E2和Map3k1相互作用影响肺腺癌发展的机制研究

PAGEE2和Map3k1E2和Map3k1相互作用影响肺腺癌发展的机制研究PAGEIII摘要目的：研究雌二醇（E2）、Map3k1与肺腺癌发生、发展和转移的关联及其作用机制。方法：用雌激素E2刺激A549细胞，首先观察细胞形态变化和生长状态；然后通过荧光定量PCR法从基因水平分析MAP3K1、ERS1、ERS2的表达变化；最后通过免疫荧光从蛋白水平分析MEKK1、ERα、ERβ表达和位置变化。结果：经雌激素刺激后，A549细胞仍呈上皮样，细胞形态没有显著性变化，高倍镜下可见生长分泌更为旺盛。与对照组相比，E2刺激后A549细胞中MAP3K1的表达量有所下降，但未见有统计学差异（P>0.05）；ERS1和ERS2的表达量则是有显著性的上升（P<0.05）；细胞中MEKK1、ERβ的表达位置和表达量没有显著性改变。结论：在细胞水平上，E2可激活雌激素受体，并一定程度上影响Map3k1的基因表达，参与对肺腺癌的调控。关键词：肺腺癌，雌激素，Map3k1，ERβ

ABSTRACTObjective:ToinvestigatetheassociationandmechanismofE2、Map3k1withlungadenocarcinoma.Methods:EstrogenstimulatesA549cells,firstobservingcellmorphologicalchangesandgrowthstatus;thenanalyzingMAP3K1、ERS1、ERS2expressionchangesfromgenelevelbyfluorescencequantitativePCR;finally,analyzingMEKK1、ERα、ERβexpressionandpositionchangesfromproteinlevelbyimmunofluorescence.Conclusion：Afterestrogenstimulation,A549cellswerestillepithelial-like,withnosignificantchangesincellmorphology.ThegrowthandsecretionofA549cellsweremorevigorousathighmagnification.TheexpressionofMAP3K1inA549cellsdecreased,buttherewasnostatisticaldifference(P>0.05),whiletheexpressionofERS1andERS2increasedsignificantly(P<0.05).TheexpressionofMEKK1andERdidnotchangesignificantly.Results:Atthecellularlevel,weanalyzedtheregulationofthetwotypesofLungAdenocarcinoma,e2andMap3k1.Keywords:ERβ，Map3k1，LungAdenocarcinoma，Estrogen目录TOC\o"1-3"\h\u摘要 IABSTRACT II1.前言 12.材料与方法 22.1实验材料 22.1.1实验细胞系 22.1.2实验试剂 22.1.3实验仪器 32.1.4试剂配制 32.2实验方法 42.2.1A549细胞培养 42.2.2细胞冻存 42.2.3细胞复苏 52.3实验分组 52.4实验方法 52.4.1RT-PCR 52.4.2免疫荧光检测 73.统计分析 84.实验结果 84.1A549细胞形态变化 84.2MAP3K1、ERS1、ERS2基因水平表达变化 84.3免疫荧光观察MAP3K1、ERβ表达变化 95.讨论 10参考文献 11致谢 131.前言肺癌（lungcancer）是全世界最常见的恶性肿瘤之一[1,2]，且发病率逐年上升。据世界卫生组织资料统计，全球每年新发肺癌患者约有将近200万人，并且，每年有超过一百五十几万人因肺癌去世。特别是近年来，我国的肺癌死亡率增加趋势显著，已成为我国死亡率上升最快的癌症[3]。治疗肺癌的主要手段仍然是传统的手术治疗、化放疗等，但其生存率较低[4]。因此，寻找新的肺癌的治疗切入点迫在眉睫。肺癌分为小细胞肺癌（smallcelllungcancer,SCLC）和非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer,NSCLC）。