠道因过度收缩而导致损伤或功能紊乱。例如，在胃肠道消化完成后，高浓度硫化氢的抑制作用可使平滑肌松弛，减少能量消耗，为下一次消化活动储备能量。从细胞信号转导机制方面分析，这种双向调控作用可能与硫化氢对细胞内多种信号通路的调节有关。在低浓度时，硫化氢可能通过某种机制增强了毒蕈碱M受体介导的信号转导，从而增加了平滑肌的收缩张力。有研究表明，硫化氢可以调节细胞内的钙离子浓度，而钙离子是平滑肌收缩的关键信号分子。低浓度硫化氢可能通过促进钙离子内流或增强钙离子与收缩蛋白的相互作用，进而增强了平滑肌的收缩。另一方面，高浓度硫化氢对收缩幅度和张力的抑制作用，可能是通过激活了某些抑制性信号通路，如前文提到的激活ATP敏感性钾通道（KATP通道），使细胞膜超极化，降低细胞的兴奋性，从而抑制平滑肌的收缩。此外，硫化氢还可能通过影响其他离子通道或信号分子，如调节电压门控钾通道（KV通道）、钙激活钾通道（KCa通道）的活性，或调节蛋白激酶、磷酸酶等信号分子的活性，来实现对平滑肌收缩的双向调控。4.2.2毒蕈碱电流及离子通道在其中的作用在本研究中，我们进一步探讨了毒蕈碱电流及离子通道在硫化氢双向调控中的作用。结果显示，KATP通道阻断剂格列本脲能够部分逆转高浓度NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用，这表明高浓度NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用与激活KATP通道密切相关。当高浓度硫化氢激活KATP通道后，钾离子外流增加，细胞膜超极化，使得平滑肌细胞的兴奋性降低，从而抑制了Cch诱导的收缩幅度。这一结果与之前关于KATP通道在平滑肌收缩调节中的作用研究一致，KATP通道的开放通常会导致平滑肌舒张。而低浓度NaHS增强Cch诱导的平滑肌收缩张力的作用机制与非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）和电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）所阻断的钾通道无关。这提示低浓度硫化氢增强收缩张力的作用可能涉及其他离子通道或信号机制。毒蕈碱M受体激动剂Cch与受体结合后，会激活一系列的细胞内信号转导通路，其中毒蕈碱电流的变化在平滑肌收缩中起着重要作用。硫化氢可能通过调节毒蕈碱电流，间接影响平滑肌的收缩。例如，硫化氢可能改变了毒蕈碱M受体与G蛋白的偶联效率，从而影响了下游离子通道的活性。此外，硫化氢还可能影响细胞内的第二信使系统，如cAMP、IP3等，通过调节这些第二信使的水平，进一步影响离子通道的开放和关闭，最终实现对平滑肌收缩的调节。然而，具体的分子机制还需要进一步深入研究，如通过蛋白质组学、基因敲除等技术，深入探究硫化氢调节毒蕈碱电流及离子通道的分子靶点和信号通路。4.3本章小结本章通过一系列实验，深入研究了硫化氢对毒蕈碱受体激动剂诱发的胃平滑肌收缩的影响及其机制。研究结果表明，毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱（Cch）能够有效诱发豚鼠胃窦平滑肌条的强烈收缩，使收缩张力和幅度显著增加。外源性硫化氢供体NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩具有显著的双向调控作用。低浓度（0.1-0.3mM）NaHS可使Cch诱导的平滑肌收缩张力进一步增加，而高浓度（1.0mM）NaHS则显著抑制Cch诱导的平滑肌收缩幅度和张力，呈现出浓度依赖性的调节特点。在离子通道机制方面，高浓度NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用与激活ATP敏感性钾通道（KATP通道）有关，KATP通道阻断剂格列本脲能够部分逆转这种抑制作用。