第十三章-生化药物制造工艺

重要生物药物制造工艺E-mail：xinmigwy@163.comTel酵工程教研室郭伟云

第三篇1本门课程由以下三大部分内容组成基础篇：生物制药工艺基础1技术篇：生物分离工程技术2品种篇：重要生物药物制造工艺32生物药物的类别（一）天然生物药物

1.微生物药物microbiolmedicine2.天然生化药物Biochemicalmedicine3.海洋生物药物marinemedicine（二）生物技术药物（新生物制品）

1.DNA重组药物（DNArecombinantmedicine）——基因工程与蛋白质工程药物

2.基因药物（三）合成或半合成生物药物345生化药物制造工艺

第十三章6生化药物的定义、分类、特点定义：具体运用生物化学研究方法，从生物体中经提取、分离、纯化等手段获得的天然存在的生化活性物质或将上述这些物质加以结构改造或人工合成创造出的自然界没有的新的活性物质，通称生化药物（Biochemicalmedicine）。7重点酶类药物辅酶类药物核苷酸与核酸类药物多肽类药物氨基酸类药物蛋白质类药物多糖类药物脂类药物分类8生化药物的特性1．药理学特性：1药理活性高，针对性强毒副作用少，营养价值高2生理副作用常有发生免疫原反应，过敏反应39生化药物的特性2．理化特性：1有效物质含量低，杂质多，工艺复杂，收率低，技术要求高结构复杂，生物活性受空间结构严格限制，稳定性差2生物材料易染菌，腐败310生化药物的特性3．天然生物药物是新型药物的先导物通过合理的药物设计，可以创造出疗效更高，作用更专一，更易为机体接受，副作用与不良反应更小的新药。1170-80年代50-70年代有机溶剂分级分离、等电点沉淀等--------粗提物。离子交换层析、凝胶层析、超滤等技术--------提高了产品的纯度和收率多种层析技术、超速离心等--------高纯度的生化药物生化药物发展概况12生化药物的资源植物动物动物脏器血液、分泌物及其它代谢物微生物海洋生物13主要从以下脏器中制取生化药物14毒蜥Exendin-4是自毒蜥唾液中提取的一种多肽，研究发现该多肽与人体内的GLP-1在序列上有53％的同源性，同GLP-1一样具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保护胰岛β细胞等作用。2005年经FDA批准用于二型糖尿病的治疗。Exenatide是Exendin-4的人工合成品。Exenatide15麻省Transmolecular公司的科学家将放射性I131附着于自蝎子毒液中提取的一种多肽制成药物，研究发现该药物具有靶向性，对晚期神经胶质瘤有较好疗效，患者只需要从外部注射这种化合物，而无需再进行化疗或放射治疗。该药物目前仍处于临床研究阶段。蝎毒肽16生物药物的资源植物动物动物脏器血液、分泌物及其它代谢物微生物海洋生物17微生物1利用微生物作为工具微生物的代谢物2微生物菌体18生物药物的资源植物动物动物脏器血液、分泌物及其它代谢物微生物海洋生物19海洋生物1海藻类：已知的海藻有1万多种海洋动物类：腔肠动物类、节肢动物类、软体动物类、鱼类、爬行动物类、海洋哺乳动物类2海洋微生物：320僧袍芋螺齐考诺肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，现已人工合成，是一种神经细胞钙通道阻断剂。作为一种非阿片类镇痛药物，用于治疗严重的慢性神经性疼痛，其鞘内注射剂经FDA批准于2005年上市。齐考诺肽（ziconotide）21DidemninB是一种由7个氨基酸和2个羧酸组成的带有分枝的环缩肽，既能抑制蛋白质的合成,也能抑制DNA、RNA的合成，对黑色素瘤B16细胞周期作用的研究表明，它可杀伤各期细胞，尤以G1至S期细胞敏感，它可快速完全介导HL-60细胞凋亡。目前DideminB已能够人工全合成，该药完成了临床Ⅱ期实验，最有希望开发成治疗癌症的新药。此外第二代didemnins-脱氢didemninsB(aplidine)现也已进入临床实验。

海鞘来源的抗癌肽DidemninB22海兔体内存在着多种结构独特、生理功能各异的次生代谢产物，如萜类、毒素、甾体、大环内酯及肽类等，其中肽类化合物尤为引人注目。其中Dolastatin15和Dolastatin10已经完成全合成，并正在美国进行Ⅰ期和Ⅱ期临床试验，主要用于小细胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等实体瘤的治疗。

