1株异养硝化好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮特性研究

1株异养硝化好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮特性研究Isolation,identificationanddenitrificationcharacteristicsofaheterotrophicaerobicdenitrifyingbacterium目录摘要……………1关键词…………11前言………………21.1 养殖水体氮素污染现状……………21.2氨氮和亚硝酸盐氮对水产养殖危害及其去除方法………………21.3异养硝化-好氧反硝化研究进展.…………………31.4研究内容.………………………32试验材料与方法.……………………42.1试验材料.…………42.1.1菌种分离样品.……………………42.1.2培养基.……………42.1.3试验药品…………42.1.4试验仪器.…………42.2好氧反硝化细菌的筛选.…………52.2.1菌株的富集.………………………52.2.2菌株初筛.…………52.2.3菌株复筛.…………52.2.4菌种保藏.…………52.2.5菌种鉴定.…………52.3除氮特性研究.……………………62.3.1碳源对菌株除氮特性的影响.……………………62.3.2C/N对菌株除氮特性的影响.……………………72.3.3初始pH值对菌株除氮特性的影响……………72.3.4培养温度对菌株除氮特性的影响.………………72.3.5摇床转速对菌株除氮特性的影响………………72.4氮源种类对菌株除氮特性的影响…….…………72.5测定方法.………….………………82.6数据处理.………….………………83结果与分析.………….………………93.1菌种初筛结果.………….…………83.2菌种复筛结果.………….…………83.3菌种鉴定.………….…………93.3.1菌株形态特征………….…………93.3.2生理生化特征.………….…………93.3.316SrDNA序列及其系统发育分析.……………103.4标准曲线.………….………………123.5菌株除氮特性研究……….………123.5.1不同碳源对菌株除氮特性的影响.……………123.5.2C/N对菌株除氮特性的影响.………….………133.5.3初始pH值对菌株除氮特性的影响.………….………………143.5.4培养温度对菌株除氮特性的影响………….…143.5.5摇床转速对菌株除氮特性的影响.……………153.6不同氮源对菌株除氮的影响.………….…………154讨论.………….………………185结论…………………19参考文献……………19致谢……………………21株异养硝化好氧反硝化细菌的分离鉴定及脱氮特性研究摘要：从养殖池塘底泥中筛选出一株异养硝化-好氧反硝化菌，命名为HFQ-NAH，通过形态学观察、生理生化实验以及16SrDNA基因序列分析，对菌株HFQ-NAH进行了鉴定。利用单因素试验探究了碳源、C/N、pH、温度、转速对菌株HFQ-NAH脱氮特性的影响。结果表明，菌株HFQ-NAH为神户肠杆菌HFQ-NAH（EnterobacterkobeiHFQ-NAH），其最佳脱氮条件为以柠檬酸三钠为碳源，C/N=18，初始pH=7.0，温度26℃，转速为190r/min。在此条件下，菌株24h内亚硝酸盐氮的去除率为99.98%，总氮去除率为89.37%。通过对菌株脱氮途径的探究，发现当环境中氨氮浓度较低时（60.87mgNH4+－N/L），菌株易形成硝酸型硝化；而当环境中氨氮浓度较高时（121.74mgNH4+－N/L），菌株易形成亚硝酸型硝化，存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。试验结果为菌株Enterobactersp.HFQ-NAH在养殖废水中的应用奠定了良好的基础。关键词：异养硝化；好氧反硝化；脱氮特性Isolation,identificationanddenitrificationcharacteristicsofaheterotrophicaerobicdenitrifyingbacteriumAbstract:Astrainofheterotrophicnitrification-aerobicdenitrifyingbacteriawasselectedfromthebottommudofbreedingpondandnamedHFQ-NAH.Thestrainwasidentifiedbymorphologicalobservation,physiologicalandbiochemicalexperimentsand16SrDNAgenesequenceanalysis.Singlefactortestwasusedtoinvestigatetheeffectsofcarbonsource,C/N,pH,temperatureandrotationspeedonthedenitrificationcharacteristicsofHFQ-NAH.Basedontheresultsofsinglefactorexperiment,thefactorsthatinfluencethedenitrificationeffectwereoptimizedbyresponsesurfacemethod,andthedenitrificationpathwaywaspreliminarilyexploredbychangingthenitrogensourceconditions.TheresultsshowedthatHFQ-NAHwasEnterobacterkobeiHFQ-NAH.Theoptimaldenitrificationconditionwasusingtrisodiumcitrateasthecarbonsource,C/N=18,initialPH=7.0,temperature26℃,androtationalspeedof190r/min.Undertheseconditions,theremovalrateofnitritenitrogenwas99.98%andthetotalnitrogenremovalratewas89.37%within24hours.Throughtheinvestigationofthedenitrificationpathwayofthestrain,itwasfoundthatwhentheconcentrationofammonianitrogenintheenvironmentwaslow(60.87mgNH4+－N/L),thestrainwaseasytoformnitricacidnitrification.However,whentheconcentrationofammonianitrogenintheenvironmentishigh(121.74mgNH4+－N/L),thestrainiseasytoformnitritenitrification,andthereexistsacertainshort-rangeheterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationprocess..TheresultslaidagoodfoundationfortheapplicationofEnterobactersp.HFQ-NAHinaquaculturewastewater.Keywords:heterotrophicnitrification；aerobicdenitrification；denitrificationcharacteristics前言养殖水体氮素污染现状现今水产养殖日渐商业化，养殖密度高、管理集约化成为养殖过程的最大特点，有效提高养殖利润的同时，也给水体中生物的生存环境以及人的身体健康造成严重影响。氨氮、亚硝酸盐氮等氮素是存在于养殖废水中的主要毒性物质[1]。在集约化、规模化养殖中，投入的饲料不能完全被鱼类全部利用，再加上鱼类的粪便等分泌物沉积水底，导致养殖池塘内的氮素污染严重。氮素的增加会使得水中的浮游生物激增，挤占水生动物的生存空间，使水中溶氧降低，导致水生动物不能获得充足的氧气。这些氮素在微生物作用下转化为无机氮，使得水中无机氮含量升高、引起水质恶化、造成鱼类疾病爆发，而且氮素超标的养殖尾水一旦进入江河等流域中会造成生态环境的污染[2]。1.2氨氮和亚硝酸盐氮对水产养殖危害及其去除方法氨氮是水产养殖中主要的污染物之一，主要是以非离子氨和离子铵两种形式存在于水体中，其中非离子氨是主要的毒性物质[2]，对水生生物造成一定的毒害作用。在氨氮的胁迫下，鲫鱼的免疫基因和抗氧化基因发生变化，同时肠道内病原微生物菌群数量升高[3]；氨氮使凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）的非特异性免疫酶活降低，且对副溶血弧菌的抵抗力下降[4-5]。封琦等[6]发现在不同氨氮浓度和暴露时间条件下，中华鳑鲏（Rhodeussinensis）血清中的过氧化氢酶（CAT）与碱性磷酸酶（APK）产生了相应显著的变化（P<0.05）。氨氮在水体中经微生物的硝化过程可形成亚硝酸盐氮，而水体中的亚硝酸盐氮含量一旦过高，则会影响水生生物的各项机能。宫春光等[7]发现亚硝酸盐氮对斑尾复鰕虎鱼（Synechogobiushasta）的鳃组织、肝脏、脾脏、肾组织均存在影响；滕涛等[8]发现随着亚硝酸盐氮胁迫时间的延长，团头鲂（Megalobramaamblycephala）对亚硝酸盐氮的耐受性越低，血红蛋白含量降低，高铁血红蛋白比率上升；肖威等[9]发现亚硝酸盐氮的慢性胁迫会降低凡纳滨对虾的食欲，减缓对虾的生长；XiaoC等[10]亚硝酸盐氮急性胁迫会扰乱草鱼甲状腺激素的代谢平衡并使得甲状腺功能逐渐减退。因此，人工养殖过程中，应严格控制好水体中氨氮和亚硝酸盐氮的浓度，能尽量避免由于水质问题所带来的动物病害，造成经济损失[2]。