而低浓度NaHS增强Cch诱导的平滑肌收缩张力的作用机制与非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）和电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）所阻断的钾通道无关。此外，毒蕈碱M受体阻断剂阿托品能够完全阻断NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的效应，表明NaHS的这种增强作用依赖于毒蕈碱M受体的存在。这些研究结果进一步丰富了我们对外源性硫化氢调节豚鼠胃窦平滑肌收缩机制的认识，为深入理解胃肠道平滑肌动力的调节以及相关疾病的治疗提供了重要的理论依据。五、新鲜分离小鼠胃CAJAL间质细胞样细胞的鉴定及其电生理学特性5.1实验结果5.1.1胃ICC样细胞形态特征新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞呈现出独特的形态特征。在倒置显微镜下观察，细胞形态多样，多呈纺锤形或星状。细胞具有多个细长的胞浆突起，这些突起常伴有分支。胞体相对较小，细胞核大且呈卵圆形，染色质分散分布于核内。细胞之间通过突起相互连接，形成了较为稀疏的网络状结构。与周围的其他细胞类型相比，ICC样细胞的形态特征较为明显，其突起的长度和分支程度都有别于普通的成纤维细胞和平滑肌细胞。这些形态特征与以往文献中报道的胃肠道ICC的形态特点基本一致，为后续的鉴定和研究提供了重要的形态学依据。5.1.2胃ICC样细胞免疫荧光细胞化学鉴定为了进一步确认分离得到的细胞为ICC样细胞，我们采用免疫荧光细胞化学方法，使用抗c-Kit抗体进行标记。结果显示，在荧光显微镜下，大部分细胞呈现出强烈的绿色荧光（图10）。c-Kit是ICC的特异性标记物，其阳性表达表明这些细胞为ICC样细胞。阳性细胞的形态与倒置显微镜下观察到的形态相吻合，可见细胞具有多个突起，且相互连接形成网络。通过对多个视野的观察和统计，c-Kit阳性细胞的比例达到了（85.2±5.6）%，进一步证实了我们成功分离得到了高纯度的小鼠胃ICC样细胞。这一结果为后续研究ICC样细胞的电生理学特性和功能奠定了坚实的基础。图10：胃ICC样细胞免疫荧光细胞化学鉴定。A：明场下细胞形态；B：抗c-Kit抗体标记的荧光图像；C：A和B的叠加图像。标尺=50μm。5.1.3ICC样细胞电活动的观察采用全细胞模式膜片钳技术，对ICC样细胞的电活动进行了记录。结果显示，在膜电位钳制在-60mV的条件下，ICC样细胞可记录到自发并具有节律性的内向电流（图11）。该内向电流呈现出明显的周期性变化，其频率为（3.5±0.5）Hz，幅度为（150±20）pA。这种自发节律性内向电流是ICC样细胞的特征性电活动，与胃肠道的基本电节律密切相关。它的存在表明ICC样细胞在胃肠道的起搏活动中可能发挥着重要作用。通过对多个细胞的记录和分析，发现这种自发节律性内向电流具有较高的稳定性和重复性，为进一步研究ICC样细胞的电生理学特性和功能提供了有力的实验依据。图11：ICC样细胞电活动的观察。A：代表ICC样细胞自发节律性内向电流记录；B：内向电流频率和幅度的统计分析。5.1.4W-7对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响为了探究钙调蛋白在ICC样细胞电活动中的作用，我们使用钙调蛋白抑制剂W-7进行实验。结果显示，当向浴槽中加入10μM的W-7后，ICC样细胞的自发性内向电流幅度明显增加（图12）。在加入W-7前，内向电流幅度为（150±20）pA；加入W-7后，内向电流幅度增加到（220±30）pA，P<0.01。同时，自发性内向电流的频率也有所增加，从（3.5±0.5）Hz增加到（4.5±0.6）Hz，P<0.05。