海兔来源的抗癌作用肽23海洋生物1海藻类：已知的海藻有1万多种海洋动物类：腔肠动物类、节肢动物类、软体动物类、鱼类、爬行动物类、海洋哺乳动物类2海洋微生物：324第一节氨基酸类药物25本节内容氨基酸的种类氨基酸类药物的制造方法26氨基酸输液氨基酸的分类1蛋白质氨基酸：编码氨基酸非蛋白氨基酸：D型氨基酸、β-氨基酸、γ-氨基酸等2衍生氨基酸：5-羟色胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等

必需氨基酸和非必需氨基酸：亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。2728八种必需氨基酸：携一两本黄色书来携--缬氨酸

一--异亮氨酸

两--亮氨酸

本--苯丙氨酸

黄--甲硫氨酸（硫为黄色）

色--色氨酸

书--苏氨酸

来--赖氨酸氨基酸记忆口诀29六伴穷光蛋：硫、半、光、蛋→半胱、光、蛋（甲硫）氨酸→含硫氨基酸

酸谷天出门：酸、谷、天→谷氨酸、天门冬氨酸→酸性氨基酸

死猪肝色脸：丝、组、甘、色氨酸→一碳单位来源的氨基酸

只携一两钱：支、缬、异亮、亮→缬、异亮、亮氨酸→支链氨基酸

一本落色书：异、苯、酪、色、苏→异亮、苯丙、酪、色、苏氨酸→生糖兼生酮

拣来精读之：碱、赖、精、组→赖氨酸、精氨酸、组氨酸→碱性氨基酸

芳香老本色：芳香、酪、苯、色→酪、苯丙、色氨酸→芳香族氨基酸

不抢甘肃来：脯、羟、甘、苏、赖→脯、羟脯、甘、苏、赖氨酸→不参与转氨基的氨基酸所有氨基酸：

六伴穷光蛋，

酸谷天出门，

死猪肝色脸，

只携一两钱。

一本落色书，

拣来精读之。

芳香老本色，

不抢甘肃来。

蛋白质水解法：胱氨酸、半胱氨酸化学合成法：甘氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸等发酵法：苏氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、精氨酸、组氨酸、脯氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、赖氨酸、亮氨酸等酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等氨基酸类药物的制造方法重点312005版中国药典收载的氨基酸原料药基本原理：以毛发等蛋白质为原料，通过酸、碱或酶水解成多种氨基酸混合物，经分离纯化获得各种药用氨基酸的方法称为水解法。*主要过程：水解、分离和结晶精制。蛋白质水解法32酸水解法：水解迅速而彻底，无消旋作用；色氨酸破坏，天冬酰胺、谷胺酰胺脱酰胺基，且产生大量废液污染环境。碱水解法：水解迅速而彻底，色氨酸不被破坏；含羟基或巯基的氨基酸全被破坏，且产生消旋，工业上多不采用。酶水解法：反应条件温和，无需特殊设备，氨基酸不被破坏，无消旋作用；水解不彻底，产物中除氨基酸外，尚含有多肽。工业上主要用于生产蛋白及蛋白胨。蛋白质水解方法重点33发酵的基本原理借助微生物在有氧或无氧条件下进行生命活动制备微生物菌体或其代谢产物的过程。发酵法34菌种诱变选育种子培养发酵培养产物分离纯化发酵的基本过程35缺点产物浓度低，设备投资大，生产周期长，成本高。

*绝大部分氨基酸可通过发酵法生产36基本原理：又称酶工程技术，是在特定酶的作用下使某些有机物转化成相应氨基酸的技术。*主要过程前体合成菌体培养转化反应产品纯化与精制酶转化法37微生物植物细胞动物细胞化学合成，生物合成，天然存在底物

（AA前体）生物反应器含L-AA反应液L-AA酶转化法生产L-AA流程38结构分子量等电点性质溶解性L-AspL-Ala

L-Asp和L-Ala的结构与性质133.1089.092.776.0酸性氨基酸中性氨基酸溶于水和盐酸，不溶于乙醇和乙醚在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚39+CO2天冬氨酸酶L-Asp脱羧酶酶转化反应工艺路线固定化L-Asp脱羧酶转化液B延胡索酸+NH3固定化天冬氨酸酶转化液AL-Asp粗品L-Asp精品L-Ala粗品L-Ala精品40泵储罐反应产物离心机母液回收固定化酶柱子a晶体L-AspL-Asp延胡索酸氨盐工艺路线41*优点工艺简单，产物浓度高，转化率及生产效率较高，副产物少，固定化酶或细胞可进行连续操作，节省能源和劳务，并可反复使用。*缺点固定化细胞或固定化酶代价高。42以酸、醛、酯及某些氨基酸为原料，经氨解、水解、缩和、取代及氢化还原等化学反应合成α-氨基酸的方法称为化学合成法。化学合成法43*特点理论上所有氨基酸均可由化学合成法制造，但只有当采用其他方法生产很不经济时才采用化学合成法生产。氨基酸输液44氨基酸输液

