靶向蛋白酶体α34口袋激动剂的设计合成及评价

[13]，目前还没有能够直接激活蛋白酶体功能的药物[10]。近年来，一些科研团队通过虚拟筛选、分子对接等计算化学方法，成功筛选出多个具有蛋白酶体激动作用的小分子，并在体外实验中验证了其生物活性[14-19]。不过总体来看，这些化合物的结构多样性相对较弱，活性也不够理想，并且缺乏较好的选择性，所以在机制研究、药物优化以及临床转化等方面仍需要进一步深入探索。尽管在一些实验模型中，这些分子展现出一定的效果，但它们在特定疾病模型中的研究相对较少，且尚未得到充分验证。尤其是在一些关键临床适应症中，现有激动分子的作用机制、疗效和安全性仍缺乏足够的研究支持。所以这些分子在治疗相关疾病中的潜力和临床价值尚未完全显现，需要进一步的优化与改进。1.3研究内容本研究将凭借虚拟筛选的做法，精准筛选20S蛋白酶体α3/4口袋区域的潜在激动剂，并保障筛选出的化合物具备较高的激动活性，基于这个基础，将对取得的先导化合物开展结构设计与优化事宜，期望得到一批具有良好理化性质、一定活性以及代谢稳定性的目标化合物，针对这些先导化合物实施生物学评价，获得对应的活性数值，并结合其结构特点开展相应调整，进一步考察不同基团对活性起到的影响。1.4拟解决的问题本课题的重点研究内容是探索新型先导化合物，并通过结构优化获得具有更优活性和理化性质的蛋白酶体激动剂。同时，还将开展其作用机制的深入研究，这也是当前蛋白酶体激动剂研究领域的核心方向。PAGE2PAGE2浙江大学城市学院毕业论文（设计） 第2章材料与方法第2章材料与方法2.1实验材料2.1.1实验仪器表2.1实验仪器实验仪器产品型号生产厂家暗箱三用紫外分析仪ZF-20D上海越众仪器设备有限公司电子天平FA2004上海舜宇恒平科学仪器有限公司超声波清洗器PM3-900TDPRIMA公司旋转蒸发器RE212-B雅马拓科技贸易（上海）有限公司低温恒温槽DC-2006常州诺基仪器有限公司循环水式真空泵SHZ-D（III）杭州瑞佳精密仪器有限公司电热恒温鼓风干燥箱DHG-9123A上海精宏实验设备有限公司数显智能控温磁力搅拌器ZNCL-G130*70杭州惠创仪器设备有限公司磁力搅拌器85-2型杭州瑞佳精密仪器有限公司水浴锅BM312-B雅马拓科技贸易（上海）有限公司2.1.2实验试剂表2.2实验试剂试剂名称产品批号生产厂家硅胶2306321于成化工（上海）有限公司石油醚20180305天津市永大化学试剂有限公司二氯甲烷TIEEREU5安徽泽升科技有限公司无水甲醇20231206杭州青辰化学试剂厂无水乙醇20230322杭州青辰化学试剂厂DMF20230607上海凌峰化学试剂有限公司HATUDH23-1387784-1苏州艾康生物医药研发有限公司NH4Cl20190722福晨（天津）化学试剂有限公司无水硫酸钠20230513天津市永大化学试剂有限公司氯化钠YD20230504天津市永大化学试剂有限公司三乙胺20230406天津市永大化学试剂有限公司草酰氯OOEKPELX安徽泽升科技有限公司三氟乙酸OOWERAYK安徽泽升科技有限公司DIPEAOORX1R7K安徽泽升科技有限公司HOBtD05010253安徽泽升科技有限公司EDCA0109380050安徽泽升科技有限公司TBTUE0700010050安徽泽升科技有限公司2.1.3试验药品表2.3实验药品药品名称产品批号生产厂家或购买网址大黄酸C15465740上海麦克林生化科技股份有限公司3-甲基苯胺GC060223安徽泽升科技有限公司异丁胺GC290201萨恩化学技术(上海)有限公司4-（4-甲基-1-哌嗪基）苯胺Fl150107萨恩化学技术(上海)有限公司二苯甲基哌嗪Lg0222204206上海皓鸿生物医药科技有限公司4-（4-吗啉基）苯胺20171210萨恩化学技术(上海)有限公司对甲氧基苯胺C11292964上海麦克林生化科技股份有限公司4-苯基哌啶Lf1210189334上海皓鸿生物医药科技有限公司N-甲基-beta-苯乙胺220903100016上海迈瑞尔生化科技有限公司1,2,3,4-四氢异喹啉03DXR87D安徽泽升科技有限公司N-（2-氨基乙基）吗啉9O2RR4HK安徽泽升科技有限公司1-（噻唑-2-基）哌嗪P2419811上海泰坦科技股份有限公司2.2实验方法2.2.1目标化合物的设计及结构优化本课题在实验室先前工作基础上，利用MolProphet™平台对α3/4亚基间口袋进行基于结构的虚拟筛选并进行活性测试（图2.1），综合考虑化合物的结构新颖性、合成可行性以及后续结构优化潜力，从虚拟筛选得到的Top100分子中最终选出15个有着潜在活性的候选化合物进行活性测试。活性测试结果表明，化合物ZGRX-C06表现出一定的蛋白酶体激动活性（图2.2），在20μM浓度下可将20S蛋白酶体的基准活性提高至基准水平的389%左右，最大激动倍数为5.24倍左右，该骨架类型的分子具有显著的蛋白酶体激动活性潜力，为进一步的结构优化和功能研究提供了重要的先导化合物基础。