UC溃疡性结肠炎模型的建立

UC溃疡性结肠炎模型的建立摘要溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis,UC)是一种主要局限于大肠黏膜和黏膜下层的慢性非特异性炎症性疾病,呈反复发作,临床表现主要为腹痛、腹泻、黏液脓血便。有资料统计，该病发病率和患病率在我国有明显增加趋势。但其确切病因和发病机制至今仍未阐明,治疗上也缺乏特异有效的药物。建立理想的模拟人类溃疡性结肠炎的动物模型是非常重要的。本文主要对近年来溃疡性结肠炎的几种动物模型进行叙述。关键词：溃疡性结肠炎；动物模型；化学法；免疫法；复合法Researchprogressofsustained-releasepreparationsAbstractUlcerativecolitis(UC)isachronic,recurrentinflammatorydiseaseofthecolon,characterizedclinicallybybloodydiarrheaandabdominalpain.UChasbeenaclinicalchallengeduetoitsincreasingincidenceandprevalence,unknownetiologyandpathogenesis,andthelackofeffectivetreatment.Animalmodelshavebeenwidelyusedtoinvestigatethepathogenesisofvariousdiseases.Sofar,manyanimalmodelsofUChavebeendeveloped.ThisarticlereviewstherecentprogressinthedevelopmentofanimalmodelsofUC.KEYWORDS:Ulcerativecolitis;Animalmodels;Chemicalmethod;Immunoassay;Compoundmethod前言UC是一类病因并未确立的直肠和结肠炎症,呈不断发病,关键限于大肠黏膜和黏膜下层,归属于炎症性肠病(unflammatoryboweldisease)一类。据报道，该病在我国的发病率和患病率呈逐年上升趋势[1]。近些年科学研究发现，肠粘膜屏障的平稳毁坏是UC病发和病情进度的核心事件，而肠鳞状上皮细胞（ntestunselEpitheliselCellk）的出现异常凋亡将会在该事件中起关键的中介作用,这种观点获得了世界各国学者的普遍关心，并日渐变成科学研究的焦点[2-3]。科学研究发现[4-5],UC患者肠胃肠道菌群失调,肠管内致病菌和致病菌增加,且肠黏膜通透性提升,导致肠管内细菌及细菌产物向黏膜原有层挪动，引起细胞免疫的激话及炎症介质。UC患者的临床症状关键为腹疼、拉肚子、黏液脓血便等症状内镜下结肠呈糜乱、溃疡等弥漫性炎症,机构病理学主要表现为黏膜或黏膜下弥漫性炎症介质、肠腺降低、隐窝结构毁坏。因此创建理想化的细胞模型用以该病的病因、病发机制及新的治疗方案的科学研究是十分关键的。本文关键对化学诱发化学刺激法、免疫法、复合法这几种动物模型进行论述。1化学刺激法使用化学法创建UC细胞模型在实际操作中是有效的，对于深入分析UC的发病机理和临床治疗计划具有关键的实际意义。然而，由不同化合物、不同小动物、不同给药方法和剂量产生的UC实体模型的发病机理也不同。以下详细介绍了最常见的化合物诱导的大鼠和小鼠实验固体模型的方法、特征和应用。1.1乙酸法UC动物模型复制方法乙酸(aceticacid,AA)UC模型是使用AA的化学刺激作用,它能够引起结肠上皮细胞的凋亡，进一步破坏粘膜的天然屏障，促进肠粘膜的通透性，并诱导结肠上皮细胞的浸润。