单分子实时测序在地中海贫血精准防控中的临床应用专家共识(2025版)一

共识(2025版)地中海贫血(地贫)是一种高发的遗传性血红蛋白病，全球约有3.5亿人为地贫基因致病变异携带者，我国南方地区携带率高达10%~25%。通过血液学筛查、热点变异检测以及基于其他技术的罕见型地贫基因检测的"多层级序贯筛诊"模式在地贫防控中取得了显著的成效，但其流程冗繁、受检者及医疗成本高、咨询压力大，存在明显的局限性。单分子实时测序技术以其长读长和准确识别碱基序列的优点，不仅能够拓宽地贫基因变异检测的范围，还能够直接确定α-和β-珠蛋白基因的单体型和结构重排，显著提高检出率，降低误检和漏检率，对于改进地贫基因检测具有革命性意义。随着技术的成熟和成本的下降，单分子实时测序在地贫防控中的应用越来越广泛，目前已积累超过50项临床研究和30万例临床应用数据。本共识基于这些循证证据，通过探讨单分子实时测序在临床地贫基因检测中的应用范围、操作流程及局限性，为临床医师、实验室人员和政策制定者提供参考和指导，助力全生命周期的地贫精准防控。地中海贫血(thalassemia,以下简称地贫)是指由于珠蛋白基因变异引起的一种或多种珠蛋白肽链合成障碍导致的遗传性溶血性贫血，呈常染色体隐性遗传，是全球患病人数最多的单基因病之一。根据珠蛋白链的受损情况，地贫主要分为由α-珠蛋白基因簇中的HBA2基因(OMIM*141850)和/或HBA1基因(OMIM*1有关。α-地贫的临床表现随α-珠蛋白基因HbH)病和HbBart's水肿胎综合征。HbH病又称为中间型α-地贫，常在妊娠23~38周在宫内或分娩后半小时内死亡。β-地贫的临床型和重型。中间型β-地贫患儿通常在2岁之后发病，表现为中至重度的溶血性贫血，而重型β-地贫患儿通常在出生后3~6个月内发病，其生存依赖于输血治疗。当α基因重复(如α-三联体、α-四联更严重的贫血症状。根据《中国地中海贫血蓝皮书》,重型地贫患者可通过输血治疗或骨髓移植治疗，其年均医疗费用分别为10万元和40万元左右，不仅给罹患疾病家庭造成巨大的经济压力，也对社会我国长江以南为地贫高发区域，其中以广西、海南和广东最为严重，其地贫基因变异携带率分别高达25%、21%和19%。目前我国已在南方10个高发省份开展了政府指导下的地贫防控服务项目。然而，由于人口流动，我国北方及丝绸之路沿线的新疆、北京、河南等地也有地贫病例的报道。近期的一项研究表明，北京的贫血孕妇地贫变异携带率高达16%,且携带者中籍贯为北方地区的孕妇占比高达63%。由于北方地区临床尚未常规开展地贫基因筛查，部分地贫携带者可因滥用铁剂而导致氧化应激损伤、妊娠期糖尿病等并发症的风险。基于北方地区特定的血液病谱特征，针对贫血的孕妇及儿童，可考虑在启动补铁治疗前实施地贫基因筛查，以避免医源性铁过载的发生。当前地贫防控的策略是基于”多层级序贯筛诊"模式，即首先采取基于血液学表型的筛查技术，以全血细胞分析和血红蛋白电泳分析作为主要的筛查指标，之后采用跨越断裂点PCR(Gap-PCR)、PCR-反向点杂交法(PCR-reversedotblotting,PCR-RDB)、多重连接探针扩增(multipleligation-dependentprobeamplification,MLPA)、对血液学指标筛查阳性的样本进行检测以确定其基因型。尽管上述筛诊策略的实施已使地贫防控工作取得了显著成效，但由于珠蛋白基因具有重复性序列且变异类型复杂多样，运用该策略防控地贫流程冗繁，可因反复就诊造成受检者和医疗人工成本高、咨询压力大，血液学表型阴性的个体容易因表型阴性而漏掉后续的基因检测，包括"静止型aaaαanti3.7等)的携带者以及罕见的结构变异。因此，该策略具有了来自全国14个省市自治区51个单位、具有医学遗传学、临床遗传学、医学检验、儿科学等背景的专家，按照专业背景进行分组讨论和撰写工作。首先确定了需要解决的关键临床问题，包括地贫基因筛查、诊断以及遗传咨询中的常见问题等。