流行病学研究发现[5,6]，腺癌占女性原发性肺癌的四分之三，并且在不吸烟患者和青少年患者中最为常见。肺腺癌倍增时间短，易转移，对放疗和化疗均不敏感，而且有一部分的肺腺癌在肿瘤直径小于1cm时，就已经发生了远端转移，而大部分患者在就诊时就已处于中晚期阶段，手术治疗受限，预后较差，因此，研究人员把目光投向了分子靶向治疗[7]。针对患者肿瘤基因型中的致癌途径和驱动因素，靶向治疗比针对肺腺癌患者的非靶向治疗更有效[8]。但是，作为单一药物的个体靶向疗法仅在具有已知分子异常的那些构成致瘤驱动的患者临床上有用。为了为更大的患者群提供更有效的治疗，必须确定额外的致癌途径或选择标准以进行有针对性的抑制[9]。已有的Gefitinib作为分子靶向治疗药物[10]，为部分肺腺癌患者提供了有效的治疗方法，但是，仍有很大比例的患者对于EGFR-TKI的治疗效果并不理想[10]。所以，确立潜伏的治疗靶点是肺腺癌研究的首选。据报道雌激素近年来是NSCLC的重要驱动因素[11]。一项关于16,000多名绝经后女性肺癌患者的调查研究发现，接受每日激素替代疗法（HRT）5年以上的妇女的肺癌发病率和死亡率明显高于安慰剂组[12]。雌激素的生物学作用是通过与结构和功能不同的雌激素受体，α和β（ERα和ERβ）结合来介导的[13]。ERβ是NSCLC的主要ER亚型[11,14]，负责介导雌激素的增殖效应，ERα通常不表达。Map3k1基因位于5q11.2，是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族中的重要成员，其表达的蛋白细胞外信号调节激酶1MEKK1（Extracellularregulatedproteinkinasekinasekinase1）全长196kD，具有广泛的生物学功能。MEKK1具有Ser/Thr激酶活性，其C-端为催化结构域，N-端为调节结构域[15]，可以磷酸化与其结合的下游靶蛋白，从而介导蛋白间的相互作用并影响其行为和生物学功能[16]。MEKK1蛋白是MAPK信号传导通路的结点，可以调节JNK[17]、ERK1/2[18]、P38[19]、IKK-NFKB[20]等信号通路，这些信号通路参与调控相关细胞的增殖、分化、凋亡、迁移和侵袭等[17-20]。Map3k1对细胞的发生、发展起着至关重要的作用，有研究表明Map3k1具有可决定细胞命运的开关样功能，即促进细胞凋亡和抑制细胞凋亡的双重作用。而MEKK1作为几个MAPK通路的上游调节因子，亦涉及不同种类和细胞类型的生物学反应，包括肿瘤细胞扩散、T细胞活化和压力刺激诱导的细胞凋亡等。然而，到目前为止，还未见Map3k1与肺腺癌的相关研究报道。本研究拟通过细胞水平的研究，明确E2、Map3k1和肺腺癌发生发展的关系及其作用机制，为进一步临床治疗应用提供基础理论依据，并分析、探讨其作为相关抗肺腺癌药物研发新靶点的可能。2.材料与方法2.1实验材料2.1.1实验细胞系人肺腺癌细胞（A549）购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。2.1.2实验试剂1、Trizol总RNA提取液（美国Invitrogen公司）2、氯仿（上海生工生物技术工程有限公司）3、异丙醇（上海生工生物技术工程有限公司）4、DEPC（sigma公司）5、RevertAid™FirstStrandcDNASynthesisKit（Roche公司）6、SYBR-GreenMasterPCRmix（Roche公司）7、PCR八连管（Roche公司）8、无酶离心管、枪头（axygen公司）9、DMEM（高糖培养基）（Hyclone公司）10、胎牛血清（Hyclone公司）11、1×PBS（Solarbio公司）12、0.25%Trypsin-EDTA（Solarbio公司）13、青霉素/链霉素双抗溶液（Gibco公司）14、Cytm3-conjugatedAffinipureDonkeyAnti-MouseIgG(H+L)(minimal

cross-reactiontobovine,chicken,goat,guinea，pig,syrian