在此阶段，小鼠乙酸的关键模型是灌肠法[6]:使用SD大鼠造模时，将一根导管（2mm）穿过肛门，并引入2L冰醋酸（8％）,在20S后使用生理盐水冲洗。在正常喂养后，清洗灌肠3天后，大鼠表现出典型的UC病变，结肠粘膜结构被破坏。Luo[7]等给昆明小鼠提供5％的甲酸（0.2mL）清洁灌肠后，然后小鼠迅速出现腹泻，脓液和便血症状。该疾病以乙状结肠远端为主，病理生理学与人类UC极其相似。具体表现为鳞状上皮细胞萎缩，粘膜细胞水肿，出血和单核细胞浸润。该方法具有成本低，操作简便，稳定可靠，周期时间短，成功率高，重复性好等优点，适用于药物开发设计和生产。但是，这种模型的缺陷是由于乙酸立即刺激引起的乙状结肠烧灼，不能反映人UC的免疫力和遗传系统的特征，并且疾病发展迅速，恢复快，不适用于需要很长时间才能观察到药物疗效的药物。乙酸刺激法主要适用于新药的开发和疗效的评估。1.2葡聚糖硫酸钠法（DSS)UC动物模型复制方法葡聚糖硫酸钠(DSS)由蔗糖人工合成的硫酸多糖，它作为最常用的建立UC模型的化学物质之一，它可通过破坏肠粘膜的完整性使其通透性大大增加,从而促使多糖,蛋白质等大分子物质轻易渗入组织引发炎症反应。建立模型[8]将30只BAIB/C小鼠随机分成三组：对照组、3.5%DSS组，5%DSS组，每组各10只。小鼠自由饮水5d，每天记录小鼠的体重，观察小鼠粪便的特征并测量粪便中潜血的含量。组织病理学可见炎症主要发现于黏膜和黏膜下层，上皮内杯状细胞减少，隐窝受到破坏。DSS诱发的UC急性症状模型的临床医学和病理学与人相似，制作方法简单，周期时间短，重复性好，适应性比较强，重复性和依赖性强，这是理想的UC模型之一。缺点是无法模拟慢性病理的整个过程，并且疾病变化的程度因个体而异，个体间的差异较大。该方法主要用于人类致炎机制和抗炎药物疗效的科学研究，也可以用于免疫系统和遗传学的科学研究。1.3三硝基苯磺酸(TNBS)UC动物模型复制方法大鼠TNBS模型的制备方法为[9],使用异戊巴比妥将Wistar大鼠麻醉后,从肛门开口插入钝端导管至距肛门开口8厘米处，按80mg/kgTNBS(20mgTNBS溶解于50%乙醇1mL,4mL/kg大鼠体质量)缓慢灌肠,引起急性乙状结肠炎。15天后，再使用30mg/kgTNBS水溶液（20mgTNBS溶解于500mL/L乙醇1mL,1.5mL/kg)灌肠导致复发性结肠炎。当首次用TNBS诱导时，大鼠快速发展变成更为严重的胃肠道疾病。它的典型症状包括腹泻，脓液和便血，并且体重也明显减轻。在第二周，大鼠的腹泻得到明显改善，饮食结构也得到改善。在第二次用TNBS灌肠后，之前的情况再次出现。急性小鼠TNBS模型的诱导方法[10-11]为,小鼠麻醉后,将2.5mgTNBS溶解于500mL/L乙醇缓慢灌肠,每只小鼠量为0.1ml。复发性小鼠TNBS模型常见诱导方法是将0.50、0.75、1.00、1.25、1.50mgTNBS溶于500mL/L乙醇中,然后分别在第1、8、15、22、29天给予每只小鼠0.1mL。TNBS胃肠道疾病模型的临床表现是胃肠道疾病粘膜产生局部灶性溃疡，杯状和隐窝细胞均减少，从而浸润了炎性细胞。TNBS胃肠疾病模型的作用机制是作为半抗原，TNBS与胃肠道组织蛋白融合形成完整的抗原，从而导致肠粘膜免疫反应和肠粘膜损伤。TNBS的优点是方法简单，周期性短。TNBS模型的症状和病理变化与人的UC相似。它可以模拟UC慢性复发的整个过程，并可用于评论新治疗方法对人类UC的功效。众所周知，TNBS模型的免疫反应与克罗恩病更加相似，因此被广泛用于克罗恩病的科学研究。