养殖水体中氨氮、亚硝酸盐氮的处理包括物理法[11]、化学法[12]和生物法[13]。物理除氮法包括换水、过滤、吸附、曝气、吹脱、气提、泡沫分离技术等[14]，其不足之处在于成本高、占地面积大；化学除氮法主要利用氧化还原反应去除氮素，虽然除氮效率高，但容易造成水体二次污染，甚至对人体致癌[14]；而生物除氮法操作简单，主要利用微生物的各种生理代谢作用，二次污染少，处理效率高[15]，具有广阔的应用前景。1.3异养硝化-好氧反硝化研究进展传统认为硝化和反硝化是两个独立的过程。1983年，Robertson和Kuenen发现一种能进行异养硝化-好氧反硝化的硫细菌Thiosphaerapantotropha[16]。自此，异养硝化-好氧反硝化细菌被广泛研究。在有氧条件下，异养硝化-好氧反硝化细菌能够利用环境中的有机碳源与氮源进行生长，不仅能有效降低有机物含量，利用自发反应去除氨氮与亚硝酸盐氮，而且除氮率高、除氮速率快，避免了二次污染。近年以来，许多研究者从自然界分离筛选出了异养硝化-好氧反硝化菌并开展研究。项文琪[17]等分离出一株B3细菌，其在高浓度氨氮废水中对NH4+-N去除率达96.9%，且具有良好的好氧反硝化性能；王珺[18]等筛选出快速有效降解氨氮的菌株PseudomonasluridaX1和PseudomonasweihenstephanensisX2，48h内对氨氮降解率分别高达98.05%、97.63%；王秀杰[19]等发现菌株Acinetobactorsp.JQ1004可以在100～2000mgNH4+-N/L的条件下生长繁殖,同时对氨氮产生一定的降解作用。孟爽[20]筛选出1株PseudomonaschloritidismutansADM8-1，以亚硝酸盐氮为唯一氮源进行好氧反硝化作用，48h亚硝氮去除率为86.73%；李雪[21]等分离出好氧反硝化菌株Pseudomonassp.HG-7，以亚硝酸盐氮为氮源时，低浓度条件(48.1mg/L)下可去除100%亚硝酸氮；李誉琦[22]等发现BacillussubtilisY7在50℃的高温下对1100mg/L亚硝酸盐氮的降解率仍达到100%。1.4研究内容针对目前我国养殖水体中氮素污染严重的现状，本试验拟筛选出1株具有异养硝化-好氧反硝化能力的细菌，研究碳源、碳氮比、温度、转速、pH对其脱氮特性的影响，并初步探究该菌异养硝化-好氧反硝化脱氮途径。2试验材料与方法2.1试验材料2.1.1菌种分离样品采集于湖南农业大学东湖养殖场池塘底泥。2.1.2培养基斜面培养基：牛肉膏10g/L，蛋白胨5g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L，pH自然。富集培养基：牛肉膏10.0g/L，蛋白胨5.0g/L，NaCl10.0g/L，pH自然。BTB-反硝化固体培养基：柠檬酸钠9.0g/L，NaNO20.6g/L，Na2HPO41.0g/L，NaH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl22.0g/L，1%BTB1.0mL/L，琼脂2.0g/L，pH7.0。基础发酵培养基：柠檬酸钠9.0g/L，NaNO20.6g/L，NaH2PO41.0g/L，Na2HPO41.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，CaCl22.0g/L，pH7.0。2.1.3试验药品C6H12O6、CH3COONa、C4H4Na2O4、C4H4Na2O6、Na3C6H5O7·2H2O、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、(NH4)2SO4、NH4Cl、NaNO3、KNO3、NaNO₂、NaCl、CH4N2O、Na2HPO4、K2S2O8、NaOH、H3PO4、C6H8N2O2S、C12H14N2·2HCl、HgI2、KI、NaKC4H4O6·4H2O、NH2SO3H（AR，国药集团化学试剂有限公司）；HCl（AR，株洲市星空化玻有限责任公司）；琼脂（BR，北京索莱宝科技有限公司）；酵母膏、牛肉膏、蛋白胨（BR，上海盛思生物科技有限公司）。2.1.4试验仪器表1试验设备仪器Table1Experimentalequipmentandinstruments名称型号生产厂家电子天平TP-A200美国康州HZ电子科技有限公司分析天平AL204梅特勒—托利多仪器有限公司立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50S11上海博讯实业有限责任公司医疗设备厂电热恒温鼓风干燥箱LDO-101上海龙跃仪器设备有限公司电热恒温水浴锅DZKW-S-4北京市永光明医疗仪器有限公司超纯水制备机ZWM-UTI-10湖南中沃水务环保科技有限公司续表1名称型号生产厂家pH计Bante210上海般特仪器制造有限公司紫外分光关度计SP-752上海光谱仪器有限公司恒温恒湿箱HWS-250BX天津泰斯特仪器有限公司振荡培养箱ZQLY-180N上海知楚仪器有限公司单人单面医用净化工作台SW-CJ-1FD上海苏净实业有限公司商用冷藏柜SC-242D青岛海尔集团DNA电泳槽DYCP-31DN北京六一仪器厂稳压电泳仪DYY-5北京六一仪器厂冷冻高速离心机HC-2518RBBI电磁炉KEO-20AS206康佳集团股份有限公司2.2好氧反硝化细菌的筛选2.2.1菌株的富集取10g养殖池塘污泥加入100mL的富集培养基中（加入适量的破玻璃珠），置于30℃、170r/min摇床中培养72h。