hamster,horse,human,rabbit,andsheepserumproteins)(JacksonImmunoResearch)Cytm3-结合的驴抗鼠IgG(H+L)(杰克逊免疫研究所）15、AlexaFluor488-conjugatedAffinipureDonkeyAnti-RabbitIgG(H+L)(minimalcross-reactiontoBovine,chicken,Goat,Guineapig,syrianhamster,horse,human,mouse,rat,andsheepserumproteins)(JacksonImmunoResearch)AlexaFluor488-conjugatedAffinipureDonkey16、Anti-RabbitIgG(H+L)(杰克逊免疫研究）17、DMSO（sigma公司）18、TritonX-100（上海生工生物技术工程有限公司）2.1.3实验仪器1、SW-CJ-1F超净工作台（苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）2、PCR基因扩增仪（Eppendorff公司）3、StepOne™Real-TimePCRSystem（Roche公司）4、超声（宁波新芝科研仪器研究所）5、滤纸（Bio-Rad公司）6、移液器（Eppendorf公司）7、制冰机（SANYO公司）8、恒温磁力搅拌器（Biocote公司）9、快速混匀器（金坛市恒丰仪器厂）10、微量迷你离心机（OHAUS公司）11、CO2

细胞培养箱（Thermo公司）12、超净工作台（AIRTECK公司）13、倒置相差显微镜（Olympus公司）2.1.4试剂配制1、0.01MPB（pH7.2）：称取2.9gNa2HPO4·12H2O，0.29gNaH2PO4·2H2O，以MilliQ水溶解并定容至100mL，室温保存备用。2、DEPC水：取1mLDEPC加入1000mL

ddH2O中，充分振荡，37°C过夜，121°C，20min高压灭菌。3、1×PBS（pH7.4）：称取NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.08g，KH2PO40.2g溶于800mLMilliQ水中，充分混匀，用HCl调pH至7.4，MilliQ定容至1L，室温保存备用。4、0.01MPBS（pH7.2）：分别称取NaCl8.0g，KCl0.2g，KH2PO4·2H2O0.24g，Na2HPO4·12H2O1.44g，于ddH2O中溶解、定容至1000mL。5、0.1MPBS（pH7.4）：称取Na2HPO4·12H2O3.5g，NaH2PO4·2H2O2.9g，以ddH2O溶解并定容至1000mL，调PH至7.4。6、细胞冻存液（10mL）：DMEM：6mL，FBS：3mL，DMSO：1mL，混匀，置于4°C保存备用。7、完全培养基：DMEM：90mL，FBS：10mL，混匀，置于4°C保存备用。8、E2：2.7238mg溶于10mlDMSO,为1umol/ul原液。基培稀释成1nm/ul为工作液。2.2实验方法2.2.1A549细胞培养（1）将待用的完培、胰酶、PBS放置于室温进行复温；（2）取一个新的干净的15毫升的离心管待用。将皿中的液体用吸管转移到离心管内待用；（3）用PBS轻洗皿底两次，弃去液体；（4）加入合适的胰酶，以能正好覆盖皿底最适合。37℃，3min；（5）加入（2）中的离心管中的含有完培的液体停止消化。用塑料滴管吹打，将皿中的细胞全部吹打下来，注意不要产生气泡，吸取转移至离心管中后，以1200转速转五分钟；（6）弃去上清液，用PBS清洗培养皿两次之后转移至离心管内，再次以一千二百转速转五分钟来离心；（7）弃去上清液，用1毫升完培重悬沉淀，均分至连个加入4-5毫升完培的培养瓶里。十字交叉混匀后放入培养箱培养。2.2.2细胞冻存待瓶中的细胞长满并贴壁后，进行冻存；（1）提前进行实验准备，将PBS、胰酶、完培进行复温；（2）将瓶中的液体转移至新的15毫升离心管待用，用PBS轻洗两次；（3）加入1毫升左右胰酶，混匀瓶底，37℃，3min。将离心管中的完培转移至瓶中，终止消化；（4）用吸管吹打瓶底，将液体转移至离心管，1200rpm，5min；（5）弃上清，用PBS洗培养瓶2次，转移至离心管，1200rpm，5min；（6）离心期间，取灭过菌的EP管，按照完培：血清：DMSO=7:2:1的比例配置1毫升的冻存液；（7）离心结束后，弃上清，用枪吸取冻存液进行沉淀重悬，转移至冻存管中。贴上标记，日期；（8）按照4℃20min，-20℃--2h，-80℃，的顺序梯度冻存。2.2.3细胞复苏按照实验需求进行PBS、完全培养基复温，预备37℃38℃左右温水。（1）从-80℃冰箱取出细胞，立即放入37℃38℃左右温水中进行快速复温，待管中固体全部融化成液体后，迅速进入细胞房进行1200rpn,5min，离心；（2）弃上清，加入1毫升完培再次重悬，1200rpn,5min，离心；（3）弃上清，用完培重悬，均分至两个加入4-5毫升完培的培养瓶里，十字交叉混匀。