因此在改造化合物时我们决定保留其特异性骨架，对其侧链进行优化。基于此，我们在先导分子的R1和R2位引入不同的基团，考察对活性的影响，设计如图2.3目标化合物。2.2.2目标化合物的合成路线根据目标化合物结构，通过逆合成反应分析，设计了相应的合成路线（图2.4），在获得目标化合物后，对目标化合物进行体外20S蛋白酶体激动活性测试，以考察不同基团对活性的影响。2.2.3先导化合物ZGRX-C06的合成（1）N-环己基丙烯酰胺(1)（图2.5）的合成将环己胺（2g，20.2mmol）和三乙胺（4.09g，40.4mmol）溶于10.0mL的DCM中，冰浴，逐滴加入丙烯酰氯（1.83g，20.2mmol）的二氯甲烷（5mL）溶液，滴加完毕后，撤去冰浴，继续反应5min。TLC点板显示完全反应后，加入50mL饱和氯化铵水溶液淬灭，萃取，取有机层，水层再用DCM（10mL×2）萃取，有机层合并，旋干得2.94g白色固体。收率：95.1%。（2）N-环丙基丙烯酰胺(2)（图2.6）的合成制备方法同上，环丙胺代替环己胺，得无色油状物。收率：96.1%。（3）N-苯基丙烯酰胺(3)（图2.7）的合成制备方法同上，苯胺代替环己胺，得白色固体。收率：93.4%。（4）叔丁基2-[3-（环己基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(4)（图2.8）的合成将化合物1（2.94g，19.2mmol）和Boc-肼（5.07g，38.4mmol）溶解于30mL异丙醇中，120℃反应3天。TLC点板监测，反应完毕后，旋干异丙醇，加入50mL二氯甲烷稀释，再加入100mL水，萃取，取有机层，有机层再用水（100mL×2）萃取，有机层合并，旋干得黄色油状粗品，粗品经柱层析纯化得白色固体2.7g。收率：49.3%。（5）叔丁基2-[3-（环丙基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(5)（图2.9）的合成制备方法同上，2代替1，得白色固体5。收率：39.8%。（6）叔丁基2-[3-（苯基氨基）-3-氧代丙基]肼基-1-羧酸酯(6)（图2.10）的合成制备方法同上，3代替1，得白色固体6。收率：50.2%。（7）3-氯苯并[d]异噻唑-1,1-二氧化物(7)（图2.11）的合成将糖精（10g，54.6mmol）溶于60mL的1，4-二氧六环，加入SOCl2（32.47g，273.0mmol）和DMF（0.5ml），100℃反应12h。反应完毕后，旋干1，4-二氧六环，加入50mL乙醚洗涤，抽滤，滤饼再用乙醚（30mL×2）洗涤，得白色固体10.3g。收率：93.6%。（8）叔丁基2-[3-(环己基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(8)（图2.12）的合成将化合物4（2.7g，9.46mmol）溶于20mLDCM，加入三乙胺（1.91g，18.92mmol），冰浴，滴加化合物7（1.91g，9.46mmol）的DCM（10mL）溶液，滴加完毕后，继续室温反应5-10min。TLC点板监测反应完全，加入饱和氯化铵溶液（30mL）淬灭，萃取，取有机层，有机层旋干，粗品经柱层析纯化得白色固体3.96g。收率：92.9%。（9）叔丁基2-[3-(环丙基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(9)（图2.13）的合成制备方法同上，5代替4，得白色固体9。收率：95.0%。（10）叔丁基2-[3-(环丙基氨基)-3-氧代丙基]-2-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基-1-羧酸酯(10)（图2.14）的合成制备方法同上，6代替4，得白色固体10。收率：93.1%。（11）N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(11)（图2.15）的合成将化合物8（3.96g,8.79mmol）溶于20.0mL的二氯甲烷中，缓慢加入5.0mL的三氟乙酸，室温反应1h，反应结束后将溶剂旋干，得黄色油状物11，直接用于下一步反应。（12）N-环丙基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(12)（图2.16）的合成制备方法同实验上，9代替8，得黄色油状物12。（13）N-苯基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)肼基]丙酰胺(13)（图2.17）的合成制备方法同上，10代替8，得黄色油状物13。