2.2.2菌株初筛取10mL富集液加入90mL的无菌水中振荡15min后，采用10倍稀释法稀释成10-1-10-8，分别取0.1mL不同稀释度的菌悬液涂布于BTB-反硝化固体培养基平板上，倒置于30℃恒温培养箱中培养，待固体平板上长出单菌落后，挑取不同的单菌落进行分离纯化并编号。2.2.3菌株复筛将分离纯化的菌种分别接种于种子培养基中，于30℃、170r/min培养24h后，将种子液按1%(V/V)接种于基础发酵培养基中，置于30℃、170r/min的摇床中振荡培养48h，测定NO2--N的含量，并计算亚硝酸盐氮的去除率。2.2.4菌种保藏将最终选定的菌株接种保存到斜面培养基上，置于4℃冰箱中低温保藏。2.2.5菌种鉴定（1）菌落、菌体形态观察及生理生化指标测定参照《常见细菌系统鉴定手册》[23]。对分离的异养硝化-好氧反硝化反能力较强的菌株进行菌落、菌体形态观察及常规生理生化分析。生理生化试验主要包括革兰氏染色、糖醇类发酵试验、甲基红试验（MR）、乙酰甲基甲醇试验（V-P）、淀粉水解试验、硝酸盐还原试验、亚硝酸盐还原试验、吲哚试验、纤维素水解试验。（2）16SrDNA序列分析用LB培养基培养菌株HFQ-NAH24h后，采用上海生工生物工程DNA提取试剂盒（SK8255）进行DNA提取。以提取的基因组DNA为模板，扩增16SrDNA基因片段。正向引物序列：27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3',反向引物序列：1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR扩增反应体系见表2，PCR循环条件见表3。表2PCR反应体系Table2PCRreactionsystem试剂体积（uL）Template0.510˟Buffer(withMg2+)2.5dNTP1酶0.2F(10uM)0.5R(10μM)0.5加ddH2O至25表3PCR反应程序Table3PCRreactionprogram程序温度时间预变性94℃4min94℃45s30cycle55℃45s72℃1min延伸72℃10min终止反应4℃∞测序由上海生工生物工程有限公司完成。使用BLAST程序(/BLAST/Blast.cgi)将16SrDNA序列与GenBank数据库中的序列进行比对，并提交给GenBank，采用NJ法，用MEGA7.0.26构建系统发育树。2.3除氮特性研究2.3.1碳源对菌株除氮特性的影响在300mL三角瓶中装入C/N=14的100mL基础发酵培养基，将蔗糖、丁二酸钠、酒石酸钠、碳酸钠等质量替换基础发酵培养基中的柠檬酸三钠，其它成分及含量保持不变。按1%（V/V）接种量将活化菌液接入培养基，置于30℃、170r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，在4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察碳源种类对菌株除氮特性的影响。2.3.2C/N对菌株除氮特性的影响在上述试验结果的基础上，改变基础发酵培养基中碳源的添加量，调节C/N为2、6、10、14、18、22，其它成分及含量保持不变。按1%（V/V）接种量将活化菌液接入培养基，置于30℃、170r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，在4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察不同C/N对菌株除氮特性的影响。2.3.3初始pH值对菌株除氮特性的影响在上述试验结果的基础上，分别调节基础发酵培养基的pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，其它成分及含量保持不变。按1%（V/V）接种量将活化菌液接入培养基，置于30℃、170r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，在4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察培养基初始pH值对菌株除氮特性的影响。2.3.4培养温度对菌株除氮特性的影响在上述试验结果的基础上，将装有100mL培养基的300mL三角瓶分别置于22℃、27℃、32℃、37℃、42℃恒温振荡培养箱中，其它条件不变。