放入培养箱培养。2.3实验分组以六孔板培养细胞，三孔为DMSO刺激组，三孔为E2刺激组，10μlMDSO和E2工作液分别刺激细胞。2.4实验方法2.4.1RT-PCR一、RNA的提取（1）将养有成纤维细胞的皿中的培养基弃去，用PBS洗两次；（2）加入0.5毫升的Trizol，水平放置一会，用枪头吹打混匀，装入1.5毫升的无酶EP管里，吹打混匀；（3）室温孵育5分钟；（4）加入0.1毫升氯仿，用力振荡15S，观察其变成乳白色；（5）室温孵育2-3min，4℃，12000rpm，15min；（6）吸取上清，记住大概的体积，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀；（7）室温孵育10min，4℃，12000rpm，10min；（8）弃上清，按照每1毫升的Trizol加入1毫升的75％乙醇（延管壁缓加）；（9）轻微混匀，4℃，7500rpm，5min，弃上清；（10）重复（8）（9）一遍；（11）静置5—10min，风干；（12）用RNase-free水重悬，20-50μl；（13）55-60℃水浴10-15min。二、RNA逆转录（1）所有试剂于冰上溶解，低速离心片刻；（2）在0.2mLPCR管中依次加入各成分：总RNA1μgoligo(dT)181μLDEPC水适量，至总体积为13μL（3）65°C，10min变性，完成后立即放在冰里冷却；（4）在各个管中依次加入余下的各个组分，构成20μL反应体系：缓冲液4μLRnase抑制剂0.5μL碱基混合液2μL逆转录酶0.5μL（5）混匀，短暂离心后上机扩增；（6）扩增程序：50°C，30min；85°C，5min；（7）置于冰上快速冷却，-80°C保存备用。三、QRT-PCR根据基因mRNA设计QRT-PCR反应引物：GenePrimer-FPrimer-RMap3k1（human）5’-TGATGTATGGAGTGTTGGCTG-3’5’-AATGTGAAGGGATCGATGGAG-3ESR1（human）5’-ATGGTCAGTGCCTTGTTGGATGC-3’5’-GTCTGCCAGGTTGGTCAGTAAGC-3’ESR2（human）5’-GCTGAACGCCGTGACCGATG-3’5’-ACAGGAGCATCAGGAGGTTAGCC-3’GAPDH（human）5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’（1）将所需材料轻微离心混匀，置于冰上；（2）在0.1mLPCR管中依次加入下列各组分，构成20μL反应体系：Mix10μL上游引物1μL下游引物1μL超纯水7μL模板cDNA1μL（3）轻柔吹打混匀，离心，上机检测。反应条件为：95ºC，5min；45个循环（95ºC，15s；60ºC，20s；72ºC，30s），每个循环在延伸阶段收集荧光；PCR扩增反应结束后，进行产物的熔解曲线分析：95ºC，15s；60ºC，1min；95ºC，15s。各组细胞目的基因均以内参基因GAPDH进行校正，为了减少误差，实验重复3批样本，每个样本均重复3次，使用2-ΔΔCT法进行相对定量分析。2.4.2免疫荧光检测（1）吸除培养基，PBS轻洗细胞2×3min，（2）固定：加入4%多聚甲醛(PBS配制)固定20分钟。（3）除去多聚甲醛，使用PBS轻洗细胞3×3min。（4）通透：0.5%TritonX-100(PBS配制)室温通透20min。（5）除去TritonX-100，使用PBS轻洗细胞3×3min。（6）封闭：用10%的与二抗同源的血清(PBS配制)封闭半小时。封闭结束后千万不要洗，直接上一抗。（7）一抗：滴加足够量适宜浓度的一抗，4℃孵育过夜（8）除去一抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。（9）二抗：滴加足够量适宜浓度的二抗，37℃，30min（从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行）。（10）除去二抗，使用PBS轻洗细胞3×3min。（11）复染核：0.5ug/mlDAPI避光孵育5min。（12）使用PBS轻洗细胞4×5min，洗去多余的DAPI。（13）用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察并采集图像。（14）保存：一般-20℃低温下可保存2-3个月。3.