为确保共识的科学性和实用性，专家推荐意见参考了国际实践指南报告规范(reportingitemsforpracticeguidelinesinhealthcare,RIGHT),同时进行了系统的循证医学证据检索，检索的数据库包括PubMed、WebofScience、EMbase、中国知网数据库、万方数据库、维普数据库等，检索词包括"地中海贫血""频率""携带率""突变谱""基因型""中国"等，检索年限为2000年至今。并通过德尔菲(Delphi)法进行了匿名投票和反馈，以确保各项推荐意见至少获得50%的赞同比例，且持反对意见者的比例低于20%。最终形成的推荐意见经过全体协作组成员的共同审议和确认。本共识旨在为临床医师、实验室人员和政策制定者提供规范化指导，助力地贫全生命周期的精准防控。【推荐意见1】单分子实时测序技术可用于地贫携带者筛查、产前诊断、新生儿筛查以及患者诊断，以满足临床对地贫基因进行快速、准确检测的需求。(投票专家54人，赞成54票、反对0票、弃权0票)(1)携带者筛查：对于血液学指标高风险(血常规检查显示小细胞低色素或血红蛋白电泳结果异常)的孕前或孕早期夫妇，在充分知情的前提下，可将单分子实时测序作为地贫基因检测方法的选项。对于地贫高发地区的孕前或孕早期夫妇，在充分知情的前提下，可将单分子实时测序作为一线的携带者筛查方法供其选择。(2)产前诊断：对具有重型地贫生育高风险、有介入性产前诊断需求的家庭，在充分知情的前提下，可将单分子实时测序作为产前诊(3)新生儿筛查：对于地贫高发地区的新生儿，在其父母充分知情的前提下，可将单分子实时测序作为地贫基因的检测方法供其选择。(4)患者诊断：对于血常规或血红蛋白电泳筛查结果为阳性的新生儿、儿童、成人或家庭成员，可将单分子实时测序作为一线的地贫基因检测方法供其选择。对于近期曾接受全血、白细胞成分输血或者造血干细胞移植的就诊者，直接检测外周血样可能会影响地贫基因检测结果的准确性。对于全血或白细胞成分输血者，建议采集其他组织细胞、如口腔黏膜脱落细胞等进行检测，或在4~6个月后采集外周血样送检。对接受过骨髓造血干细胞移植者，建议采集其他组织细胞、如口腔黏膜脱落细胞等进行检测，不建议通过外周血进行地贫基因检测。1.3检测变异范围【推荐意见2】单分子实时测序技术应明确检测中国人群α-和β-地贫致病性明确的热点变异(在对应类型总阳性位点中占比≥1%)和常见变异(在对应类型总阳性位点中占比<1%且≥0.1%)(表1)。(投票专家54人，赞成53票、反对1票、弃权0票)表1中国人群a-和β-珠蛋白基因的热点及常见变异俗名HGVS命名a-珠蛋白基因热点NC_000016.10:g.173384_177187del热点NC_000016.10:g.169818_174075del热点NC_000016.10:g.165401_184701delNC_000016.10:g.149863_183312del热点热点热点a热点NC_000016.10:g.173384-177187热点NC_000016.10:g.169818_174075dup热点NC_000011.10:g.5169918_5248821dβ缺失NC_000011.10:g.5201647_5229059dβ缺失热点热点热点热点β珠蛋白基因热点热点HBB:c.130G>T【推荐意见3】单分子实时测序技术建议检测中国人群α-和β-珠蛋白基因致病性明确的罕见变异(在对应类型总阳性位点中占比<0.1%)。(投票专家54人，赞成54票、反对0票、弃权0票)导致血液学表型异常的变异。(投票专家54人，赞成53票、反对0票、弃权1票)家54人，赞成52票、反对0票、弃权2票)中国人群α-和β-珠蛋白基因的热点变异和常见变异如表1所示。α-珠蛋白基因的10个热点变异和常见变异的检出数约占α-珠蛋白基因总阳性位点检出数的95%,β-珠蛋白基因的14个热点变异和常见变异检出数约占β-珠蛋白基因总阳性位点检出数的98%。检出数的5%和2%。由于地贫高发地区基因变异的整体携带率高，检测罕见变异类型也具有重要的价值。临床发现的部分罕见变异如表2点中占比<0.01%)。