高三一轮学案生物（人教版）第十单元专题突破10综合PCR的基因工程问题

专题突破10综合PCR的基因工程问题课标要求阐明PCR的原理、反应条件、反应过程；用PCR扩增DNA片段并完成电泳鉴定。考情分析引物的选择和设计、PCR扩增结果的电泳鉴定与分析、PCR的应用2024·湖南·T·山东·T32024·黑吉辽·T72023·江苏·T·辽宁·T·江苏·T24类型一PCR引物碱基序列的设计1．土壤盐渍化影响水稻生长发育。将水稻耐盐碱基因OsMYB56导入不耐盐碱水稻品种吉粳88中，培育耐盐碱水稻新品种，过程①PCR扩增OsMYB56需要添加引物，应选用的引物组合为()A．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TCTGTTGAAT－3′B．5′－CTTGGATGAT－3′和5′－TAAGTTGTCT－3′C．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－ATCATCCAAG－3′D．5′－ATTCAACAGA－3′和5′－GAACCTACTA－3′2．(2021·湖北，16)某实验利用PCR技术获取目的基因，实验结果显示除目的基因条带(引物与模板完全配对)外，还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应非特异条带的产生，以下措施中有效的是()A．增加模板DNA的量B．延长热变性的时间C．延长延伸的时间D．提高复性的温度3．以下两组引物设计的均不合理的原因是___________________________________________________________________________________________________________________________。引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。引物设计的优劣对PCR反应的效率和特异性影响很大，引物设计的原则主要包括：(1)引物长度一般为20～30bp，可定位目的基因并为子链的延伸提供3′端。(2)引物中CG含量要适宜，CG含量越高，复性(退火)温度越高，产物特异性越高。(3)引物自身、引物之间不能有连续4个碱基互补，否则引物会折叠成发夹结构或二聚体，影响引物与模板的复性结合。(4)引物的5′端可以修饰(添加酶切位点、引入突变序列)，但3′端不可修饰(与模板DNA配对)。类型二利用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物4．(2024·黑吉辽，7)关于采用琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物的实验，下列叙述正确的是()A．琼脂糖凝胶浓度的选择需考虑待分离DNA片段的大小B．凝胶载样缓冲液中指示剂的作用是指示DNA分子的具体位置C．在同一电场作用下，DNA片段越长，向负极迁移速率越快D．琼脂糖凝胶中的DNA分子可在紫光灯下被检测出来1．DNA电泳鉴定中的“两液两剂”两液：电泳缓冲液与凝胶载样缓冲液。电泳缓冲液能维持整个电泳体系的pH稳定，提供导电介质；凝胶载样缓冲液可影响物质的电泳迁移速率，主要用于样品的稀释和保护，同时通过指示剂指示样品在凝胶中的位置。两剂：核酸染料与指示剂。核酸染料是用来染色DNA或RNA分子的一种化学物质，以便在紫外灯下观察和检测核酸条带，最常用的核酸染料是溴化乙锭。最常用的指示剂是溴酚蓝，它在电泳凝胶中的迁移速度与DNA或RNA分子的迁移速度相近。在电泳过程中，溴酚蓝通常位于样品的前沿，形成一个明显的蓝色条带，这有助于实验者判断电泳是否完成，以及何时停止电泳。2．DNA迁移速率的影响因素(1)凝胶浓度：凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，DNA迁移受到的阻力越大，速率越慢。(2)DNA分子的大小：DNA的分子量越大，迁移速率越慢。(3)DNA分子的构象：三种构象的质粒在琼脂糖凝胶电泳的前后顺序为环形超螺旋(DNA两条链都是完整的质粒)>线形>开环(DNA双链断了一条成为松弛的环)。类型三利用PCR技术鉴定目的基因的连接方式——正向连接和反向连接5．(2019·江苏，33节选)为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是______。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是________________。类型四利用PCR技术引导基因定点突变及融合基因的重组构建——重叠延伸PCR6．水蛭素是一种蛋白质，可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变，使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG)，从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图。注：图中的引物2和3的突起处代表与模板链不能互补的突变位点。(1)由以上事例可知，要对蛋白质的结构进行改造，需要通过________________来完成。(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为______________才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为______________(假设引物为单链DNA)。(3)在第一阶段获得2种具有重叠片段DNA的过程中，引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制，共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中，这是因为_____________________________________________________________________________________________________。(4)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起，设计基因M的引物M1、M2，基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时，特别要注意的问题是___________________________________________________________________________________________________________________。重叠延伸PCR技术：采用具有互补配对片段的引物，分别进行PCR，获得有重叠链的两种DNA片段，再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因或将不同来源的任意DNA片段连接起来。类型五利用PCR技术扩增未知基因序列——反向PCR7．(2020·江苏，33节选)如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图(以EcoRⅠ酶切为例)：请据图回答问题：(1)步骤Ⅰ用的EcoRⅠ是一种______________酶，它通过识别特定的________________切割特定位点。