统计分析应用STATAV10.0统计分析软件对样本数据进行单因素方差分析，应用GraphPadPrism5统计分析软件进行统计作图，数据结果用±SD表示，采用t检验进行比较、分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。4.实验结果4.1A549细胞形态变化A549细胞呈上皮样，经雌激素刺激后，细胞形态没有显著性变化，高倍镜下可见生长分泌更为旺盛。图1A549细胞形态变化A、B：DMSO刺激组；C、D：E2刺激组；A、C：100倍镜下；B、D：200倍镜下4.2MAP3K1、ERS1、ERS2基因水平表达变化经雌激素刺激后，A549细胞中MAP3K1的表达量（图2）有所下降，但没有统计学差异（P>0.05）；ERS1和ERS2的表达量（图2）则是有显著性的上升（P<0.05）。图2MAP3K1、ERS1、ERS2基因水平表达变化4.3免疫荧光观察MAP3K1、ERβ表达变化经雌激素刺激后，A549细胞中MEKK1（图3）、ERβ（图4）的表达位置和表达量没有显著性改变。图3免疫荧光观察MAP3K1表达变化A、B、C：DMSO刺激组；D、E、F：E2刺激组A、D：MEKK1；B、E：DAPI；C、F：Merge图4：免疫荧光观察ERβ表达变化A、B、C：DMSO刺激组；D、E、F：E2刺激组A、D：ERβ；B、E：DAPI；C、F：Merge5.讨论E2是一种类固醇激素，主要由\o"卵巢"卵巢滤泡、黄体及妊娠时胎盘等分泌，是\o"雌激素"雌激素中最主要、生物活性最强的激素。雌二醇主要是促进子宫内膜转变为增殖期以及促进女性第二性征的发育，因此，雌二醇在维持女性生殖器官、乳腺、长骨生长以及女性性征等方面起着重要的作用。E2能与血浆蛋白中高度结合、能与组织内特异性受体蛋白结合形成"活化"复合体，从而具有多种功能。卵巢肿瘤能异常分泌激素而致E2升高；垂体瘤、畸胎瘤、睾丸间质细胞瘤等疾病可引起E2分泌增多，从而导致男性\o"乳房"乳房发育；另外，肝硬化、多胎妊娠、男性系统性红斑狼疮(SLE)等均可出现血清E2水平增高。本实验结果提示雌激素E2刺激A549细胞后形态学未有改变、增殖旺盛，同时ERS1和ERS2的基因表达量上调，进一步证实雌激素与肺癌尤其是非小细胞肺癌的发生、进展关系密切。已有报道表明肺癌细胞比正常的肺细胞含有更多的EＲ，且临床研究显示在体外和体内ERβ对NSCLC细胞的增殖起作用[14,21]并影响人类肿瘤异种移植[14]。此外，雌激素通过ERβ显着上调IGF-1R的表达，并促进鼠肺腺癌[22,23]。ERβ通过与17β-雌二醇（E2）结合而起到转录因子的作用。核转位后，与靶基因启动子内的雌激素应答元件（ERE）结合，并刺激基因转录[24,25]。MAP3K1是MAP3K家族成员之一，主要作用是发挥信息素反应的信号转导功能，对多种正常细胞及肿瘤细胞的生存、凋亡、运动、迁移有着重要作用。近年来，通过运用基因组综合分析法，发现Map3k1基因在多种肿瘤中发生了遗传学改变。我们的实验结果表明，E2刺激A549细胞后在ER表达上调的同时，可促使Map3k1基因一定程度的下调，提示E2可能影响Map3k1的调控。文献表明E2通过激活ER和表皮生长因子受体（EGFR）信号传导。此外，雌激素通过ERβ显着上调IGF-1R的表达，并促进鼠肺腺癌。ERβ通过与17β-雌二醇（E2）结合而起到转录因子的作用。核转位后，与靶基因启动子内的雌激素应答元件（ERE）结合，并刺激基因转录。除核信号传导途径外，核外信号通过E2介导Src激酶，促分裂原活化蛋白激酶（MAPK），蛋白激酶B（AKT），生长[26]。其他研究表明E2快速增加H23肺腺癌细胞中的MAPK激活[27]。简而言之，ERβ与生长因子的串扰作用而促进细胞增殖。然而，ERβ在肺腺癌进展中如何发挥作用尚待进一步的研究。参考文献[1]TorreLA,SiegelRL,JemalA.Lungcancerstatistics[J].Advancesinexperimentalmedicineandbiology,2016,893:1-19.[2]SiegelRL,MaJ,ZouZ,etal.Cancerstatistics[J].CACancerJClin,2014,64:9-29.[3]ChenW,ZhengR,BaadePD,etal.CancerstatisticsinChina,2015[J].CACancerJClin,2016,66(2):115-132.[4]HouJ,SunE,Zhang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