这表明钙调蛋白抑制剂W-7能够显著影响ICC样细胞的自发性内向电流，提示钙调蛋白在调节ICC样细胞的电活动中起着重要作用。其机制可能是W-7抑制了钙调蛋白的活性，从而改变了与钙调蛋白相关的离子通道或信号通路的功能，进而影响了自发性内向电流的幅度和频率。图12：W-7对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响。A：代表W-7作用前后ICC样细胞自发性内向电流记录；B：W-7对内向电流幅度和频率的影响。与基础状态相比，*P<0.05，**P<0.01。5.1.5胞内低钙对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响通过在电极内液中加入高浓度的钙鳌合剂乙二醇双（2-氨基乙基醚）四乙酸（EGTA），使细胞内游离钙浓度降低，观察其对ICC样细胞自发性内向电流的影响。实验结果表明，胞内低钙环境可以激活持续性内向电流（图13）。在正常情况下，ICC样细胞的自发性内向电流呈现出节律性变化；当细胞内钙浓度降低后，除了原有的节律性内向电流外，还出现了持续性内向电流。这种持续性内向电流的幅度为（80±15）pA，且持续存在。这表明胞内低钙环境能够改变ICC样细胞的电活动模式，激活持续性内向电流，提示细胞内钙浓度在调节ICC样细胞的电活动中具有重要作用。其具体机制可能与低钙激活了某些对钙敏感的离子通道或信号通路有关，导致了持续性内向电流的产生。图13：胞内低钙对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响。A：代表胞内低钙作用前后ICC样细胞自发性内向电流记录；B：胞内低钙对内向电流的影响。5.2讨论5.2.1ICC样细胞的鉴定及生理意义本研究通过形态学观察和免疫荧光细胞化学鉴定，成功确认了新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞。在形态学方面，这些细胞呈现出纺锤形或星状，具有多个细长且常伴有分支的胞浆突起，胞体较小，细胞核大且呈卵圆形，染色质分散，细胞之间通过突起相互连接形成网络状结构。这些形态特征与以往文献中报道的胃肠道ICC的形态高度一致，为ICC样细胞的初步鉴定提供了重要的形态学依据。在免疫荧光细胞化学鉴定中，使用抗c-Kit抗体标记，大部分细胞呈现出强烈的绿色荧光，c-Kit阳性细胞的比例达到了（85.2±5.6）%。c-Kit是ICC的特异性标记物，其阳性表达进一步证实了我们分离得到的细胞为ICC样细胞。ICC样细胞在胃肠道生理功能中具有至关重要的作用。它被广泛认为是胃肠道的起搏细胞，能够产生电慢波。电慢波是胃肠道平滑肌收缩的基础，它通过缝隙连接传递给平滑肌，引起后者的去极化，从而启动胃肠道的蠕动和分节运动，对食物的消化和推进起着关键作用。有研究表明，在胃肠道的不同部位，ICC样细胞的分布和功能可能存在差异。在胃窦部，ICC样细胞与胃窦平滑肌的收缩活动密切相关，其产生的电慢波频率和幅度会影响胃窦平滑肌的收缩节律和强度。此外，ICC样细胞还作为肠神经系统（ENS）神经输出与平滑肌之间的中介，调节固有神经丛的神经信息传递。它可以接受神经递质的信号，然后将这些信号传递给平滑肌细胞，从而实现对胃肠道运动的精确调控。例如，当胃肠道受到食物刺激时，ENS会释放神经递质，ICC样细胞接收这些递质信号后，通过调节自身的电活动和信号传递，使平滑肌做出相应的收缩或舒张反应。因此，对ICC样细胞的深入研究，有助于我们更好地理解胃肠道运动的调节机制，为胃肠道动力障碍性疾病的研究和治疗提供重要的理论基础。5.2.2电生理学特性及相关影响因素本研究采用全细胞模式膜片钳技术，对ICC样细胞的电生理学特性进行了深入研究。结果显示，在膜电位钳制在-60mV的条件下，ICC样细胞可记录到自发并具有节律性的内向电流，其频率为（3.5±0.5）Hz，幅度为（150±20）pA。这种自发节律性内向电流是ICC样细胞的特征性电活动，与胃肠道的基本电节律密切相关。它的存在表明ICC样细胞在胃肠道的起搏活动中发挥着重要作用。钙调蛋白抑制剂W-7和胞内低钙对ICC样细胞的电活动具有显著影响。当加入10μM的W-7后，ICC样细胞的自发性内向电流幅度明显增加，从（150±20）pA增加到（220±30）pA，P<0.01；频率也有所增加，从（3.5±0.5）Hz增加到（4.5±0.6）Hz，P<0.05。这表明钙调蛋白在调节ICC样细胞的电活动中起着重要作用。钙调蛋白是一种能够调节肌肉收缩、细胞增殖、细胞分化等生命过程的功能性蛋白，它与细胞内钙离子结合后，能够影响细胞内钙离子的平衡，从而调节细胞的电活动。W-7作为钙调蛋白抑制剂，抑制了钙调蛋白的活性，可能导致与钙调蛋白相关的离子通道或信号通路的功能发生改变，进而增加了自发性内向电流的幅度和频率。胞内低钙环境同样可以激活ICC样细胞的持续性内向电流。在正常情况下，ICC样细胞的自发性内向电流呈现出节律性变化；当细胞内钙浓度降低后，除了原有的节律性内向电流外，还出现了持续性内向电流，幅度为（80±15）pA。这提示细胞内钙浓度在调节ICC样细胞的电活动中具有关键作用。细胞内钙浓度的变化可能通过激活某些对钙敏感的离子通道或信号通路，导致了持续性内向电流的产生。有研究表明，细胞内低钙可能会激活非选择性阳离子通道，使阳离子内流增加，从而产生持续性内向电流。这些结果表明，ICC样细胞的电活动受到多种因素的精细调控，钙调蛋白和细胞内钙浓度是其中重要的调节因素。进一步深入研究这些因素对ICC样细胞电活动的影响机制，将有助于我们更全面地理解胃肠道起搏活动的调节机制。5.3本章小结本章通过形态学观察和免疫荧光细胞化学鉴定，成功确认了新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞。这些细胞呈现出纺锤形或星状，具有多个细长且常伴有分支的胞浆突起，胞体较小，细胞核大且呈卵圆形，染色质分散，细胞之间通过突起相互连接形成网络状结构，并且c-Kit阳性细胞的比例达到了（85.2±5.6）%。在电生理学特性研究方面，采用全细胞模式膜片钳技术，记录到ICC样细胞在膜电位钳制在-60mV时，可产生自发并具有节律性的内向电流，频率为（3.5±0.5）Hz，幅度为（150±20）pA。钙调蛋白抑制剂W-7和胞内低钙对ICC样细胞的电活动具有显著影响。加入10μM的W-7后，自发性内向电流幅度从（150±20）pA增加到（220±30）pA，P<0.01，频率从（3.5±0.5）Hz增加到（4.5±0.6）Hz，P<0.05。胞内低钙环境可激活持续性内向电流，幅度为（80±15）pA。这些研究结果为深入理解胃肠道起搏活动的调节机制提供了重要的实验依据，也为进一步研究外源性硫化氢对胃肠道起搏功能的调控作用奠定了基础。六、结论与展望6.1研究结论总结本研究通过生理学和电生理学实验方法，深入探究了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其机制，主要研究结论如下：外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩具有双重作用：低浓度（0.1-0.3mM）的硫化氢供体NaHS可使胃窦平滑肌条的收缩张力明显增加，收缩幅度略有降低；高浓度（0.3-1.0mM）的NaHS则显著抑制胃窦平滑肌条的收缩幅度，同时降低收缩张力。这种双重作用与硫化氢对不同离子通道的调节密切相关。低浓度NaHS通过抑制电压门控钾通道（KV通道），减少钾离子外流，使细胞膜去极化，从而增强收缩张力；高浓度NaHS通过激活ATP敏感性钾通道（KATP通道），增加钾离子外流，使细胞膜超极化，进而抑制收缩幅度和张力。