(2)步骤Ⅱ用的DNA连接酶催化相邻核苷酸之间的3′－羟基与5′－磷酸间形成________________；PCR循环中，升温到95℃是为了获得____________；TaqDNA聚合酶的作用是催化_______________________________________________________________。(3)若如表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′－AACTATGCGCTCATGA－3′②5′－GCAATGCGTAGCCTCT－3′③5′－AGAGGCTACGCATTGC－3′④5′－TCATGAGCGCATAGTT－3′反向PCR是反向互补引物来扩增两引物以外的未知序列的片段。利用在已知序列内部没有切点的限制性内切酶对此段DNA进行酶切，在DNA连接酶作用下自连形成环状DNA分子，然后利用方向合适并与已知序列两端互补的引物，以连接成环的DNA为模板，经PCR扩增，得到已知序列的旁侧DNA片段。类型六利用PCR技术快速检测病原体——荧光定量PCR8．猴痘是由猴痘病毒(一种RNA病毒)感染所致的一种病毒性人畜共患病，临床上表现为发热、皮疹、淋巴结肿大等。猴痘病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光PCR鉴定。(1)首先，从样本中提取病毒RNA，经________酶作用生成cDNA；然后以cDNA为模板进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。(2)通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针(一小段单链DNA，可与目的基因中部分序列特异性结合)。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到(如图1)。①当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因复性时，通过________________原则而特异性结合。②在PCR循环的延伸阶段，TaqDNA聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强度与反应体系中DNA分子数呈__________(填“正相关”或“负相关”)。(3)通过实时荧光PCR检测猴痘病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图2所示。①与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因可能有____________________________________________________________________________________。②Ct值的含义：在PCR扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct值就____________。③某新猴痘病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37判定为阳性，Ct>40或无Ct值判定为阴性。图2所示猴痘病毒核酸检测结果应判定为____________。(4)阴性结果也不能排除猴痘病毒感染，可能产生假阴性的因素有____________(多选)。a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光PCR检测阈值b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解c．病毒发生变异荧光定量PCR通过在反应体系中加入能够指示反应进程的荧光探针，当耐高温的DNA聚合酶催化子链延伸至探针处会水解探针，使荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一次，就有一个荧光分子生成，通过荧光信号的积累来监测扩增产物的积累。Ct值是荧光信号达到荧光阈值时PCR循环数，模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在一定线性关系，起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。答案精析1．A[图中所示碱基序列磷酸端为5′端，羟基端为3′端，在进行PCR操作时，引物应分别与基因两条链的3′端结合，根据图中两端的碱基序列，通常选择5′－CTTGGATGAT－3′(上面链的引物)和5′－TCTGTTGAAT－3′(下面链的引物)作为引物对，A符合题意。]2．D[增加模板DNA的量可以提高反应速度，但不能有效减少反应非特异条带的产生，A不符合题意；延长热变性的时间不影响引物和模板配对，故不能有效减少反应非特异条带的产生，B不符合题意；一般根据待扩增片段的长度适当延长延伸的时间，但延伸时间过长可能会出现非特异性扩增，C不符合题意；复性温度过低会造成引物与模板的结合位点增加，故可通过提高复性的温度来减少反应非特异条带的产生，D符合题意。]3．引物Ⅰ和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效，引物Ⅰ′自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效4．A[在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关，需根据待分离DNA片段的大小配制琼脂糖溶液，故琼脂糖凝胶浓度的选择需要考虑待分离DNA片段的大小，A正确；凝胶载样缓冲液指示剂通常是一种颜色较深的染料，可以作为电泳进度的指示分子，B错误；DNA片段的迁移速率与其大小成反比，且DNA在电场中从负极向正极移动，C错误；琼脂糖凝胶中的DNA分子可在波长为300nm的紫外灯(不是紫光灯)下被检测，并且需染色，D错误。]5．乙、丙目的基因反向连接解析分析题图可知，理论上可以选择的引物组合有甲和丙、乙和丙两种情况。如果选择甲和丙这对引物，则无论目的基因是否正确插入，扩增的片段都是50＋300＋100＝450(bp)，不符合要求；如果选择乙和丙这对引物，正向连接和反向连接后所得结果不同，所以应选择乙和丙这对引物进行PCR鉴定。如果目的基因和质粒反向连接，则引物乙会出现在重组质粒的外侧，此时若加入引物甲和乙，则可以扩增出300＋100＝400(bp)的片段。6．(1)改造基因(或基因定点突变)(2)T－A或C－GA或G(3)3引物2和3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时会结合而失去作用(4)M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段解析(2)若拟突变位点的碱基对为A－T，则需要让其突变为T－A或C－G，对应的密码子由AAU变成AAA或由AAC变成AAG，可使天冬酰胺替换为赖氨酸。(3)若两个反应系统均进行一次复制，则会产生3种不同的DNA分子，因为引物1和4产生的DNA分子是一样的。(4)重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。拼接基因M和N时，需要找到两种基因的重叠部分，即M1、M2中的一种引物与N1、N2中的一种引物必须具有互补配对的片段。7．(1)限制性内切核酸(或限制)核苷酸序列(2)磷酸二酯键DNA单链以DNA为模板的DNA链的延伸(3)②④解析