（14）N-环己基-3-(1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-((5-硝基呋喃-2-基)亚甲基)肼基)丙酰胺ZGRX-C06（图2.18）的合成将化合物11（70mg，0.16mmol）和5-硝基呋喃-2-甲醛（26.8mg，0.19mmol）溶于2mL异丙醇，加入醋酸（100μL），80℃反应12h。TLC点板监测反应完全，旋干溶剂，粗品经柱层析纯化得黄色固体ZGRX-C0650.3mg。收率：68.1%。2.2.4目标化合物D-1的合成目标化合物D-1（图2.19）即N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(呋喃-2-基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将呋喃-2-甲醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：62.7%。2.2.5目标化合物D-2的合成目标化合物D-2（图2.20）即N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(噻吩-2-基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：61.7%。2.2.6目标化合物D-3的合成目标化合物D-3（图2.21）即N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(2-(4-氟苯基)乙基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将4-氟苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：64.0%。2.2.7目标化合物D-4的合成目标化合物D-4（图2.22）即N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(2-(4-氯苯基)乙基亚甲基)肼基]的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将4-氯苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：64.0%。2.2.8目标化合物D-5的合成目标化合物D-5（图2.23）即N-环己基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(2-(4-溴苯基)乙基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将4-溴苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：61.9%。2.2.9目标化合物D-6的合成目标化合物D-6（图2.24）即N-环丙基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(2-苯乙基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将化合物12替代11，苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：66.1%。2.2.10目标化合物D-7的合成目标化合物D-7（图2.25）即N-苯基-3-[1-(1,1-二氧化苯并[d]异噻唑-3-基)-2-(2-苯乙基亚甲基)肼基]丙酰胺的合成方法与先导化合物ZGRX-C06类似，将化合物13替代11，苯乙醛代替5-硝基呋喃-2-甲醛，其余方法不变，得白色固体。收率：65.4%。2.2.11活性检测实验方法（1）蛋白酶体激动活性采用荧光底物Suc-LLVY-AMC检测活性，观察不同化合物对酶的激活能力。首先测试目标化合物在20μM浓度下对ChT-L水解位点的激动百分比（Activity(%)@20μM），初步评价化合物的激活效果。对Activity(%)@20μM值大于150%的化合物进行下一步的测试：20S蛋白酶体中的ChT-L蛋白酶会水解底物中的Tyr-AMC，释放出AMC，利用动态法检测单位时间内产生的产物荧光值，通过带有355nm激发光和460nm发射光的多功能酶标仪(PerkinElmer,USA)检测AMC的荧光吸收值，化合物对20S蛋白酶体的半数激动浓度（EC50）和最大激动倍数（MaxFold）用GraphpadPrism4计算，采用sigmoidaldose-response(varibleslope)模型进行拟合。（2）低氧心肌细胞保护活性测试使用MTT分析法检测细胞存活率，将H9c2细胞（1×104/well）铺在96孔板中，孵育过夜后，用受试化合物（1、2.5、5和10μM）处理细胞24小时。