按1%（V/V）接种量将活化菌液接入培养基，170r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，在4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察培养温度对菌株除氮特性的影响。2.3.5摇床转速对菌株除氮特性的影响在上述试验结果的基础上，将装有100mL培养基的300mL三角瓶分别于置于130r/min、150r/min、170r/min、190r/min、210r/min转速的振荡培养箱中培养24h，其它条件不变。于4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察摇床转速对菌株除氮特性的影响。2.4氮源种类对菌株除氮特性的影响在上述试验结果的基础上，用NH4Cl、NaNO3、混合氮（NH4Cl和NaNO2/NaNO3）替代基础发酵培养基中的NaNO2，其它条件不变。按1%（V/V）接种量将活化菌液接入培养基，170r/min恒温振荡培养箱中培养24h后，在4℃、8000r/min条件下离心10min。测定上清液中的亚硝酸盐氮、总氮及OD600。三次平行。考察不同氮源种类对菌株脱氮特性的影响。2.5测定方法氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮、总氮的测定参照《水和废水监测分析方法》[24]提供的方法进行测定。总氮（TN）采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法、亚硝酸盐氮（NO2--N）测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法、氨氮（NH4+-N）测定采用纳氏试剂法、硝酸盐氮（NO3--N）测定采用紫外分光光度法。2.6数据处理采用SPSS25.0统计软件对数据进行one-wayANOVA分析、Tukey’sHSD分析（P<0.05）；结果以平均值±标准差（Means±SD）表示。作图采用GraphPadPrism8.0.1。3结果与分析3.1菌种初筛结果挑取单菌落进行分离纯化后，得到一号菌株，在初筛平板培养基的菌落形态如图1。图1初筛菌落图Fig.1preliminaryscreeningcolonydiagram3.2菌种复筛结果表4一号菌株对亚硝酸盐氮的去除率Table4removalrateofnitritenitrogenbystrain1序号亚硝酸盐氮降解率（%）194.05295.32393.71平均值94.36从表4可知，一号菌株在经过48h的发酵培养后，对亚硝酸盐氮的去除率达到94.36%，因此选定一号菌株进行下一步实验，并命名为HFQ-NAH。3.3菌种鉴定3.3.1菌株形态特征图2为菌株HFQ-NAH在BTB平板培养基中培养24h后生长的菌落形态，菌落为圆形，较小，白色，表面湿润光滑，边缘整齐，半透明；显微镜下细菌形态特征呈短杆状、无芽孢，周生鞭毛。见图3a，图3b。图2菌株HFQ-NAH菌落形态Fig.2ThecolonymorphologyofstrainHFQ-NAH普通染色鞭毛染色图3显微镜下菌株HFQ-NAH形态Fig.3ThemorphologyofstrainHFQ-NAHunderthemicroscope3.3.2生理生化指标试验结果见表5。表5生理生化指标Table5Physiologicalandbiochemicalindicators生理生化项目结果半乳糖麦芽糖+-甘露醇-续表5生理生化项目结果MR反应-V-P反应+水解淀粉-硝酸盐还原+亚硝酸盐还原吲哚纤维素水解+--MR反应-V-P反应+注:“+”表示结果为阳性，“－”表示结果为阴性。Note:"+"meanstheresultispositive,and"-"meanstheresultisnegative.3.3.316SrDNA序列及其系统发育分析以菌株HFQ-NAH的DNA为模板，通过使用通用引物对其进行扩增处理。经凝胶电泳后得到一条长度在1475bp左右的扩增产物如图4。1500bp1500bpMarkHFQ-NAH图4PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.4ThegelelectrophoresispictureofPCRproduct在凝胶电泳图中，目的片段在1500bp左右条带较亮，且无其他杂带，说明PCR扩增得到了目的片段。将扩增后的目的基因进行16SrDNA测序，测序结果如图5。图5菌株HFQ-NAH16SrDNA序列Fig.5The16SrDNAsequenceofstrainHFQ-NAH将获取基因序列提交NCBI上进行BLAST比对，发现菌株HFQ-NAH与肠杆菌属（Enterobactersp.）成员关系密切，并使用软件MEGA7.0.26采用邻接法制作系统发育树，如图6。试验结果发现菌株HFQ-NAH与神户肠杆菌Enterobacterkobei(登录号CP042578.1:217565-219039)有100%的的序列相似性。