淀粉对盐酸小檗碱平衡溶解度的影响

目录TOC\o"1-2"\n\h\z\u1前言 前言盐酸小檗碱（BerbenineHydrochloride，BH）又称黄连素，是从毛茛科植物黄连Coptischinensis、三角叶黄连C.deltoidea、或云连C.teeta的干燥根茎提取的一种异喹啉类生物碱，其分子式为[C20H18NO4]+，包括抗炎、抗癌、抑菌、降脂、降糖等。实验研究及临床报道发现黄连素对神经系统、内分泌系统、消化系统、循环系统、呼吸系统等多个系统的疾病均具有治疗作用[1]。目前，黄连为中药常用药，常与其他药物配伍使用。中药复方汤剂在煎煮过程中，各药味的成分相互影响，产生助溶或沉淀等现象，使中药复方汤剂中有效成分的提取率产生变化，直接影响中药复方汤剂在临床上的疗效。实践中可考虑根据不同的目的对样品进行适宜的处理后再进行提取分离，如可先对某药进行单独提取再混合等方法，以期提高某成分的提出率。中药复方的组成成分十分复杂，影响各有效成分含量的因素较多，如要对影响某一成分的因素进行合理的说明，还需要在中医药理论的指导下，做更深入的实验来考察，才能得出比较明确的结论[2]。因此，研究中药复方汤剂有效成分含量的变化，是中药复方研究的一个重要内容。前人对黄连配伍应用亦多有研究，但仅从配伍体外化学成分变化和药效学实验仍难以全面了解该配伍的作用规律和机理。黄连常用复方，如葛根芩连汤，葛根中还含有大量淀粉，而鲜有人在此方面有所研究。因此，本实验主要研究黄连配伍之后，淀粉对其有效成分含量的影响。溶解度是指在一定温度下，在一定量溶剂中达饱和时溶解的最大药量，是反映药物溶解性的重要指标[3]，也是药物的重要物理参数之一，与制剂、剂型的选择以及处方、工艺、质量控制等具有密切的相关性。实际工作中多以药物在实际环境条件下的平衡溶解度来表示。测定平衡溶解度的常用方法是配制药物饱和溶液，置恒温条件下振荡至平衡，经滤膜过滤，取滤液分析，测定药物在溶液中的实际浓度[4]。通过测定药物的平衡溶解度，可以全面了解到黄连的配伍是否符合中药复方配伍应用的条件。本研究主要采用摇瓶-紫外分光光度法来测定药用淀粉对黄连平衡溶解度的影响，黄连的主要有效成分是盐酸小檗碱，故盐酸小檗碱为主要研究对象。测定药用淀粉对盐酸小檗碱平衡溶解度的影响对研究葛根和黄连的配伍应用及指导临床用药有着重要的意义，且为开发研制新剂型提供处方前研究基础。2材料与仪器2.1材料盐酸小檗碱对照品（中国药品生物检定所，批号：110713-200910，纯度97.9%）；盐酸小檗碱（西安小草植物科技有限责任公司，批号：xc090825，纯度97%）；药用淀粉（济宁市六佳药用辅料有限公司，批号：0140310）；磷酸二氢钾（国药集团化学试剂有限公司，批号：20160279，纯度97%）；氢氧化钠（天津市大茂化学试剂厂，批号：20161109，纯度99%）；盐酸（分析纯AR，广州市东红化工厂，批号：2015041314）；2.2仪器FA2004B电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；CPA225D型电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；雷磁PHS-25PH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；KQ5200型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；TopPette手动移液枪（大龙兴创实验仪器有限公司）；HH4数显恒温水浴锅（金坛市富华仪器有限公司）；SHA-B水浴恒温振荡器（上海浦东物理光学仪器厂）；UV1102紫外-可见分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）。3方法与结果3.1测定波长的选择精密称取经干燥器干燥至恒重的盐酸小檗碱对照品10mg数份，分别置50ml容量瓶中，分别加入pH1.2盐酸溶液、pH6.8磷酸盐缓冲液、纯水适量，使溶解并定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，吸取1ml置于50ml容量瓶中，用相应的溶剂定容，制成浓度为4μg/ml的盐酸小檗碱溶液，以相应溶剂为空白，于200～500nm进行波长扫描。