多种结晶L-氨基酸依特定比例混合制成的静脉内输注液称为氨基酸输液。

当由于疾病等原因，不能经口摄取的时候，把纯度高的氨基酸混合液作为最合适的氮源，从静脉注入身体是比较合理的营养补给方法。

氨基酸输液的组方原理与配方模式45不同类型的AA输液，根据在临床上的用途不同可以分为以下几类：46思考题氨基酸类药物的制造方法有哪些？简述其原理及其过程？蛋白质水解法有哪些？各有何优缺点？47第二节多肽与蛋白质类药物48本节内容多肽与蛋白质类药物概述多肽与蛋白质类药物的制造方法49重要的多肽与蛋白质类药物的制备50多肽类药物分类多肽激素垂体多肽激素促皮质素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激素（LPH）催产素（OT），加压素（AVP）等下丘脑激素促甲状腺激素释放激素（TRH）、生长素抑制激素（GRIF）、促性腺激素释放激素（LHRH）甲状腺激素甲状旁腺激素（PTH）、降钙素（CT）胰岛激素胰高血糖素、胰解痉多肽胃肠道激素胃泌素、胆囊收缩素－促胰酶素（CCK-PZ）、肠泌素、肠血管活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、缓激肽、P物质胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子51多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF），转移因子（TF），心钠素（ANP）等。含有多肽成分的其它生化药物骨宁、眼生素、血活素、氨肽素、妇血宁、脑氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、助应素、神经营养素、胎盘提取物、花粉提取物、脾水解物、肝水解物、心脏激素等。多肽类药物分类52蛋白质激素

垂体蛋白质激素生长素（GH），催乳激素（PRL），促甲状腺素（TSH），促黄体生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。

促性腺激素人绒毛膜促性腺激素（HCG），绝经尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。

胰岛素及其他蛋白质激素胰岛素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。血浆蛋白质白蛋白，纤维蛋白溶酶原，血浆纤维结合蛋白（FN）,免疫丙种球蛋白，抗淋巴细胞免疫球蛋白，Veil’s病免疫球蛋白，抗－D免疫球蛋白，抗－HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ，凝血因子Ⅷ，凝血因子Ⅸ。蛋白质类药物分类53蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ（IFN）,白细胞介素1～7（IL），神经生长因子（NGF），肝细胞生长因子（HGF），血小板衍生的生长因子（PDGF），肿瘤坏死因子(TNF)，集落刺激因子(CSF)，组织纤溶酶原激活因子(tPA)，促红细胞生成素(EPO)，骨发生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、内在因子等。胶原蛋白明胶、阿胶等碱性蛋白质硫酸鱼精蛋白蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂凝集素PHA、ConA蛋白质类药物分类54提取分离纯化法（重点）化学合成法基因工程法多肽与蛋白质类药物的制造方法重点原料选择上清破碎提取沉淀

变性复性蛋白质纯化蛋白质药物－SeparationandPurification纯度活性鉴定合格不合格精品

发酵

生物组织56重点

Protein--Separation原则：富含所需蛋白质多肽成分的，易于获得、易于提取、无害（原核、真核发酵；生物组织）注意事项：种属、发育生长阶段、原料的环境、解剖部位、生物状态溶解性稳定性合适的溶剂原料选择提取57重点Protein--Purification纯化