1.42,4二硝基氯苯UC模型(DNCB模型）动物模型复制方法由于DNCB是具有毒性和副作用的化合物，因此在使用DNCB制作UC模型过程中，DNCB通常溶解在乙酸或其他溶剂中，以减弱毒性和副作用，并可以构成DNCB-乙酸动物模型。该模型[11-13]先是利用乙酸破坏了肠粘膜的屏障并提高了肠粘膜的通透性，然后DNCB被用作半抗原进入粘膜，并且和组织蛋白大分子结合，根据T体细胞介导刺激的免疫细胞。在模型的整个建立过程中，实验动物多次接触DNCB发生过敏反应后，使用DNCB-乙酸溶液进行灌肠，从而产生以乙状结肠粘膜为主的炎症反应。使用DNCB创建的模型相对简单，重复性较好，并且动物易于存活。它可以反映由外源性抗原和机体自身抗原引起的迟发性胃肠道过敏，病理学的主要表现是与人类UC具有高度的相似性。可用于科学地研究UC的免疫调控发病机制和迟发性过敏反应的发病机理。但它也有自我修复能力强的缺点。该方法主要用来研究UC迟发性过敏反应的发病机制。2免疫法使用免疫分析方法创建结肠溃疡模型的免疫方法的原理都是使用同种或异种的异体组织过敏反应。在建模中，不同之处在于抗原体的来源和模型的处理。具体方法主要是胎鼠结肠粘膜组织致敏模型，胎鼠结肠种植的模型和大鼠结肠细菌菌株模型。免疫分析方法用于创建结肠溃疡模型，疾病症状相对较轻，其中大多数为慢性炎症，并且实验时间相对较长，因此所需的实验周期时间较长。但是，溃疡性结肠炎和临床表现与人类是相似的，这对于选择治疗溃疡性结肠炎疾病的新药具有必要的实际意义。2.1胎鼠结肠种植UC动物模型复制方法易季云等[14]制作UC模型以胎鼠结肠作为抗原，移植于同系成年鼠肾包膜下，发生典型的细胞免疫反应。它为理解人类UC和自身免疫反应之间的关系提供了一种思路，也与溃疡性结肠炎可能的免疫联系相吻合,可用于研究溃疡性结肠炎的免疫机制。但该模型实验周期长，对于技术的要求相对较高，容易受感染，且成功率比较低，症状与临床相似。它是一种慢性炎症，目前临床上应用较少。2.2大鼠结肠细菌菌株UC动物模型复制方法此模型[15]与上述胎鼠结肠种植相似,使用大鼠的正常菌群为抗原，此方法以正常大鼠菌群为抗原，伴随免疫次数的增加，大鼠结肠壁出现溃疡或弥漫性炎症，同时观察到细胞免疫功能下降和循环免疫复合物增加，使大鼠产生免疫反应。取正常大鼠的结肠内容物，将其种植在伊红-美蓝平板培养，并清楚地确定为大肠杆菌，然后扩增菌种，用福尔马林杀死细菌，并用0.9％氯化钠溶液洗涤制成悬液。在第一天，将0.2mL的细菌悬浮液注入大鼠的脚趾处。在第10天和第17天，分别将0.4mL和0.6mL注射到腹部和背部的皮下组织中，并在第二天和第四天腹腔内注射1.2mL。UC症状通常在免疫后的第二周出现。该方法操作简单，抗原来源方便，成功率高，与临床症状相似，但这个方法的缺点是需要一定的设备，条件和技术，实验周期相对较长。2.3结肠粘膜组织致敏UC动物模型复制方法此模型[16]的机制是在结肠局部发生Arthus反应(即实验性局部过敏反应，是指在预防接种过程中，经过多次注射后，注射局部出现水肿、出血和坏死等剧烈炎症反应)而导致结肠炎。可选用同种异体或异种异体，使用其他大鼠或其他动物的结肠粘膜组织制成的匀浆，加入弗氏佐剂（是近几年来动物实验中最常见的佐剂，是抗原溶液和的油剂（石蜡油或植物油）等量混合，然后加入乳化剂（羊毛脂或吐温20叶）制成油包水抗原乳剂，称为弗氏不完全佐剂）后，第1天和第15天在每只大鼠的足垫内注射清液0.1〜0.3mL，在第17天，注射0.1〜0.3mL清液在大鼠背部，在第24天，注射0.1〜0.3mL清液在大鼠腹股沟处，在第30天，在大鼠腹膜内注射0.1〜0.3mL清液（在最后一次注射中不使用弗氏佐剂）。