选择344nm作为盐酸小檗碱的测定检测波长。如图1所示图1盐酸小檗碱的全波长扫描3.2盐酸小檗碱在不同pH中达到溶解平衡时间的测定精密称取盐酸小檗碱0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入不同pH溶液30ml配成盐酸小檗碱饱和溶液（各平行配置三份），超声5min，在37℃下振荡，分别于0、1、2、4、8、20、24、26、27h吸取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤，弃去初滤液，用相应溶剂定容，分别在同一稀释倍数下于344nm下测定吸光度，绘制其吸光度（A）—时间（t）曲线，确定溶解平衡时间点。同法制备未超声组做比较，结果见表1。结果表明，超声组比未超声组在27h内溶解度大，故选择超声组；不同pH中的盐酸小檗碱在27h均未达到平衡，且考虑药物在人体内的代谢，选择4h为盐酸小檗碱的平衡时间点，其对应的溶解度为平衡溶解度。表1盐酸小檗碱在不同pH中平衡时间的测定纯水（超声）纯水（未超声）pH6.8（超声）pH6.8（未超声）pH1.2（超声）pH1.2（未超声）0h0.2720.1750.2970.2040.1950.2851h0.5660.3630.4730.4270.3450.3882h0.5040.3720.4430.450.3670.3784h0.4520.3840.4350.4280.3350.3148h0.4960.3780.4740.4980.3150.34820h0.4140.4820.4680.430.3050.34224h0.4780.4290.4730.4830.340.32826h0.4860.4390.4380.4810.3040.33927h0.450.4250.4220.4730.3180.3193.3方法学考察3.3.1盐酸小檗碱的标准曲线精密称取盐酸小檗碱对照品10mg，置50ml容量瓶中，然后用纯水溶解并定容，超声5min，得到浓度为0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液。分别过0.45μm微孔滤膜，然后用移液管精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、1.0ml置10ml容量瓶中，用纯水定容至刻度，得质量浓度为2、4、8、12、20μg/ml的盐酸小檗碱标准溶液。同法分别以pH1.2盐酸溶液、pH6.8磷酸缓冲盐液为溶剂，制备相应的标准溶液，在344nm处测吸光度。以盐酸小檗碱的质量浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标进行线性回归。见图2、3、4。按上述方法分别得出回归方程：纯水中A=0.0716C-0.0154，R2=0.9999；pH6.8磷酸缓冲盐溶液中A=0.0684C+0.0013，r=0.9999；pH1.2盐酸溶液中A=0.0604C-0.0155，r=0.9998结果见表2。结果表明盐酸小檗碱在2~20μg/ml范围内线性关系良好。表2盐酸小檗碱在纯水、pH6.8、pH1.2中的标准曲线浓度（μg/ml）纯水pH6.8pH1.220.1290.1380.10940.2680.2700.22780.5650.5490.468120.8360.8300.698201.4191.3641.198图2盐酸小檗碱纯水标准曲线图3盐酸小檗碱pH6.8标准曲线图4盐酸小檗碱pH1.2标准曲线3.3.2稳定性试验精密称取盐酸小檗碱对照品5mg，置25ml容量瓶中，分别用纯水、pH6.8磷酸缓冲盐溶液、pH1.2盐酸溶液溶解并定容，得到浓度为0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液，超声5min，过0.45μm微孔滤膜，分别精密量取1.5、2、2ml上述溶液于50ml容量瓶中，用相应溶剂定容，得到质量浓度为6、8、18μg/ml的盐酸小檗碱溶液，置37±5℃恒温水浴中保温5h，分别于0、1、2、3、4、5h取样，在相同条件下，测定其吸光度。