结合形态学和生理生化试验结果，将菌株HFQ-NAH鉴定为EnterobacterkobeiHFQ-NAH。图6基于16SrDNA序列同源性构建的菌株HFQ-NAH的系统发育树Fig.6phylogenetictreeofstrainHFQ-NAHbasedonhomologyof16SrDNAsequence3.4标准曲线总氮、氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的标准曲线如图7～图10。图7总氮标准曲线图8氨氮标准曲线Fig.7ThestandardcurveofTNFig.8ThestandardcurveofNH4+-N图9亚硝酸盐氮标准曲线图10硝酸盐氮标准曲线Fig.9ThestandardcurveofNO2–NFig.10ThestandardcurveofNO3--N从图7～图10可以看出，总氮标准曲线的拟合方程为y=0.0095x+0.0002，R²=0.9999；氨氮标准曲线的拟合方程为y=0.0035x+0.0015，R²=0.9982；亚硝酸盐氮标准曲线的拟合方程为y=0.0665x+0.0017，R²=0.9997；硝酸盐氮标准曲线的拟合方程为y=0.0106x-0.0021，R²=0.9964。说明线性关系良好。3.5菌株除氮特性研究3.5.1不同碳源对菌株除氮特性的影响如图11所示，五种碳源对菌株降解亚硝酸盐氮、总氮的去除和菌体浓度有极显著性影响（P＜0.01）。菌株HFQ-NAH在以柠檬酸钠、碳酸钠、蔗糖为碳源时均能生长。柠檬酸钠为碳源时菌株生长最佳，对亚硝酸盐氮和总氮去除率最高，分别为93.79%、75.37%。其次是碳酸钠、蔗糖。在其他四种碳源分别做唯一碳源时，菌株对亚硝酸盐氮、总氮的去除率低于30%。因此，选用柠檬酸钠作为唯一碳源进行后续试验。图11碳源对菌株HFQ-NAH除氮特性的影响Fig.11EffectsofcarbonsourcesonnitrogenremovalcharacteristicsofstrainHFQ-NAH3.5.2C/N对菌株除氮特性的影响如图12所示，在C/N在2～22之间，对菌体浓度以及对亚硝酸盐氮的去除有极显著影响（P＜0.01），对总氮的去除有显著影响（P＜0.05）。菌株HFQ-NAH在C/N为2、6、10、14、18、22时均能生长。随着C/N的升高，菌株HFQ-NAH对亚硝酸盐氮及总氮的降解率呈现先升高后降低的趋势。当C/N=18时，OD600最高，对亚硝酸盐氮去除率最高为91.56%，对总氮去除率最高为66.95%。说明在C/N为18时，菌株HFQ-NAH的反硝化速率最高。当C/N升高为22时，亚硝酸盐氮、总氮降解率和OD600均下降。说明当柠檬酸钠添加量增多时，对菌株的好氧反硝化起到一定的抑制作用。因此，选取最佳C/N为18进行后续试验。图12C/N对菌株HFQ-NAH除氮特性的影响Fig.12EffectsofC/NonthenitrogenremovalcharacteristicsofstrainHFQ-NAH3.5.3初始pH值对菌株除氮特性的影响pH影响着微生物的细胞膜电荷量、细胞膜通透性以及对营养物质的吸收，每种微生物都有适合其生长的pH范围。如图13所示，当初始pH值处于6～10时，对亚硝酸盐氮、总氮的去除和菌体浓度均具有极显著影响（P＜0.01）。当初始pH为7～10时，OD600较高，菌株HFQ-NAH均生长较好；当初始pH为7、8、9时，菌株对亚硝酸盐氮的去除率均接近100%，对总氮的去除率均超过80%，去除效果明显，说明菌株处于其适宜的pH范围。当pH继续升高至10，OD600下降，菌株对亚硝酸盐氮、总氮去除率均下降，说明PH过高会抑制菌株的生长以及对氮的去除。因此，选取最佳pH=7进行后续试验。图13初始pH值对菌株HFQ-NAH除氮特性的影响Fig.13EffectsofinitialpHvalueonthenitrogenremovalcharacteristicsofstrainHFQ-NAH3.5.4培养温度对菌株除氮特性的影响温度的变化对于微生物而言，影响其细胞膜的流动性，也影响酶促反应速率，最终影响细胞合成。菌株均有适应范围的温度生长，如图14所示，当温度为22～42℃时，对亚硝酸盐氮、总氮的去除和菌体浓度具有极显著影响（P＜0.01）。当温度为27℃、32℃、37℃时，菌株HFQ-NAH生长较好，对亚硝酸盐氮的去除率均接近100%；当温度为27℃时，菌株对总氮去除率最高为84.64%。当温度降为22℃或升高至42℃时，菌株对亚硝酸盐氮、总氮去除率及OD600均下降，说明温度过低或过高均会影响菌株的生长以及对氮的去除。因此，选取最适宜温度为27℃进行后续试验。图14温度对菌株HFQ-NAH除氮特性的影响Fig.14EffectsoftemperatureonthenitrogenremovalcharacteristicsofstrainHFQ-NAH3.5.5摇床转速对菌株除氮特性的影响对于好氧反硝化菌，O2不仅作为其新陈代谢所必须的物质，也作为好氧反硝化过程中的电子受体，而实验室控制溶解氧的手段主要为改变培养时的转速。