根据目的蛋白与杂质之间的差异进行纯化。1.根据蛋白质的pI的不同进行纯化，其方法有：1）pI沉淀法

2）pI沉淀法与盐析法相结合3）等电聚焦法

2.蛋白质分子形状和大小的不同进行纯化，其方法有

1）凝胶过滤

2）超滤法

3）离心法

4）透析法3.蛋白质的溶解度不同进行纯化，其方法有：

a)盐溶与盐析法

b）结晶法

c）有机溶剂沉淀法4.蛋白质电离性质不同进行分离：离子交换法5.蛋白质功能专一性不同进行纯化：亲和层析法6.蛋白质在溶剂系统中分配不同进行纯化：萃取法7.蛋白质的选择性吸附的性质进行纯化：吸附法8.蛋白质的其他特殊性质进行纯化58重点分离纯化方法的选择1.分离纯化早期使用方法的选择特点：提取液中的物质十分复杂，目的蛋白浓度较稀。方法选择原则：低分辨能力到高分辨能力，而且负荷量较大为合适。2.各种分离纯化方法的使用顺序原则：相同性质的纯化方法一般不重复使用。纯化方法顺序先后的安排上要考虑到有利于减少工序，提高效率。3.分离纯化后期的保护性措施4．对每一步骤方法的优劣进行综合评价每一个分离纯化步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率的高低。59重点纯化方法选择指南60多肽化学合成概述合成原理：是一个重复添加AA的过程，一般自C端向N端合成。合成方法：（1）液相合成（2）固相合成（1963年R.B.Merrifield创立，并因此获1984年诺贝尔化学奖）1953年Du.Vigneaud等合成催产素（oxytocin,OXT，9AA单链肽）1963年合成促肾上腺皮质激素（ACTH，39AA单链肽）1965年中国科学家合成了胰岛素（Insulin，51AA双链肽）61多肽合成的主要步骤

氨基的保护和羧基的活化羧基的保护和氨基的活化接肽和去保护基氨基保护基

苄氧羰基——强酸脱除叔丁氧羰基（BOC）——三氟乙酸（TFA）脱除

9-芴甲氧羰基（Fmoc）——碱脱除

62多肽的固相合成（Fmoc保护法）

（1978年改进的方法，避免了强酸处理）63N,N′-二环已基碳酰亚胺9-芴甲氧羰基猪胰岛素牛胰岛素赖脯人胰岛素（礼来公司、速效Ins）

门冬胰岛素（诺和诺德公司、速效Ins）

甘精胰岛素

(安万特公司、长效Ins)人胰岛素（Insulin）B30A8;A10;B30

B28;B29B28A21;B31;B32643DStructureofInsulin胰岛素二聚体（dimer）胰岛素六聚体（hexamer

）65目前临床使用的胰岛素来源

动物胰脏来源----经动物胰脏提取或适当提纯的猪、牛胰岛素

半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产胰岛素----重组DNA技术生产人胰岛素、速效胰岛素、长效胰岛素66动物来源的胰岛素（28种）药品名称生产企业药品名称生产企业ILETINILILLYNPHPURIFIEDPORKISOPHANEINSULINNOVONORDISKINCILETINIILILLYPROTAMINEZINC&ILETINI(BEEF-PORK)LILLYINSULINNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINIILILLYINSULININSULATARDNPHNORDISKNOVONORDISKINCPROTAMINEZINCANDILETINII(PORK)LILLYINSULINNORDISKMIXTARD(PORK)NOVONORDISKINCPROTAMINEZINCINSULINBRISTOLMYERSSQUIBBLENTARDNOVONORDISKINCREGULARILETINIILILLYLENTENOVONORDISKINCREGULARILETINII(PORK)LILLYLENTEILETINIILILLYREGULARPURIFIEDPORKINSULINNOVONORDISKINCLENTEILETINII(PORK)LILLYREGULARINSULINNOVONORDISKINCLENTEINSULINNOVONORDISKINCSEMILENTENOVONORDISKINCNPHILETINI(BEEF-PORK)LILLYSEMILENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHILETINIILILLYULTRALENTENOVONORDISKINCNPHILETINII(PORK)LILLYULTRALENTEINSULINNOVONORDISKINCNPHINSULINNOVONORDISKINCVELOSULINNOVONORDISKINC67半合成来源的胰岛素（5种）药品名称生产企业INSULATARDNPHHUMANNOVONORDISKINCMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSNOVOLIN70/30NOVONORDISKINCNOVOLINLNOVONORDISKINCNOVOLINNNOVONORDISKINC68基因重组来源的胰岛素（27种）药品名称生产企业药品名称生产企业APIDRASANOFIAVENTISUSLANTUSSANOFIAVENTISUSEXUBERAPFIZERLEVEMIRNovoNordiskHUMALOGLILLYMIXTARDHUMAN70/30BAYERPHARMSHUMALOGMIX50/50LILLYNOVOLIN70/30NovoNordiskHUMALOGMIX75/25LILLYNOVOLINLNOVONORDISKINCHUMALOGPENLILLYNOVOLINNNOVONORDISKINCHUMULIN50/50LILLYNOVOLINRNOVONORDISKINCHUMULIN70/30LILLYNOVOLINR（Purified）NOVONORDISKINCHUMULIN70/30PENLILLYNOVOLOGNOVONORDISKINCHUMULINBRLILLYNOVOLOGMIX70/30NOVONORDISKINCHUMULINLLILLYVELOSULINBRNOVONORDISKINCHUMULINNLILLYVELOSULINBRHUMANNOVONORDISKINCHUMULINRLILLYHUMULINULILLYHUMULINRPENLILLY69胰岛素国内主要生产厂家其他（持有药品注册证）---南京新天生物化学制药有限公司、华西医科大学制药厂、上海第一生化制药厂、武汉生化制药厂等。70临床用胰岛素分类普通胰岛素：从动物胰脏中提取人胰岛素传统中长效胰岛素

