DB15∕T 3148-2023 油菜籽携带黑胫病菌分子检测技术规程

ICS65.020

CCSB16

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3148—2023

油菜籽携带黑胫病菌分子检测技术规程

Technicalcodeofpracticeformoleculardetectionofleptosphaeria

spp.fromcontaminatedoilseedrape

2023-08-25发布2023-09-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T3148—2023

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、特泥河农牧场有限公司、巴彦淖尔市乌拉特中旗现

代农牧事业发展中心、呼和浩特市园林植保站。

本文件主要起草人：宋培玲、李子钦、燕孟娇、杨永青、贾晓清、皇甫海燕、霍宏丽、赵丽丽、郭

晨、皇甫九茹、张英、袁喜丽、斯琴、高树娟。

I

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油菜籽携带黑胫病菌分子检测技术规程

1范围

本文件规定了油菜籽携带黑胫病菌的分子检测方法，主要包括样品DNA提取、PCR扩增检测、琼脂

糖凝胶电泳、结果判定。

本文件适用于油菜籽携带黑胫病菌的检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

油菜黑胫病phomastemcankerofrapeseed

由小球腔菌属真菌Leptosphaeriamaculans或Leptosphaeriabiglobosa侵染引起的油菜病害，危

害叶片和茎秆。

L.biglobosa致病性较弱，侵染油菜叶片和茎秆后，形成黑色病斑，病斑上散有零星的小黑点（分

生孢子器），叶片上病斑的周围可见有黄色晕圈。

L.maculans致病性较强，侵染油菜叶片后，形成大的、黑褐色病斑，上面分布有较多的小黑点（分

生孢子器），后期在茎基部也能形成病斑，从而造成茎基部的腐烂。

4主要仪器设备和试剂

主要仪器设备

高压灭菌锅、超纯水系统、制冰机、水浴锅、电泳仪、PCR仪、凝胶成像系统、超低温冰箱、常规

冰箱、离心机、涡旋振荡器、移液器。

主要试剂

4.2.1DNA提取试剂：QIAGEN’sminikit提取试剂盒，CTAB提取液（1.4mol/LNaCl，100mmol/L

Tris-HClpH8.0，20mmol/LEDTApH8.0，2%CTAB），氯仿，异戊醇，醋酸钠，异丙醇，乙醇。

4.2.2PCR检测试剂：10×PCR缓冲液，Taq酶，dNTP，ddH2O。

4.2.3凝胶电泳试剂：琼脂糖，TAE，loadingbuffer，核酸染料。

5样品DNA提取

1

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随机抽取0.5g油菜籽置于冷冻过的研钵中，液氮迅速研磨后将粉末分装到1.5mL的离心管中，

先用CTAB法提取DNA，再用QIAGEN’splantminikit试剂盒提取DNA。

6PCR扩增检测

特异性引物：LmacA:5，—CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA—3，

LmacB:5，—ATCAGGGGATTGGTGTCAGCAGTTGA—3，

LmacR：5，—GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG—3，

LmacR为共用反向引物，强致病性病原菌L.maculans可获得大小为334bp的特异性扩增产物，弱

致病性病原菌L.biglobosa可获得大小为440bp的特异性扩增产物。

扩增体系(20μL)：基因组DNA2μL，上下游引物（10μM）各1uL，10μLTaqmix(2x),MQ6μ

L。

扩增条件：94℃预变性2min,94℃变性30s,58.5℃退火30s,72℃延伸1min；35个循

环；72℃延伸5min.

7琼脂糖凝胶电泳

在电泳缓冲液中加入1%琼脂糖，加热融化后冷却至55℃左右加入5μL核酸染料摇匀，倒入胶板

制备凝胶，凝固后上样进