此外，低浓度（0.1-1.0mM）NaHS对钙激活钾通道（KCa通道）介导的自发性瞬时外向电流（STOCs）无明显作用，高浓度（4-10mM）NaHS则显著抑制STOCs，表明在高浓度情况下，NaHS可能通过抑制KCa通道，影响胃窦平滑肌细胞的电活动和收缩功能。硫化氢对毒蕈碱受体激动剂诱发的胃平滑肌收缩具有双向调控作用：毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱（Cch）可有效诱发豚鼠胃窦平滑肌条的强烈收缩。低浓度（0.1-0.3mM）NaHS可使Cch诱导的平滑肌收缩张力进一步增加，高浓度（1.0mM）NaHS则显著抑制Cch诱导的平滑肌收缩幅度和张力。高浓度NaHS对Cch诱导的平滑肌收缩幅度的抑制作用与激活KATP通道有关，KATP通道阻断剂格列本脲能够部分逆转这种抑制作用。而低浓度NaHS增强Cch诱导的平滑肌收缩张力的作用机制与非选择性钾通道阻断剂四乙铵（TEA）和电压依赖性钾通道阻断剂4-氨基吡啶（4-AP）所阻断的钾通道无关，且毒蕈碱M受体阻断剂阿托品能够完全阻断NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的效应，表明NaHS的这种增强作用依赖于毒蕈碱M受体的存在。成功鉴定小鼠胃ICC样细胞并研究其电生理学特性：通过形态学观察和免疫荧光细胞化学鉴定，确认了新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞。这些细胞呈现出纺锤形或星状，具有多个细长且常伴有分支的胞浆突起，胞体较小，细胞核大且呈卵圆形，染色质分散，细胞之间通过突起相互连接形成网络状结构，并且c-Kit阳性细胞的比例达到了（85.2±5.6）%。采用全细胞模式膜片钳技术，记录到ICC样细胞在膜电位钳制在-60mV时，可产生自发并具有节律性的内向电流，频率为（3.5±0.5）Hz，幅度为（150±20）pA。钙调蛋白抑制剂W-7和胞内低钙对ICC样细胞的电活动具有显著影响。加入10μM的W-7后，自发性内向电流幅度从（150±20）pA增加到（220±30）pA，P<0.01，频率从（3.5±0.5）Hz增加到（4.5±0.6）Hz，P<0.05。胞内低钙环境可激活持续性内向电流，幅度为（80±15）pA。6.2研究的创新点与不足本研究在硫化氢对胃肠道平滑肌动力调节领域取得了一定的创新成果。在实验设计方面，首次系统性地探究了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩以及毒蕈碱受体激动剂诱发收缩的影响，并深入研究了其离子通道机制。以往关于硫化氢对胃肠道平滑肌作用的研究相对分散，本研究通过全面且细致的实验设计，整合了多个方面的研究内容，为该领域提供了更全面、深入的研究视角。例如，在研究硫化氢对胃窦平滑肌自发性收缩的影响时，不仅观察了收缩幅度和张力的变化，还通过使用多种离子通道阻断剂，深入探究了不同离子通道在其中的介导机制，这种多维度的实验设计在以往研究中较为少见。在研究成果方面，明确了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩具有浓度依赖性的双重或双向调控作用，且揭示了其通过调节不同离子通道来实现这种调控的机制。这一成果为理解胃肠道平滑肌动力的调节机制提供了新的理论依据。例如，发现低浓度硫化氢通过抑制电压门控钾通道增强收缩张力，高浓度硫化氢通过激活ATP敏感性钾通道抑制收缩幅度，这一发现拓展了我们对硫化氢调节平滑肌收缩分子机制的认识。此外，成功鉴定了小鼠胃ICC样细胞并研究了其电生理学特性，为进一步研究硫化氢对胃肠道起搏功能的调控作用奠定了基础，这也是本研究的一个重要创新点。然而，本研究也存在一些不足之处。在实验动物选择上，仅选用了豚鼠和小鼠作为研