表2中国人群a-和β珠蛋白基因的部分罕见变异俗名NC_000016.10:g.148216_175855delNC_000016.10:g.175996_178389delNC_000016.10:g.171882_175438del_14.6NC_000016.10:g.144215_188841del_FIL.NC_000016.10:g.151641_182316del_27.3NC_000016.10;g.158664_185974delNC_000016.10:g.153510_175436delinsGGGAAGGGTGGG0HBA2:c.1A>GaHBA2:c.178G>CHBA2:c.184A>THBA2:c.272_279delAGCTaNC_000016.10:g.173384-177187dupNC_000016.10:g.169818_174075dup[3]NC_000011.10:g.5226263_5227619dβ缺失NC_000011.10:g.5224302_5227791dβ缺失NC_000011.10:g.5112882_5231358dβ缺失NC_000011.10:g.5182845_5249973dβ缺失NC_000011.10:g.5226187_5231089dβ缺失ββββ珠蛋白基因HBB:c.113G>AβββHBB:c.114G>Aβ(3)δ-珠蛋白基因的相关变异δ一珠蛋白基因的变异通常不会导致小细胞低色素的表型，但会降低HbA2的表达。当合并β-地贫时，δ-地贫可能会掩盖β-地贫引起的HbA2升高，从而导致漏检，因此检测δ-珠蛋白基因的变异也具有重要的临床意义。中国人群δ-珠蛋白基因的热点变异包括CD116(CGC>TGC)(HBD:c.349C>T);常见变异包括-68(C>T)(HBD:IVS-II-897(A>C)(HBD:c.316-2A>C);罕见变异包括二、检测前咨询与知情同意在采用单分子实时测序技术进行地贫基因检测之前，应为就诊者或其家属提供详细的遗传咨询，了解其家族史、患病史及检测的目的，告知检测的必要性、流程、可能的结果及意义，包括检测的适用范围、目标疾病、检测方法、费用、检测周期、局限性及相关风险等。应告知检测后可能需要的进一步检查和随访，以及可能影响检测结果的因素，如样本采集和处理过程中的注意事项等，其要点包括：(1)应充分了解就诊者或夫妇双方的籍贯、既往史、孕产史、家族史、可疑的地贫临床指征和实验室检查结果等信息，以准确判断其是否属于适用人群；(2)应向就诊者及其亲属详细说明检测的意义、适用人群、检测范围、检测方法与流程、费用、准确性、局限性、检测周期、相关风险等信息，并告知检测后遗传咨询与后续可提供的干预方案，如胚胎植入前遗传学检测、产前诊断等。在产前诊断时，应强调排除母源污染以及阳性结果需通过两种检测方法确认的重要性，并提醒即使检测结果无明显异常，仍无法完全排除胎儿患地贫之外的其他疾病的可能性，孕妇需定期接受常规的产前检查，完成对于其他疾病的系统性筛查，确保实现对胎儿健康状况的全面评估；(3)应向患者强调可能检出无症状携带者。这类个体虽无罹患地贫的风险，但其后代可能携带地贫基因变异，应告知其接受遗传咨询(4)应向孕妇及其亲属说明可能影响检测结果的因素；(5)应告知孕妇医疗机构或检测机构将对其妊娠结局进行随访；(6)应向就诊者承诺检测数据将仅用于医学目的，并严格保护个人隐私，避免基因歧视；【推荐意见6】单分子实时测序技术在临床地贫检测中应遵循标反对0票、弃权0票)【推荐意见7】单分子实时测序检测到的地贫变异解读建议参考指南》、《β-地中海贫血的临床实践指南》等国际权威公共数据库专家54人，赞成54票、反对0票、弃权0票)【推荐意见8】当出现不同数据库对地贫基因变异致病性评级不变异的致病性。(投票专家54人，赞成54票、反对0票、弃权0票)本类型的温控条件进行包装和运输(表3),以确保样本的质量。EDTA抗凝管，1～2mL,充分颠倒混匀不超过72h放置于4℃~8℃暂存，长期保存需-20℃冻存直径超过8mm×3mm的0℃以下保存不超过72h不超过72hEDTA抗凝管，1～2mL,充分颠倒混匀不超过72h新采集的脐带血样本可直接寄出或放置于4℃~8℃暂存，长期保存需-20℃冻存DNA在24h内检