向每个孔中加入10μLMTT溶液（5mg/mL），共孵育4小时后，吸弃上清液，加入150μL的DMSO溶解所得的甲晶体，使用酶联免疫吸附测定读取器（Labsystems，Finland）测量570nm处的吸光度值，细胞存活率计算如下：细胞存活率（%）=试验组的OD/对照组的OD*100%。（3）AlphaFold3预测分析由DeepMind实验室开发的AlphaFold是一种解析蛋白质结构的技术，2020这一个年份，AlphaFold2在蛋白质结构预测范畴实现突破性进展，可以从DNA序列里精准预测多数蛋白质的三维结构，这一成就被看作是该领域的革命性突破。作为最新出炉的版本，2024年5月所发布的AlphaFold3在蛋白质结构预测上进一步拓展了能力，除了能高精度地对蛋白质-蛋白质相互作用予以预测，AlphaFold3，还可预测蛋白质跟核酸、小分子等其他样式生物分子的相互作用关系。 。

浙江大学城市学院毕业论文（设计） 第3章结果与讨论第三章结果与讨论3.1目标化合物结构及结构信息目前共合成目标先导化合物1个、目标化合物7个，以下是1个目标先导化合物及7个目标化合物的分子结构及核磁共振氢谱及质谱数据：ZGRX-C061HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.94(d,J=7.6Hz,1H),8.41(s,1H),8.07(d,J=6.9Hz,1H),7.92(d,J=7.6Hz,1H),7.89-7.79(m,3H),7.33(d,J=3.9Hz,1H),4.45(t,J=7.2Hz,2H),3.49-3.41(m,1H),2.53(t,J=7.2Hz,2H),1.70-1.63(m,2H),1.58(dd,J=9.5,3.3Hz,2H),1.47(dd,J=8.6,3.5Hz,1H),1.17(dd,J=24.2,12.2Hz,2H),1.10-1.01(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.73,160.52,152.60,151.55,143.78,134.45,134.28,134.05,131.33,127.41,122.30,117.06,114.83,48.15,43.13,32.77,31.78,25.68,24.92.ESI-MS:m/z=474.1425[M+H]+.（2）D-11HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.99-8.88(m,1H),8.32(s,1H),8.06-8.01(m,1H),7.98-7.90(m,2H),7.87-7.81(m,2H),7.05(d,J=2.8Hz,1H),6.70(s,1H),4.44(t,J=6.7Hz,2H),3.50-3.43(m,1H),2.51(t,J=6.9Hz,2H),1.65(d,J=10.9Hz,2H),1.58(d,J=12.8Hz,2H),1.47(d,J=11.9Hz,1H),1.17(dd,J=23.4,11.4Hz,2H),1.03(dd,J=21.5,10.8Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.81,159.79,149.52,146.69,143.80,136.46,134.20,134.11,131.34,127.75,122.21,116.81,113.14,48.07,42.69,32.80,31.90,25.66,24.98.ESI-MS:m/z=429.1577[M+H]+.（3）D-21HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.01-7.88(m,4H),7.75(t,J=7.5Hz,1H),7.47(t,J=7.6Hz,1H),7.39(dd,J=11.2,4.6Hz,2H),7.33(t,J=8.0Hz,2H),7.21(ddd,J=20.7,14.0,7.6Hz,1H),4.34(t,J=7.2Hz,2H),3.85(d,J=4.2Hz,2H),3.53-3.42(m,1H),2.45(d,J=7.4Hz,2H),1.72-1.60(m,4H),1.55-1.48(m,1H),1.22(dd,J=24.2,12.1Hz,2H),1.08(dt,J=16.8,6.3Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.66,159.65,151.09,143.73,136.75,133.95,133.68,131.41,130.04,129.16,127.47,127.27,121.95,48.02,42.44,38.95,32.85,31.80,25.67,25.01.ESI-MS:m/z=453.1944[M+H]+.