长效人胰岛素类似物速效人胰岛素类似物非注射胰岛素71

传统中长效胰岛素制剂

低精蛋白锌胰岛素：胰岛素、鱼精蛋白和锌的结晶。

例：礼来公司，HumulinN(rDNA、大肠杆菌)

诺和诺德，NovolinN(rDNA、酿酒酵母)

胰岛素锌混悬液：精蛋白锌胰岛素与常规胰岛素的混悬液

例：礼来公司，Humulin30/70(30%常规胰岛素，70%精蛋白锌胰岛素)Humulin50/50

诺和诺德，Novolin30/70Novolin50/50缺陷：作用时间少于24小时作用峰值明显，夜间低血糖危险性高吸收不稳定结霜现象，由于温度过冷或过热导致胰岛素再玻璃瓶壁沉淀，丧失活性72长效胰岛素-人胰岛素类似物1.

甘精胰岛素（glargine）：商品名Lantus®------甘氨酸替代胰岛素A链21位门冬氨酸、并在B链末端增加两个精氨酸。

●使胰岛素结合更多带正电的氨基酸残基，改变等电点，使等电点由5.4上升至中性。这样，胰岛素类似物在酸性条件下可溶，在生理的近中性条件下结晶。2.InsulinDetemir：商品名Levemir®

------胰岛素B链29位赖氨酸侧链通过酰基化连接一个N-16-烷基酸的14碳游离脂肪酸●该游离脂肪酸能与白蛋白结合，延缓与胰岛素受体结合，从而延长其半衰期。

73InsulinDetemir（Levemir®）诺和诺德公司研制

glargine（Lantus®）安万特公司研制74速效胰岛素特点：起效快，皮下注射后15分钟起效。达峰快，注射后15分钟起效，30～60分钟达到药效高峰。药效维持时间短，大约在3小时左右（2～4小时）。药代动力学特点与进餐后人体内源性胰岛素分泌十分相似，能够很好地控制当餐后血糖而且不容易发生低血糖。起效时间达峰时间峰持续时间作用消除时间常规皮下Ins:30-90min1.5-2.5h2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h75

B26-30对于胰岛素结合于胰岛素受体的功能无关，但是对胰岛素形成二聚体有关的结构特点。因此对此区段进行修饰将产生一些自聚合能力下降但是与胰岛素受体结合能力不变的新型速效胰岛素类似物。研制机理已上市药物：Lispro、

Aspart、Apidra76Lispro（赖脯胰岛素，Humalog®）是第一个用于临床的速效胰岛素类似物，由美国礼来公司研制生产，将人胰岛素的B28与B29位的氨基酸对换。Aspart（门冬胰岛素，Novolog®）由丹麦诺和诺德公司研制生产，结构与人胰岛素的区别在于用天冬氨酸取代了B链28位上的脯氨酸。APIDRA（赖谷胰岛素，Apidra®）安万特公司研制，以赖氨酸和谷氨酸分别取代了人胰岛素B3位的天冬氨酸和B29位的赖氨酸。77胰岛素肺部吸入制剂--------Exubera辉瑞、万安特以及Nektar共同研发于2006.1.27被FDA批准一种作用快的胰岛素干粉吸入剂适用于餐前给药，其胰岛素吸收具有速效化的特征78胰岛素制备工艺以动物胰脏为原料提取胰岛素----酸醇提取法

※传统胰岛素---猪、牛胰脏提取，只经一步重结晶

※单峰胰岛素----凝胶过滤纯化

※单组分胰岛素---凝胶过滤、离子交换纯化

半合成胰岛素----以猪胰岛素为原料，酶修饰后得到人胰岛素重组DNA技术生产人胰岛素

※AB链合成：分别表达AB链，化学方法连接

※逆转录法：表达胰岛素原，酶切得到重组人胰岛素重点79Ins的性质

80Insulincrystas

酸醇提取法提取动物胰岛素81注意事项

82酶促半合成人胰岛素83重组DNA技术制造人胰岛素

AB链合成法：以人工合成的人胰岛素A链和B链基因分别表达A链和B链，然后再组合起来。反转录酶法：通过胰岛素原的cDNA合成，表达产物是胰岛素原，经工具酶切开，除去C-肽得人胰岛素。84InsA链InsB链转化大肠杆菌发酵A链B链纯化二硫键活性胰岛素AB链合成人胰岛素85质粒InsmRNA反转录InscDNA转化大肠杆菌PCR连接胰岛素原活性胰岛素二硫键酶切