如图15所示，转速为130～210r/min时，对亚硝酸盐氮的去除和菌体浓度具有极显著影响（P＜0.01），而对总氮去除没有显著性差异（P＞0.05）。在转速为130～210r/min范围内，菌株HFQ-NAH生长均较好，对亚硝酸盐氮去除率均高于96%，对总氮去除率均超过80%。其中转速为190r/min时，总氮去除率最高为89.37%。因此确定最佳转速为190r/min。图15转速对菌株HFQ-NAH除氮特性的影响Fig.15EffectsofrotatingspeedonnitrogenremovalcharacteristicsofstrainHFQ-NAH3.6不同氮源对菌株除氮的影响（1）NH4+-N对菌株除氮的影响如图16所示，在以NH4Cl为唯一氮源时，初始NH4-N浓度为121.74mg/L，24h后降为15.00mg/L，氨氮的去除率达到87.68%，平均降解速率为4.45mg.(L.h)-1。总氮降解率为70.43%，而亚硝酸盐氮浓度达到15.30mg/L，存在一定积累，硝酸盐氮几乎检测不到积累。图16NH4+-N对除氮的影响Fig.16EffectsofNH4+-Nonnitrogenremoval（2）NO2--N对菌株除氮的影响如图17所示，在以NaNO2为唯一氮源时，24h后亚硝酸盐氮的去除率为99.10%，平均除氮速率为5.03mg.(L.h)-1，总氮降解率为79.46%，硝酸盐氮浓度达到19.00mg/L，存在少部分积累。图17NO2--N对菌株除氮的影响Fig.17EffectsofNO2--Nonnitrogenremoval（3）NO3--N对菌株除氮的影响如图18所示，在以NaNO3为唯一氮源时，24h后硝酸盐氮的去除率为74.50%，平均除氮速率为3.78mg.(L.h)-1，总氮降解率为69.61%，而亚硝酸盐氮几乎没有积累。图18NO3--N对菌株除氮的影响Fig.18EffectsofNO3--Nonnitrogenremoval（4）NH4+-N和NO2--N混合氮源对菌株除氮的影响如图19所示，在以NH4Cl和NaNO2为混合氮源的条件下，24h后氨氮去除率为96.67%，平均除氮速率为2.45mg.(L.h)-1；亚硝酸盐氮去除率为89.91%，平均除氮速率为2.28mg.(L.h)-1；总氮降解率为60.57%。而硝酸盐氮浓度达到16.30mg/L，存在较多积累。图19NH4+-N和NO2--N混合氮源对菌株除氮的影响Fig.19EffectsofNH4+-NandNO2--Nmixednitrogensourceonnitrogenremoval（5）NH4+-N和NO3--N混合氮源对菌株除氮的影响如图20所示，在以NH4Cl和NaNO3为混合氮源的条件下，24h后氨氮去除率为95.79%，平均除氮速率为2.43mg.(L.h)-1；硝酸盐氮去除率为74.04%，平均除氮速率为1.88mg.(L.h)-1；总氮降解率为67.04%，而亚硝酸盐氮几乎检测不到积累。图20NH4+-N和NO3--N混合氮源对菌株除氮的影响Fig.20EffectsofNH4+-NandNO3--Nmixednitrogensourceonnitrogenremoval从图16-图20可知，在单一氮源条件下，菌株HFQ-NAH除氮率及去除速率亚硝酸盐氮＞氨氮＞硝酸盐氮；而在混合氮源条件下，菌株硝化速率均大于反硝化速率。综上可以得出，菌株在不同氮源条件下均能良好生长，在以亚硝酸盐氮为唯一氮源的条件下除氮速率快，除氮率高，在其他各种氮源条件下除氮速率和除氮率均相差不大。此外，由图16-20可知，当以氨氮浓度较高时（121.74mgNH4+-N/L），存在一定亚硝酸盐氮积累，且硝酸盐氮几乎无积累；当环境中氨氮浓度较低时（60.87mgNH4+－N/L）存在一定硝酸盐氮积累，且亚硝酸盐氮几乎无积累。初步判断该菌株存在短程硝化反硝化过程。4讨论好氧反硝化细菌的反硝化作用受到诸如碳源种类、C/N、培养温度、培养基初始pH值、溶氧等因素的影响。PseudomonasstutzeriYG-24进行反硝化过程时，以蔗糖为唯一碳源时对亚硝氮的去除最佳[26]，PseudomonasputidaHJH1、KlebsiellaoxytocaHJH2[27]将甘油作为唯一碳源时，亚硝氮去除率最高；本研究菌株以柠檬酸钠为唯一碳源时亚硝氮去除率最佳。在一定C/N范围内，菌株的除氮率随C/N升高而上升。PseudomonaschengduensisADM2-2[17]从C/N为5-11时、PseudomonaschloritidismutansADM8-1[17]从C/N为5～13时，除氮率与C/N成正比，本试验菌株HFQ-NAH在C/N为2～18时研究结果相似。菌株HFQ-NAH在PH为7～9对亚硝酸盐氮的去除率均接近100%，对总氮的去除率均超过80%，这与PseudomonastolaasiiY11[28]一致。