以同法测计算三者平均吸光度值、RSD。结果见表2。结果表明：盐酸小檗碱在纯水中的平均吸光度值为0.431，其RSD为1.6%；在pH6.8的磷酸缓冲盐溶液的平均吸光度值为0.533，其RSD为1.2%；在pH1.2盐酸溶液中的平均吸光度值为0.463，其RSD值为1.6%。RSD值均小于2%，在测定时间内盐酸小檗碱在不同pH稳定性良好。表3盐酸小檗碱在不同pH中的稳定性0h1h2h3h4h5h平均值RSD%纯水0.4360.4250.4320.4210.4380.4350.4311.6Ph6.80.5380.5290.5400.5260.5380.5280.5331.2pH1.20.4580.4570.4720.4620.4720.4560.4631.63.3.3精密度试验精密称取盐酸小檗碱对照品5mg，置25ml容量瓶中，分别用纯水、pH6.8磷酸缓冲盐溶液、pH1.2盐酸溶液溶解并定容，得到浓度为0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液，超声5min，过0.45μm微孔滤膜，分别精密量取1.5、2、2ml上述溶液于50ml容量瓶中，用相应溶剂定容，得到质量浓度为6、8、18μg/ml的盐酸小檗碱溶液，分别测6次吸光度，计算平均吸光度值、RSD。结果表明：盐酸小檗碱在纯水中的吸光度RSD为0.52%，在pH6.8磷酸缓冲盐溶液中的吸光度RSD为0.3%，在pH1.2盐酸溶液中的吸光度RSD为0.15%，RSD<2%，精密度良好。表4葛根素和盐酸小檗碱的精密度123456平均值RSD%纯水0.3950.3950.3990.3940.3930.3950.3950.52pH6.80.5540.5530.5560.5540.5570.5530.5550.3pH1.20.4950.4960.4960.4970.4970.4960.4960.153.3.4准确度试验取盐酸小檗碱对照品5mg，置25ml容量瓶中，然后用纯水溶解并定容，得到浓度为0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液，精密量取上述溶液0.5、1.5、4.5ml于10ml的容量瓶中，用纯水定容（各平行配置三份），得到浓度为2μg/ml、6μg/ml、18μg/ml的标准溶液；同法称取5mg盐酸小檗碱，用pH6.8磷酸缓冲盐溶液定容，得0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液，精密量取0.5、2、4ml稀释数倍（各平行配置三份），得到浓度为2μg/ml、8μg/ml、16μg/ml的标准溶液；同法称取5mg盐酸小檗碱，用pH1.2盐酸溶液定容，得0.2mg/ml的盐酸小檗碱溶液，精密量取0.5、2、5ml稀释数倍（各平行配置三份），得到浓度为2μg/ml、8μg/ml、20μg/ml的标准溶液；在相同条件下进行准确度试验。计算回收率、RSD，结果见表4。结果表明：盐酸小檗碱在不同pH中低、中、高三个浓度的回收率在90%-115%之间，RSD均﹤3%，符合方法学考察要求。表5盐酸小檗碱在不同环境中的回收率样品吸光度理论浓度（μg/ml）实际浓度（μg/ml）回收率%平均值RSD%0.1251.98990.12621.9999.599.1670.290.1251.98990.4356.3105纯水0.43666.32105.33105.220.180.4366.32105.331.26817.999.441.2701817.9399.6199.6070.171.27217.9699.770.1341.9597.440.13221.9295.9896.4670.870.1321.9295.980.5387.8698.19Ph6.80.53687.8397.8397.580.790.5307.7396.721.11616.33102.091.1171616.35102.18100.9632.001.08015.7798.620.0951.8391.50.09721.8693.1392.8771.40.0981.88940.4958.45105.65pH1.20.49788.49106.06105.510.60.4998.39104.821.15219.3396.551.1482019.2696.3296.3470.31.14519.2196.073.4不同pH中盐酸小檗碱平衡溶解度的测定3.4.1酸性环境溶液的配制盐酸溶液（pH1.2）：取分析纯浓盐酸9ml，加水定容至1000ml，即得。