提取质粒限制性内切酶酶切

反转录酶法合成人胰岛素86思考题目前多肽和蛋白质类药物的制造方法有哪些？提取分离纯化法生产多肽和蛋白质类药物包括哪些过程？有哪些注意事项？目前胰岛素的制备方法有哪些？87第三节核酸类药物NucleicacidMedicine88本节内容核酸类药物概述核酸类物质的分离提取及其发酵生产89重要的核酸类药物的制备核酸核苷酸磷酸核苷戊糖碱基DNA：AGCTRNA：AGCURNA：D-α-核糖DNA：D-α-脱氧核糖90一、核酸类药物概述（一）依据化学结构和组成分类：分四类核酸碱基及其衍生物1核苷及其衍生物2核苷酸及其衍生物3多核苷酸4919293（二）依据结构特点及临床应用情况分类具有天然结构的核酸类物质如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、CoI等来源：提取或发酵特点：毒副作用小自然结构碱基、核苷、核酸类结构的类似物如：巯嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等来源：以核酸类物质为前体通过“化学法”或“酶法”进行半合成特点：毒性较大94反义药物反义核酸是指天然存在的或人工合成的，能与靶DNA或RNA碱基互补，并能与之结合特异阻断其翻译的一段DNA或RNA。反义核酸技术是指利用反义核酸特异地抑制某些基因的表达，使之低表达或不表达。95Reversetranscription中心法则(CentralDogma)Replication96反义药物优点：1)高度特异性；

2)高生物活性、丰富的信息量；

3)高效性；

4)最优化的药物设计；

5)低毒、安全反义药物缺点：天然的寡核苷酸难以进入细胞内，而一旦进入不易被胞内核酸酶降解，很难直接用于治疗。反义药物9798二、核酸类物质的分离提取及其发酵生产DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。在浓NaCl（1～2mol/L）溶液中，DNA-核蛋白（DNP）的溶解度很大，RNA-核蛋白（RNP）的溶解度很小，在稀NaCl（0.14mol/L）溶液中，DNP的溶解度很小，RNP的溶解度很大。因此可利用不同浓度的NaCl溶液，将DNP和RNP分别抽提出来。RNA与DNA的提取与制备将抽提得的核蛋白用SDS处理，DNA或RNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。为防止DNA或RNA酶解，提取时加入EDTA。99核酸的提取DNA和RNA在细胞中常与蛋白质结合，以核蛋白的形式存在。DNA的提取：一般是利用DNA-核蛋白（DNP）易溶于1mol/LNaCl溶液而不溶于0.14mol/LNaCl溶液。RNA的提取：利用RNA-核蛋白（RNP）易溶于0.14mol/LNaCl溶液而不溶于1mol/LNaCl溶液的性质，先提取得到RNP。提取得到DNP或RNP后，再将蛋白质除去即可得到相应的核酸。100重点工业用RNA的提取RNA制备具有生物活性RNA的制备RNA的生产1011、工业用RNA的提取稀碱法酵母等1％NaOH裂解胞壁溶液HCL中和加热破坏酶冷却到10OC离心RNA溶液调pH2-2.5（接近RNApl）离心RNA沉淀浓盐法酵母等10％NaCL90OC提取离心上清液调pH2-2.5离心RNA沉淀1022、具有生物活性RNA的制备103从核糖核蛋白中分离RNA(1)乙醇沉淀法：核糖核蛋白溶于NaHCO3水相用含辛醇的氯仿去蛋白乙醇RNA沉淀(2)盐酸胍法：核糖核蛋白2～4盐酸胍38OC溶解冷却至0OC离心RNA沉淀104

DNA生产方法1.工业用DNA的提取105106水解法发酵法半合成法核苷酸的制备107重点（一）酶解法及碱水解法制备核苷酸酶液DNA液保温酶解液加热，过滤DNA降解液离子交换吸附，洗脱dAMP、dCMP、dGMP、dTMP酶解法制备脱氧核苷酸108酶水解:

DNA或RNA为原料制备5′－核苷酸常用的酶：橘青霉产生的5′－磷酸二酯酶橘青霉培养液压滤酶液【酶解】除菌体DNA溶液酶解液加热、调pH9.0过滤DNA降解液【离子交换】吸附于氯型阴离子树脂分部洗脱脱氧核苷酸(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP)RNA降解进一步分离戊糖核苷酸109碱水解：可制备3’和2’－核苷酸110（二）发酵法生产核苷酸111嘌呤核苷酸合成的中心产氨短杆菌发酵生产肌苷酸（IMP）：腺嘌呤营养缺陷型嘌呤核苷酸生物合成途径和代谢调控R5PPRPPPRPP转酰胺酶PRAIMP分解腺嘌呤阻遏GMPAMPADPATP反馈抑制SAMPAMPADPATPXMPGMPGDPGTP鸟嘌呤PPGMPATPPRPPGTP次黄嘌呤鸟嘌呤GMP112肌苷酸的发酵生产（一）直接发酵法（二）二步发酵法1、发酵法生产肌苷2、肌苷磷酸化：Inosine(肌苷)＋ATP→IMP＋ADP（三）半合成法生产肌苷酸在发酵过程中添加前体物次黄嘌呤后，经由微生物产生的胞外酶转化成肌苷酸。113重点◆保证IMP合成路线畅通：保证关键酶PRPP转酰胺酶的活力---解除腺嘌呤及衍生物的阻遏和反馈抑制◆阻断IMP的去路：阻断SAMP合成阻断IMP的分解筛选获得缺乏SAMP合成酶的腺嘌呤缺陷菌株，提供亚适量的腺嘌呤。◆使积累的IMP渗透到细胞外：增大细胞膜通透性选育Mn2+不敏感的变异株IMP积累的主要途径（前提）114RNA化学水解法发酵法核苷的制备115发酵法生产核苷116枯草芽孢杆菌嘌呤核苷酸合成途径SAMPAMPIMPGMPXMP345678黄嘌呤缺陷型（II）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）（III）鸟嘌呤缺陷型（经诱变缺失4号酶）腺嘌呤缺陷型（经诱变缺失6号或7号酶）AICARSAICARPRAPRPP21（一）（一）（一）（一）1：PRPP转酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脱氢酶4：XMP氨化酶5：GMP还原酶6：SAMP合成酶8：AMP脱氢酶当培养基中提供限量腺嘌呤时Ⅰ积累IMP肌苷Ⅰ＋Ⅱ积累IMP肌苷Ⅲ积累XMP

黄苷

枯草杆菌的磷酸单酯酶活力很强ADP（Ⅰ）117思考题核酸提取的原理是什么？目前核苷酸制备有哪些方法？肌苷酸的发酵生产方法有哪些？118第四节酶类药物119本节内容酶类药物的概述酶类药物的提取与纯化120重要的酶类药物的制备酶的分类121122123

原料选择生物材料的预处理提取浓缩纯化结晶124酶类药物的提取和纯化材料选择动植物组织富含所需物质生理状态及营养提纯方便廉价动物需宰杀后取材原则受限较多，产量有限微生物发酵是发展方向1251、动物材料的预处理：（1）机械法：有绞碎、刨碎、匀浆、研磨、超声波、挤压等方法，有些酶用机械法处理后仍不能有效的提取，可结合其他处理法。（2）冻融：冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，使酶释放出来。（3）丙酮粉：组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可以减少酶的变性，同时因细胞结构成分的破碎使蛋白质与脂质结合的某些化学键打开，促使某些结酶释放到溶液中。材料的预处理126重点127酶的浓缩（1）工业上：超滤、真空减压浓缩、薄膜浓缩、冷冻浓缩（2）实验室：除上述方法外，对少量样品可用下列方法

1.用G-15或G-25浓缩

2.用聚乙二醇浓缩128注意两个问题：1.建立快速的测定酶活力的方法2.建立活力回收表酶的纯化：凡用于蛋白质的纯化手段均适用于酶的纯化。从大肠杆菌中提取天冬酰胺酶活力回收表129酶的结晶☆特征：有序性，对称排列，周期性的重复结构

——为空间结构研究提供x-衍射样品1.酶的结晶方法

缓慢改变酶蛋白的溶解度，使其略处于过饱和状态。（1）盐析法（2）有机溶剂沉淀法（3）复合结晶法（4）透析平衡法（5）等电点法既是纯化的结果又是纯化的手段130重点2.结晶的条件选择酶的纯度酶的浓度金属离子pH温度、时间晶种131重点

酶的分离纯化工作中的注意事项1.防止酶蛋白变性2.防止辅因子丢失3.防止酶被蛋白水解酶降解132重点超氧化物歧化酶

（Superoxidedismutase,SOD）结构特点：金属酶Fe-SOD:

