Transwell细胞迁移实验操作指南

Transwell细胞迁移实验操作指南一、实验原理概述Transwell细胞迁移实验基于趋化作用与细胞运动能力的生物学特性，利用Transwell小室（含聚碳酸酯或聚酯膜，膜孔径通常为8μm）构建“细胞迁移屏障”：上室接种无血清培养基重悬的待检测细胞，下室添加含趋化因子（如血清、生长因子）的完全培养基，细胞因趋化作用向营养梯度高的下室迁移，最终穿过膜的细胞数量可反映其迁移能力。与“细胞侵袭实验”的核心区别在于：迁移实验的膜无基质胶（Matrigel）包被，仅检测细胞“单纯迁移”能力；侵袭实验需包被Matrigel模拟细胞外基质，检测细胞“降解基质+迁移”的复合能力。二、实验材料准备（一）试剂与耗材1.Transwell小室：根据细胞类型选择膜孔径（如8μm用于多数肿瘤细胞、间质细胞；3μm用于淋巴细胞），注意区分“带聚碳酸酯膜”与“聚酯膜”（后者更耐酶解，适合长期实验）。2.培养基：无血清基础培养基（如DMEM、RPMI-1640）、含血清完全培养基（作为下室趋化因子源，血清浓度依细胞需求调整，通常为10%）。3.固定与染色试剂：甲醇（固定）、结晶紫染液（或Giemsa染液、苏木精-伊红染液）；若采用“荧光计数法”，需提前用CFSE等荧光染料标记细胞。4.其他试剂：PBS缓冲液、0.25%胰酶-EDTA、Matrigel（仅侵袭实验用，迁移实验无需）。（二）仪器设备CO₂恒温培养箱、倒置显微镜、低速离心机、移液器（含无菌吸头）、细胞计数板、恒温摇床（可选，用于染色后洗脱）、酶标仪（若采用MTT/CCK-8法检测）。三、标准化操作流程（一）细胞预处理：同步化与饥饿处理取对数生长期细胞，用0.25%胰酶-EDTA消化，无血清培养基重悬后计数，调整密度至1×10⁵~5×10⁵cells/mL（依细胞迁移能力优化，如高迁移细胞可降低密度）。将细胞悬液置于37℃、5%CO₂培养箱中饥饿培养12~24h（无血清培养基），使细胞同步于G₀期，减少内源性生长因子干扰。（二）Transwell小室准备1.膜润湿与气泡排除：将Transwell小室放入24孔板（下室），向上室缓慢加入200μL无血清培养基，确保膜完全润湿且无气泡（若膜上有气泡，细胞无法附着，需倾斜小室排除）。静置10min后，吸走上室液体，备用。2.下室趋化因子添加：向下室（24孔板孔）加入500μL含血清完全培养基（趋化因子源），确保液面略低于小室膜底部（避免液体溢出至上室）。（三）细胞接种与培养取饥饿处理后的细胞悬液，向上室加入200μL细胞悬液（含细胞数约2×10⁴~1×10⁵，依细胞类型调整），确保细胞悬液均匀覆盖膜表面（可轻晃24孔板使细胞分布均匀）。将24孔板放入37℃、5%CO₂培养箱，培养12~48h（时间梯度优化：如24h后镜下观察，若细胞迁移过多则缩短时间，反之延长）。（四）固定、染色与计数1.移除未迁移细胞：培养结束后，用镊子取出小室，用无菌棉签轻轻擦去上室膜表面未迁移的细胞（沿一个方向擦拭，避免膜破损）。2.固定与染色：将小室放入甲醇中固定15min（室温），取出后自然晾干；再放入结晶紫染液中染色15~30min（或Giemsa染液染色30min），随后用PBS缓慢冲洗膜表面，去除未结合染料。3.细胞计数：将小室倒置在载玻片上，在倒置显微镜下随机选取5个视野（如膜的上、中、下、左、右区域），计数每个视野中穿过膜的细胞数（呈紫色、形态完整的细胞）。若采用荧光标记，可直接用荧光显微镜计数或酶标仪测吸光度。四、结果分析与统计1.定量统计：计算5个视野的平均细胞数，作为该组细胞的迁移能力指标；若采用MTT/CCK-8法，需将小室放入含MTT/CCK-8试剂的孔中孵育，通过吸光度值（OD值）反映细胞活力（需提前优化细胞密度，避免OD值饱和）。2.统计学分析：至少设置3个复孔，重复实验3次，采用t检验或方差分析（ANOVA）比较不同组（如对照组、药物处理组）的迁移能力差异，结果以“均值±标准差（x±s）”表示。五、常见问题与优化策略（一）细胞迁移效率低/无迁移可能原因：趋化因子浓度不足（如血清浓度过低）、细胞饥饿时间过长（导致活力下降）、膜孔径不匹配（如淋巴细胞需3μm膜）。优化：调整下室血清浓度（如从5%增至20%）、缩短饥饿时间（如6~12h）、更换合适孔径的小室。（二）膜上气泡残留解决：加液时沿小室壁缓慢注入培养基，若气泡已形成，可将小室倾斜45°，用移液器尖端轻轻吸除气泡。（三）计数误差大优化：固定染色后，确保膜干燥（避免细胞脱落）；计数时统一视野位置（如均选膜中央区域）；若细胞过多，可稀释细胞悬液或缩短培养时间。六、实验注意事项1.无菌操作：全程在超净台内进行，避免污染导致实验失败。2.膜的保护：擦拭未迁移细胞时，棉签需柔软，避免划伤膜；染色后冲洗力度适中，防止细胞被冲掉。3.时间与密度优化：不同细胞（如肿瘤细胞、正常细胞）的迁移能力差异大，需通过预实验确定最佳接种密度与培养时间。>提示：若需检测“细胞侵袭能力”，可在小室准备阶段，用Matrigel（按1:8~1:10稀释）包被膜表面（4℃