在腹腔注射的第五天后,大鼠可能会出现与临床溃疡性结肠炎相似的症状。此模型的缺点是需要的实验周期相对较长，对于实验设备，实验条件和相应的技术要求较高。但优点是可重复性更好，可出现类似于人类的临床医学症状，更适合选择新的抗UC药物。3复合法复合方法是指使用两种或多种的方法制作动物模型。用复合方法制备的大鼠结肠溃疡性结肠炎模型对于表明UC的病因和发病机制是必要的。使用复合法建立的UC模型较好地展示了UC两个可能的发病原因，结肠黏膜屏障的损害和免疫调节的失衡。是近年来建立UC模型受到广泛认可的方法。3.1TNBS/DNCB＋乙醇UC动物模型复制方法TNBS/DNCB与乙醇灌肠一次致炎是目前比较常用的溃疡性结肠炎模型的建立方法[17]，它具有其他建模方法所不具有的优点，近年来得到了广泛应用。该模型的作用机制是当TNBS/DNCB于乙醇灌肠时，乙醇是一种有机溶剂，可溶解肠粘膜表面的粘液，破坏肠粘膜屏障[18-19]，然后进入局部肠道组织，TNBS/DNCB作为一种有机酸半抗原,它能与大鼠结肠组织蛋白结合形成总抗原，使T淋巴细胞致敏，这会引起肠壁的一系列免疫反应，继而诱发结肠炎症。除此之外，选用TNBS/DNCB-乙醇溶液进行模型建立主要是因为TNBS/DNCB-乙醇溶液价格低廉，建模的方法比较简单，并且该模型可以长期持续使用，可以充分反映从急性炎症到慢性炎症的转化过程，并且与临床医学上的结肠溃疡性结肠炎具有高度的相似性。因此，此模型在此目前更常用。3.2免疫致敏结合局部乙酸刺激UC动物模型复制方法吴玉泓等[20]结肠黏膜组织免疫致敏（早期的病原菌感染经历能够增强后期遭遇病原感染时的免疫力，这种现象称为免疫致敏(脊椎动物在病原致敏后可以达到种或菌株水平的免疫保护效应）法加乙酸局部刺激法建立复合大鼠溃疡性结肠炎模型。随机将30只Wistar大鼠分为三组;正常对照组，模型对照组和药物治疗组（每组十只）。结肠黏膜组织致敏法和乙酸的局部刺激法结合建立大鼠复合性结肠溃疡性结肠炎模型后，在药物治疗组中，给大鼠服用SASP（柳氮磺胺吡啶），除治疗组之外其余各组均给予生理盐水。灌胃2周后将大鼠处死，并分离其结肠组织和血清。该模型可以很好地模拟人类UC病变的慢性活动特征，适合于观察和评价药物疗效4中医证候在中西医理论体系中对于“病”的概念是各不相同，而“病证结合”的本质是现代医学的“病”与中医学的“证”相结合[20]。此种模型复制方法虽然同时兼顾了UC的西医病理和中医病机特征，是目前中医证候动物模型复制方法较为合理的一种,但还不是很严谨。根据《溃疡性结肠炎中医诊疗专家共识意见(2017)》溃疡性结肠炎的中医证候动物模型共分为以下7种类型[21]：大肠湿热证、热毒炽盛证、脾虚湿蕴证、寒热错杂证、肝郁脾虚证、脾肾阳虚证、阴血亏虚证。这类模型的复制多以“病证结合”为基础。这些模型存在很多问题。例如，一些动物模型的研究过于集中，评价指标不客观、不科学，模型重复性较小。因而寻找有效的复制中医溃疡性结肠炎模型的方法，对于探索中医药治疗结肠溃疡性结肠炎的机制具有重要意义。4.1脾肾阳虚型UC动物模型复制方法腺嘌呤灌胃＋冰番泻叶溶液灌胃法：文献[22-23]采用这种方法。使用腺嘌呤以10ml/kg将大鼠灌胃，每天灌胃持续2周。从第三周开始，每天用冰番泻叶溶液10ml/Kg灌胃大鼠，持续2周。每次灌胃半小时后，将50ml的4℃冰水均匀喷洒于大鼠全身，使大鼠毛皮湿润，然后在电风扇（转速1400r/min）下放置大鼠进行干燥。出现脾肾阳虚症状（①大便溏泄，甚则脱肛；②消瘦、食欲下降、体质量降低；③畏寒、弓背、蜷缩聚堆④外观低落，毛发枯萎枯燥；⑤容易疲劳和嗜睡。①〜③项，④〜⑤项的主要症状是合并症。