Mw38000，2个亚基，每个亚基含1个Fe，存在于中

Cu、Zn-SOD:Mw32000，2个亚基，每个亚基含1个Cu，1个

Zn，存在于中Mn-SOD:原核细胞中，Mw40000，2个亚基，每个亚基1个Mn

真核细胞中，Mw80000，4个亚基，每个亚基1个Mn真核细胞原核细胞133酶的性质稳定性对热稳定：天然牛血SOD可75℃加热数分钟，对热稳定性与溶液离子强度有关对pH的稳定性：一般pH5.3~9.5较稳定，猪血SOD在

pH7.6～9较稳定金属辅基与酶活性关系Cu、Zn-SOD：Zn与分子结构有关，与催化活性无关Cu与活性有关，对酶活力是必需的Mn-SOD：Mn对酶活力是必需的Fe-SOD：Fe对酶活力是必需的1341.以牛血红细胞提取Cu、Zn-SOD的工艺1352.以牛肝为原料提取Mn-SOD的工艺136溶菌酶（lysozymeEC7）

又称胞壁质酶，即N-乙酰胞壁质糖苷聚糖水解酶。能水解细菌的细胞壁中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4-糖苷键137五肽交联桥五个甘氨酸聚糖骨架G：N-乙酰葡萄胺M：N-乙酰胞壁酸四肽侧链L-丙、D-谷、L-赖、D-丙138溶菌酶分布

广泛存在于鸟类和家禽蛋清中，哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁、白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，以蛋清含量最高。139溶菌酶结构和性质

蛋清溶菌酶是由129个氨基酸残基构成的一种碱性蛋白，分子量从1.5～1.8万，分子内有四对二硫键，对热稳定，对碱不稳定，对革兰氏阳性细菌有较强的杀菌作用。140蛋清吸附的树脂洗脱液透析液去碱性蛋白盐析物保温抽提洗涤、洗脱沉淀沉淀盐析清液透析溶菌酶丙酮粉丙酮干燥树脂吸附冻干溶菌酶溶菌酶生产工艺141思考题酶类药物提取过程中生物材料的预处理方法有哪些？酶结晶的方法有哪些？有哪些影响因素？酶分离纯化过程中有哪些注意事项？142第五节糖类药物143糖科学蛋白

核酸糖类生物化学最后的巨大前沿之一144本节内容糖类药物的概述糖类药物制备的一般方法145重要的糖类药物的制备146Text1Text3Txt5植物动物微生物海藻多糖的分类（按照其来源不同来分）147多糖在细胞内的存在方式游离型结合型：糖蛋白，如人参多糖、黄芪多糖等脂多糖：如胎盘脂多糖、细菌脂多糖等148多糖类药物的药理活性抗氧化

调节血糖血脂

抗辐射损伤抗溃疡调节免疫功能抗病毒

抗突变

抗衰老抗肿瘤抗凝血

149国内已经上市的多糖药物产品名称生产单位产品类别适应症香菇多糖金陵药业股份有限公司福州梅峰制药厂中药恶性肿瘤的辅助治疗灵孢多糖注射液北京协和药厂化学药品用于治疗神经官能症、多发性肌炎、皮肌炎、萎缩性肌强直与进行性肌营养不良以及因免疫功能所致的各种疾病。紫芝多糖片江西大茅制药有限责任公司中药用于神经衰弱，白细胞和血小板减少症，电离辐射及职业性造血损伤及肿瘤患者放、化疗后白细胞下降等症。猪苓多糖注射液中国中医科学院实验药厂中药调节机体免疫功能，对慢性肝炎、肿瘤有一定疗效人参多糖注射液沈阳双鼎制药有限公司中药增强机体免疫功能，可克服肿瘤化疗和放射治疗引起的副作用。注射用灵杆菌多糖保定三九济世生物药业有限公司中药用于各种原因引起的白细胞减少症，乙型肝炎及急慢性盆腔炎等疾病的辅助治疗多糖蛋白片福州海王金象中药制药有限公司化学药用于白细胞减少症，传染性肝炎，神经衰弱等症的辅助治疗云芝多糖胶囊上海复星朝晖药业有限公司化学药肿瘤辅助治疗黄芪多糖天津华隆医药保健品有限公司中药广泛应用于各种病毒，细菌性疾病的防治茯苓多糖口服液湖南兰靖茯苓高科技开发有限公司中药用于肿瘤患者放化疗脾胃气虚证者150黏多糖的特点粘多糖：是指含有氨基糖与糖醛酸或它的衍生物的多糖。

粘多糖在结构上的特点：

1.

粘多糖基本上是由特殊的重复双糖单位构成，在此双糖单位中包括一个N-乙酰氨基己糖

2.

粘多糖的组成结构单位中有两种糖醛酸,即：D-葡萄糖醛酸和L-艾杜糖醛酸；有两种氨基己糖，即：氨基-D-葡萄糖和氨基-D-半乳糖

3.

粘多糖中还有若干其它单糖作为附加成分，如半乳糖等

151重点粘多糖的连接方式152粘多糖在组织中与蛋白质连接方式

在木糖和丝氨酸之间的一个O-糖