磷酸缓冲盐溶液（pH6.8）：取0.2mol/L磷酸二氢钾溶液250ml，加0.2mol/L氢氧化钠溶液118ml，用水稀释至1000ml，摇匀，即得。3.4.2盐酸小檗碱在不同pH中平衡溶解度的测定精密称取盐酸小檗碱0.1g，置50ml具塞锥形瓶中，分别加入不同pH溶液30ml配成盐酸小檗碱饱和溶液（各平行配置三份），超声5min，在37℃下振荡4h，吸取上清液，经0.45um微孔滤膜过滤，用相应溶剂稀释至适当倍数得储备液。按照紫外分光光度法，以相应溶剂为对照溶液，在344nm处测定各pH下盐酸小檗碱的吸光度，并根据标准曲线计算其平衡溶解度、RSD。在不同的pH下，盐酸小檗碱的平衡溶解度数据见表6。表6盐酸小檗碱在纯水、pH1.2、pH6.8中的平衡溶解度（37℃）吸光度溶解度（mg/ml）0.454纯水0.4563.241±0.0510.4360.434pH6.80.4363.207±0.0730.4500.335pH1.20.3370.291±0.0010.3363.5盐酸小檗碱在淀粉溶液中平衡溶解度的测定3.5.1盐酸小檗碱在不同比例淀粉溶液中平衡溶解度的测定精密称取0.0030g、0.0050g、0.0070g、0.0090g、0.0100g药用淀粉于50ml锥形瓶中，分别加入90~100℃纯水30ml溶解，冷却至室温，分别加入0.1g盐酸小檗碱，超声5min，在37℃下振摇4h（五个比例各平行配置三份）。取上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液用纯水稀释至适当倍数得储备液。按照紫外分光光度法，以相应溶剂为对照溶液，在344nm处测定盐酸小檗碱的吸光度，并根据标准曲线计算其平衡溶解度、RSD。在纯水条件下，盐酸小檗碱的平衡溶解度数据见表7。结果表明：从图7中可以得到，不同比例的淀粉对于盐酸小檗碱的平衡溶解度并无规律，但在纯水条件下，与未加淀粉的盐酸小檗碱平衡溶解度3.241±0.051（mg/ml）相比，其溶解度下降且经过单因素考察：P纯水（0.013）<0.05。即在纯水中，加入淀粉后会降低盐酸小檗碱的平衡溶解度。表7盐酸小檗碱在不同比例淀粉中的平衡溶解度（37℃）淀粉加入量（g）吸光度溶解度（mg/ml）0.3730.00300.3752.726±0.0140.3770.3560.00500.4132.85±0.1420.4090.4080.00700.3982.962±0.0790.4200.3800.00900.3802.768±0.0140.3830.3750.01000.3532.761±0.2230.412图6盐酸小檗碱在不同比例淀粉中平衡溶解度的测定3.5.2盐酸小檗碱在pH6.8淀粉溶液中平衡溶解度的测定精密称取0.0070g药用淀粉于50ml锥形瓶中，加入90~100℃纯水30ml溶解，冷却至室温，用磷酸二氢钾和氢氧化钠调至pH为6.8，然后加入0.1g盐酸小檗碱，超声5min，在37℃下振摇4h（平行配置三份）。取上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液用pH6.8磷酸缓冲盐溶液稀释至适当倍数得储备液。按照紫外分光光度法，以pH6.8磷酸缓冲盐溶液为对照溶液，在344nm处测定盐酸小檗碱的吸光度，并根据标准曲线计算其平衡溶解度、RSD。在pH6.8下，盐酸小檗碱的平衡溶解度数据见表8。结果表明：在pH6.8条件下，与未加淀粉的盐酸小檗碱平衡溶解度3.207±0.073（mg/ml）相比，其溶解度增加，但经过单因素考察：PpH6.8（0.584）>0.05。即在pH6.8磷酸缓冲盐溶液中，加入淀粉后对盐酸小檗碱的平衡溶解度无明显影响。表8盐酸小檗碱在pH6.8淀粉溶液中平衡溶解度的测定（37℃）吸光度溶解度（mg/ml）0.4560.4483.247±0.0830.4363.5.3盐酸小檗碱在pH1.2淀粉溶液中平衡溶解度的测定精密称取0.0070g药用淀粉于50ml锥形瓶中，加入90~100℃纯水30ml溶解，冷却至室温，用盐酸调至pH为1.2，然后加入0.1g盐酸小檗碱，超声5min，在37℃下振摇4h（平行配置三份）。