（4）D-31HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.07(d,J=8.0Hz,1H),8.00(d,J=7.6Hz,1H),7.96(t,J=4.2Hz,1H),7.90(d,J=7.6Hz,1H),7.81(t,J=7.5Hz,1H),7.51(t,J=7.7Hz,1H),7.42-7.34(m,2H),7.23(t,J=8.8Hz,2H),4.36(t,J=7.1Hz,2H),3.87(d,J=4.1Hz,2H),3.55-3.44(m,1H),2.48(d,J=7.2Hz,2H),1.68(t,J=15.5Hz,4H),1.54(d,J=11.7Hz,1H),1.24(dd,J=23.9,11.9Hz,2H),1.15–1.04(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.70,159.70,150.99,143.84,134.06,133.44,132.96,131.98,131.90,131.30,127.53,122.00,115.98,115.77,48.06,42.51,38.08,32.85,31.88,25.70,25.01.ESI-MS:m/z=471.1854[M+H]+.（5）D-41HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.02-7.94(m,3H),7.90(d,J=7.5Hz,1H),7.81(t,J=7.5Hz,1H),7.48(dd,J=14.7,7.9Hz,3H),7.37(d,J=8.2Hz,2H),4.36(t,J=7.0Hz,2H),3.88(d,J=3.8Hz,2H),3.54-3.44(m,1H),2.48(d,J=7.3Hz,2H),1.68(t,J=15.2Hz,4H),1.54(d,J=11.7Hz,1H),1.24(dd,J=23.6,11.6Hz,2H),1.09(dt,J=16.6,8.4Hz,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.69,159.70,150.80,143.85,135.92,134.05,133.30,132.00,131.25,129.09,127.50,122.01,48.06,42.48,38.22,32.85,31.85,25.70,25.00.ESI-MS:m/z=487.1596[M+H]+.（6）D-51HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ7.98(dd,J=11.3,8.1Hz,3H),7.89(d,J=7.6Hz,1H),7.80(t,J=7.5Hz,1H),7.59(d,J=8.1Hz,2H),7.49(t,J=7.7Hz,1H),7.30(d,J=8.1Hz,2H),4.35(t,J=7.1Hz,2H),3.85(d,J=3.9Hz,2H),3.53-3.43(m,1H),2.47(d,J=7.1Hz,2H),1.67(t,J=15.2Hz,4H),1.53(d,J=12.1Hz,1H),1.23(dd,J=24.0,12.1Hz,2H),1.13-1.05(m,3H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.70,159.70,150.75,143.84,136.33,134.04,133.31,132.38,132.02,131.24,127.49,122.02,120.49,48.06,42.47,38.28,32.85,31.85,25.70,25.01.ESI-MS:m/z=531.1093[M+H]+.（7）D-61HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ8.08(d,J=3.6Hz,1H),8.02(d,J=8.0Hz,1H),7.96(d,J=6.9Hz,2H),7.76(t,J=7.5Hz,1H),7.48(t,J=7.6Hz,1H),7.42-7.36(m,2H),7.35-7.31(m,2H),7.21(ddd,J=21.1,14.3,7.3Hz,1H),4.35(t,J=7.3Hz,2H),3.86(d,J=4.3Hz,2H),2.58(ddd,J=10.9,7.3,3.7Hz,1H),2.42(s,2H),0.58(td,J=6.8,5.0Hz,2H),0.39-0.33(m,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ170.90,159.76,151.16,143.85,136.85,134.01,133.73,131.48,130.11,129.24,127.56,127.33,122.00,42.42,39.03,31.69,22.81,6.11.ESI-MS:m/z=411.1377[M+H]+.