PseudomonastolaasiiY11[28]在温度为10～35℃时均能高效去除亚硝酸盐氮及总氮，且在15℃时最佳；菌株BacillussubtilisY7[22]在25～50℃条件下发酵培养对亚硝酸盐的降解率均接近100%，对温度有较宽的适应范围。本研究菌株在27～37℃条件下均有良好除氮效果，适应范围较前两者较窄。PseudomonastolaasiiY11[28]在50～200r/min的转速下，能很好地实现反硝化作用；Pseudomonasstutzeristrain[29]在转速为120～180r/min条件下，能有效除氮。本研究菌株在150～210r/min时除氮速率均佳。生物脱氮包括硝化和反硝化两个反应过程，第一步是由亚硝化菌将NH4+-N氧化为NO2－-N的亚硝化过程；第二步是由硝化菌将NO2－-N氧化为NO3－-N的过程；然后通过反硝化作用将NO3－-N经NO2－-N最终转化为N2，NO2－-N是硝化与反硝化过程的中间产物。1975年Voets等在处理高浓度氨氮废水的研究中，发现了硝化过程中NO2－-N积累的现象，首次提出了短程硝化反硝化脱氮的概念[30]。而在本实验中，当环境中氨氮浓度较高时（121.74mgNH4+－N/L），存在一定亚硝酸盐氮积累，且硝酸盐氮几乎无积累；当环境中氨氮浓度较低时（60.87mgNH4+－N/L），存在一定硝酸盐氮积累，且亚硝酸盐氮几乎无积累。这也印证了雷经纶[31]等的发现，即废水中NH3浓度较高，pH值偏于碱性时,易形成亚硝酸型硝化。在相反的条件下，则形成硝酸型硝化的倾向很大。5结论从养殖池塘底泥样品中筛选到1株高效好氧反硝化细菌，命名HFQ-NAH，通过初筛、复筛、形态学观察、生理生化实验以及16SrDNA测序结果分析，菌株HFQ-NAH为神户肠杆菌HFQ-NAH（EnterobacterkobeiHFQ-NAH）。通过碳源、C/N、温度、转速、pH等因素优化菌株HFQ-NAH的脱氮条件，得出该菌的最佳碳源为柠檬酸钠，C/N为18，温度为27℃，转速为190r/min，pH为7.0。在单一氮源条件下，菌株HFQ-NAH除氮率及去除速率亚硝酸盐氮＞氨氮＞硝酸盐氮；而在混合氮源条件下，菌株硝化速率均大于反硝化速率。当环境中氨氮浓度较低时（60.87mgNH4+－N/L），菌株易形成硝酸型硝化；而当环境中氨氮浓度较高时（121.74mgNH4+－N/L），菌株易形成亚硝酸型硝化，存在一定短程异养硝化-好氧反硝化过程。参考文献[1]李小义,孔杰,赵凤,等.养殖水体氮素污染及治理方法的研究进展[J].贵州畜牧兽医,2016,40(05):59-64.[2]朱云.草鱼池塘好氧反硝化细菌的筛选、鉴定及其脱氮性能的研究[D].上海海洋大学,2019.[3]戚晓舟.氨氮胁迫对鲫免疫系统及肠道菌群结构的影响[D].西北农林科技大学,2017.[4]葛红星,李健,陈萍,等.氨氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性[J].渔业科学进展,2014,35(06):76-82.[5]邱德全,周鲜娇,邱明生.氨氮胁迫下凡纳滨对虾抗病力和副溶血弧菌噬菌体防病效果研究[J].水生生物学报,2008，(04):455-461.[6]QiF,Guang-LaiZ,Jian-GuoW,etal.AcutetoxicityofammonianitrogentoRhodeussinensisanditseffectsontwometabolismenzymes[J].freshwaterfisheries,2018,48(01):91-96.[7]宫春光,张薇,张建业,等.亚硝酸盐氮急性胁迫对斑尾复鰕虎鱼组织结构的影响[J].河北渔业,2018，(8):11-13.[8]滕涛,习丙文,费茜旎,等.亚硝酸盐氮对团头鲂急性毒性及高铁血红蛋白的影响[J].水生态学杂志,2018,39(3):99-106.[9]肖威,单洪伟,马甡,李忠帅.亚硝态氮慢性胁迫对凡纳滨对虾体成分和糖代谢的影响[J/OL].渔业科学进展:1-9[2020-05-13]./10.19663/j.issn2095-9869.20191024001.[10]XiaoC,LiuZ,LiD,etal.Acutenitriteexposurealtersthemetabolismofthyroidhormonesingrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)[J].Chemosphere,2017,186(nov.):798-804.[11]刘亚琴.基于沸石吸附/再生的改良型A/O脱氮工艺研究[D].江苏大学,2018.[12]樊艳丽.钙离子对活性污泥系统脱氮效果及污泥特性的影响研究[D].兰州理工大学,2014.[13]魏巍,袁浩铭,刘洋,等.生物脱氮菌剂净化富营养化水源水研究[J].供水技术,2016,10(6):15-18.[14]田雅洁.水产硝化菌的优选及其净化水体有害氮素的效果分析[D]