取上清液，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取滤液用pH1.2盐酸溶液稀释数倍至适当倍数得储备液。按照紫外分光光度法，以pH1.2盐酸溶液为对照溶液，在344nm处测定盐酸小檗碱的吸光度，并根据标准曲线计算其平衡溶解度、RSD。在pH1.2条件下，盐酸小檗碱的平衡溶解度数据见表9。结果表明：在pH1.2条件下，与未加淀粉的盐酸小檗碱平衡溶解度0.291±0.001（mg/ml）相比，其溶解度增加且经过单因素考察：PpH1.2（0.001）<0.05。即在pH1.2磷酸缓冲盐溶液中，加入淀粉后会增加盐酸小檗碱的平衡溶解度。表9盐酸小檗碱在pH1.2淀粉溶液中平衡溶解度的测定（37℃）吸光度溶解度（mg/ml）0.7610.7750.683±0.0670.8904讨论药物吸收的前提是在吸收部位呈溶解状态，故水溶性是吸收的先决条件。若溶解速度大于吸收速度，则吸收过程与剂型关系较小。若溶解速度小于吸收速度，溶解则成为吸收过程的限速步骤[5]。所以盐酸小檗碱的低溶解度是限制制剂吸收的主要因素。目前，临床应用中小檗碱以口服给药为主，给药后小檗碱的吸收程度是其能否发挥疗效的前提。药物吸收的前提是在吸收部位呈溶解状态，故水溶性是吸收的先决条件。若溶解速度大于吸收速度，则吸收过程与剂型关系较小。若溶解速度小于吸收速度，溶解则成为吸收过程的限速步骤[6]。在选定盐酸小檗碱的测定波长时，其全波长扫描图中344nm处并不是最大吸收波长，而是在262nm和227nm处，但考虑在344nm波长下，实验中的试剂以及淀粉中杂质的干扰，所以选定344nm为本实验的测定波长。在确定盐酸小檗碱溶解平衡时间点时，考虑到口服盐酸小檗碱在人体内的平均滞留时间（MRT）为32.63±6.15小时，累积尿药排泄量为27.49±4.74μg，仅为给药剂量的0.014%[7]；且盐酸小檗碱在大鼠体内的血药浓度出现2个峰值，达峰时间分别2、5h，其中血药浓度分别为Cmax3.7、2.8mg·L-1；加之盐酸小檗碱在大鼠血液中可以转化为药根碱[8]；所以在27h内测定盐酸小檗碱的溶解平衡时间点，并最后选择了4h为其溶解平衡时间点。在这个过程中，还采用了另种不同操作方法（超声与不超声），结果表明在27h内超声有利于盐酸小檗碱的溶出。这一结果与文献[9]报道的与常规浸泡法相比，超声提取具有省时，提出率高等优点基本相符。盐酸小檗碱在纯水条件下与不同比例药用淀粉反应，其溶解度并未随着淀粉的增加而出现规律性的增大或减少，而是波动性变化。分析原因可能是：药用淀粉系自禾本植物玉蜀黍ZeamaysL的颖果或大戟木薯ManihotutilissimaPohl的块根中制得的多糖类颗粒，且随着超声波时间延长，淀粉水解率逐渐增加，支链淀粉分子量显著降低，直链淀粉含量升高，形成新的直链淀粉脂质复合物[10]。直链淀粉脂质复合物再与盐酸小檗碱发生反应，这一过程十分复杂，具体反应过程有待进一步的研究证实。另外，由实验结果可知在纯水条件下，加入淀粉后减少盐酸小檗碱的平衡溶解度，则理论上加淀粉组与未加淀粉组相比，沉淀会更多。但在本实验中，加淀粉组的沉淀少于未加淀粉组，通过实验观察以及对加淀粉组进行全波长扫描，发现加淀粉组除所有吸光度值小于未加淀粉组，其他与淀粉组无异，分析其原因有可能是：在滤过时，有些沉淀存留于滤膜上，从而使得加淀粉组不仅溶解度减少，而且沉淀也减少；另一种猜想是盐酸小檗碱与药用淀粉发生复杂的反应，作用机理目前不清楚，还有待进一步研究。实验结果可知，在未加淀粉组内，盐酸小檗碱的平衡溶解度随着pH的增大而增大，因小檗碱在不同pH条件下，以不同的形式存在，在酸性溶液中，盐酸小檗碱失去电子以盐的形式存在，由于其特殊物理性质，虽然化学结构稳定，但其溶解度降低。随着溶液pH增大，盐酸小檗碱逐渐以盐的形式向氮杂缩醛形式转变[11]，稳定性逐渐降低，但溶解度大大提高。在加淀粉组内，相比于对应介质溶液中：纯水条件下因为淀粉加入而溶解度有所减小；在pH6.8的介质溶液中，淀粉的加入对盐酸小檗碱的平衡溶