（8）D-71HNMR(400MHz,DMSO-D6)δ10.10(s,1H),8.05(t,J=4.4Hz,1H),8.00(dd,J=13.2,7.8Hz,2H),7.76(t,J=7.5Hz,1H),7.55(d,J=7.7Hz,2H),7.48(t,J=7.7Hz,1H),7.38-7.27(m,7H),7.03(t,J=7.4Hz,1H),4.45(t,J=7.3Hz,2H),3.84(d,J=4.3Hz,2H),2.75(t,J=7.3Hz,2H).13CNMR(101MHz,DMSO-D6)δ168.85,159.75,151.28,143.75,139.37,136.75,133.99,133.71,131.44,130.03,129.23,129.16,127.49,127.26,123.83,121.98,119.69,42.08,38.96,32.71.ESI-MS:m/z=469.1293[M+Na]+.3.2目标化合物蛋白酶体激动活性评价选取化合物TCH-165为阳性对照，对合成的7个目标化合物进行分子水平蛋白酶体激动活性筛选。首先测试化合物在20μM时对20S蛋白酶体CT-L水解活性的影响，若活性水平提高至基准水平的150%及以上，则判定具有一定的20S蛋白酶体激动能力，并继续测定半数有效浓度（EC50）和活性最大增加倍数（Emax），以量化活性强度。实验结果表明（表3.2），除D-6外，其余6个目标化合物均具有较好的蛋白酶体激动活性且活性优于阳性对照TCH-165。表3.1目标化合物蛋白酶体激动活性序号结构20μM激动倍数(%)EC50(μM)EmaxD-1205.53±9.398.13±0.684.76±0.34D-2345.70±22.784.06±1.103.83±0.61D-3260.41±3.472.95±0.262.82±0.41D-4255.96±12.582.68±0.672.80±0.61D-5257.63±18.811.56±0.142.73±0.16D-6131.86±89.28--D-7270.94±0.392.43±0.032.85±0.003.2低氧心肌细胞保护活性测试在常氧条件下（图3.1），七个受试化合物在1-10μM浓度范围内未表现出明显细胞毒性，且呈现轻微促增殖效应，表明其具有优良的生物安全性。在缺氧损伤模型中（图3.2）所有化合物均显示出细胞保护效应，且具有一定的浓度依赖性。3.3AlphaFold3预测分析我们基于Alphafold3对小分子和蛋白酶体的结合口袋和结合能力进行预测，以验证基于虚筛及结构优化发现化合物的可靠性。为了确保预测结果的准确性，首先对蛋白酶体的顶部“盖子”的α1-7亚基进行了结构预测，同时与已有的晶体解析结构（PDBID:4R3O）进行比较（图3.3），两者的RMSD（均方根误差）仅为0.343372,即α1-7亚基各个部分原子偏离平均位置的程度极低，这说明蛋白酶体盖子的预测结果与实际的蛋白酶体晶体解析结构几乎完全一致。同时预测的ipTM（界面预测TM分数）得分达到0.88（ipTM＞0.8代表结果优秀），也说明了预测结果的准确性。随后，我们选化合物D-2采用AlphaFold3对其结合口袋进行预测分析（图3.4），验证结构修饰后的化合物是否仍能特异性结合于α3/4口袋。如图所示，预测结果表明，该化合物对α1/2口袋比对α3/4口袋具有更强的亲和力，但仍结合与蛋白酶体α亚基间口袋，促进20S蛋白酶体门控的开启与活性激动。在此基础上，我们进一步利用分子对接研究了化合物D-2在α1/2口袋的结合模式，并计算了其最低结合自由能。结果如图3.5所示，化合物D-2的邻磺酰苯甲酰亚胺片段作为氢键受体分别与α1亚基的Tyr159和α2亚基的Lys64相互作用。此外，与该片段相邻的苯环以及与肼连接的苯环能够与周围氨基酸残基形成疏水相互作用。根据分子对接模拟计算结果显示，化合物D-2的最低结合能为-8.2kcal/mol。3.4讨论本研究试图运用虚拟筛选及结构优化策略，开展设计与筛选工作，得到靶向蛋白酶体α3/4口袋的激动剂，我们对相关分子的结构实施了分析，还针对不同结构修饰的化合物进行了活性筛选，某些有着特定结构的化合物表现出显著的蛋白酶体激动活性。若在R1位引入环己基或者苯基，当在R2位引入硝基呋喃或卤代苯乙基之际，衍生物（如D-5）明显强化了蛋白酶体的激动特性，该效应可能跟硝基基团的强吸电子效应有关系，进而提高了分子与蛋白酶体α1亚基的氢键相互作用强度；卤素取代的苯乙基基团大概利用疏水作用促进了化合物跟蛋白酶体的结合，令它的构象稳定不变，活性得到了进一步增强。