具备以上中的有两个主要症状和两个合并症，即脾肾阳虚模型复制成功，之后使用TNBS复制UC模型。4.2肝郁脾虚型UC动物模型复制方法朱亚珍等[24]采用限食限动法复制肝郁脾虚证模型。先模拟饥饱失常，那是为了约束大鼠的四肢并限制它们的自由运动，每天大约八个小时，隔天禁止进食，这种情况持续两周。2周后，出现肝脏停滞和脾脏不足的症状（①松弛，懒惰，蜷缩和堆积；②情绪低落，头发枯萎，火力疏散，容易脱毛；③小便，大便软或稀疏，大便稀疏率上升，拖尾排便试验为阳性，并且在大便过程中会发生肛门肿胀甚至肛门脱垂；④动作缓慢，甚至左右倾斜；⑤体重没有增加或增加比较缓慢，并且明显比所有正常组差，其中①〜④为主要症状，⑤〜⑦是兼症，如果出现3种主要症状或3种主要症状加3种兼症，则认为脾胃湿热证候模型复制成功，之后用TNBS/乙醇溶液灌肠，复制UC模型。4.3脾虚湿困型UC动物模型复制法文献[25]采用猪油灌胃＋强迫游泳法复制脾虚湿困证动物模型。大鼠单号天不停饮水且不能进食，每天取2ml的4℃纯净水灌胃一次；双号天自由进食，喂食2-4mL升精制的猪油。每天都对被强迫的老鼠在2cm深的水中站立8个小时，每次持续20个小时。之后出现肝郁和脾虚综合症（①正常状态观察：抑郁，毛发混乱，色泽暗淡，耳尖与背部明显对齐；②心烦意乱，警惕，眼睛焦躁，有点杂音防御姿态；③对束缚有强烈反应，抵抗，咆哮，并设法摆脱束缚；④大老鼠主要表现为明显不适，易惹恼和戒备的状态）第21天开始，将大鼠禁食不禁水24h后麻醉，用内径为2mm左右的聚乙烯管从大鼠肛门插入8cm，注入5%TNBS＋50%乙醇[（TNBS:（乙醇）=12：5］0.65～0.8ml或给予DNBS和乙醇混合溶液（DNBS30mg溶解于0.25ml50%乙醇中）0.25ml。再提起大鼠尾巴，捏住肛门，保持头低脚高的状态30-60S。待其自然苏醒，自由饮食饮水。第2天处死大鼠，取组织用于检测相关指标。4.4寒热错杂型UC动物模型复制方法根据宋捷民等[26-28]采用寒凉药物灌胃＋皮下注射干酵母法复制“寒热错杂”模型。先复制虚寒模型：每天上午以丙硫氧嘧啶灌胃，剂量为100mg/kg，灌胃30min后放入4℃冰柜中冷冻6h。下午以知母、石膏水煎液［m知母：ｍ石膏＝3：4］4ml灌胃。第26天起加用番泻叶灌胃，持续3d。第29天皮下注射20%干酵母混悬液,使大鼠发热。出现寒热错杂症状（毛发稀疏，大便过软。第三周，大便稀疏，腰弓弯曲，拥挤，懒惰嗜睡，疲劳，疲倦，身体瘦弱，尾巴发冷，头发稀疏。第4周模型组的大鼠比第三周更严重。第26天开始用番泻叶灌胃，大便性状改变)后最后才复制UC模型。“病证结合”方法复制中医证候动物模型虽然有很多缺陷，但它仍然是一种合理的模型复制方法，在中医基础研究中发挥着重要作用。目前，除了基于“病证结合”原则复制UC的中医证候动物模型之外，仍然要寻找更科学合理的模型制作方法。参考文献[1]LiX,SongP,LiJ,etal.TheDiseaseBurdenandClinicalCharacteristicsofInflammatoryBowelDiseaseintheChinesePopulation:ASystematicReviewandMeta-Analysis[J],IntJEnvironResPublicHealth,2017,14(3):E238.[2]郑烈,戴彦成,张亚利等.内质网应激信号分子PERK在溃疡性结肠炎肠黏膜损伤中的研究进展[J].世界华人消化杂志,2015,23,(34):5493-5498.[3]HosomiS,KaserA,BlumbergRS.Roleofendoplasmicretic－ulumstressandautophagyasinterlinkingpathwaysinthepathogenesisofinflammatoryboweldisease[J].CurrOpinGastroenterol,2015,31(1):81-88.[4]臧凯宏,姚旭芳,任远等.当归补血汤对溃疡性结肠炎大鼠肠道黏膜屏障功能的影响[J].中国临床药理学杂志,2016,32(10):905-908.[5]原文静,毛堂友,李军祥等.中医药通过调整肠道微生态治疗溃疡性结肠炎的研究现状[J].世界科学技术-中医药现代化,2018,20(4):57-584.[6]陈文华,赵凤达,沈丽娟,李宁,严莉,黄国栋,游宇,杨治芳.姜黄水醇提取液对冰乙酸损伤性溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜保护作用及机制研究.中国中医急症2011,20(1):1611-1612.[7]LuoJ,CaoJ,JiangX,CuiH.Effectoflowmolecularweightheparinrectalsuppositoryonexperimentalulcerativecolitisinmice.BiomedPharmacother2010,64(12):441-445.[8]曹明泽等,小鼠溃疡性结肠炎模型的建立与评价.中国畜牧兽医.2016,43(1):171—175.[9]LiXL,CaiYQ,QinH,WuYJ.TherapeuticeffectandmechanismofproanthocyanidinsfromgrapeseedsinratswithTNBS-inducedulcerativecolitis.CanJPhysiPharmacol.2008,86(2):841-849.[10]BaiA,MaAG,YongM,WeissCR,Ma,GuanQ,BernsteinCN,PengZ.AMPKagonistdownregulatesinnateandadaptiveimmuneresponsesinTNBS-inducedmurineacuteandrelapsingcolitis.BiochemPharmacol.2010,80(16):1708-1717.[11]GuanQ,MaY,HillmanCL,QingG,MaAG,WeissCR,ZhouG,BaiA,WarringtonRJ,BernsteinCN,PengZ.TargetingIL-12/IL-23byemployingap40peptide-basedvaccineamelioratesTNBS-inducedacuteandchronicmurinecolitis.MolMed.2011,17(6):646-656.[12]FiorucciS,MencarelliA,PalazzettiB,SpragueAG,,DistruttiE,MorelliA,NovobrantsevaTI,CirinoG,KotelianskyVE,deFougerollesAR.Importanceofinnateimmunityandcollagenbindingintegrinalpha1beta1inTNBSinducedcolitis.Immunity2002,17(6):769-780.[13]陈建林,陈锦锋,韩宇斌等.芍药汤保留灌肠对湿热型溃疡性结肠炎患者炎性因子的影响[J].中国中西医结合消化杂志.2018,26(11):938—940.[14]易季云,夏冰,黄梅芳,等.鼠溃疡性结肠炎模型的观察[J].新消化病学杂志,1997,33(11):44-47.[15]申