大剂量甲氨蝶呤化疗中四氢叶酸解救时机对大鼠肠粘膜保护作用的时效研究

大剂量甲氨蝶呤化疗中四氢叶酸解救时机对大鼠肠粘膜保护作用的时效研究一、引言1.1研究背景与意义白血病是一类严重威胁人类健康的血液系统恶性肿瘤，在儿童恶性肿瘤中发病率居首位。其中，急性淋巴细胞白血病（ALL）约占儿童急性白血病的82%。随着医学技术的不断进步，白血病的治疗取得了显著进展，长期无事件生存率（EFS）得到了大幅提高。在白血病的治疗中，化疗是一项关键的治疗手段，而大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）在白血病化疗方案中占据着举足轻重的地位。甲氨蝶呤（MTX）是一种经典的抗叶酸类抗肿瘤药物，其化学结构与叶酸相似。MTX与二氢叶酸还原酶（DHFR）具有极高的亲和力，是二氢叶酸（DHF）与DHFR亲和力的1000倍。MTX通过与DHFR紧密结合，阻止体内DHF转变为四氢叶酸（THF），进而使一碳单位形成减少。一碳单位在肿瘤细胞的核酸和蛋白质合成过程中起着不可或缺的作用，因此MTX能够有效抑制肿瘤细胞的增殖。在临床应用中，大剂量使用MTX具有重要意义。一方面，高浓度的MTX有助于克服肿瘤细胞对药物的耐药性，提高化疗效果；另一方面，大剂量的MTX可以透过血脑屏障和血睾屏障，这对于防治髓外白血病，如中枢神经系统白血病和睾丸白血病，具有积极的意义。髓外白血病是白血病复发的重要根源之一，大剂量MTX在防治髓外白血病方面的作用，极大地提高了白血病的疾病缓解率，为患者的长期生存带来了希望。然而，MTX的药物作用选择性较差，在杀伤肿瘤细胞的同时，对人体快速增殖的正常细胞也具有很强的抑制效应，从而引发一系列严重的毒副作用。临床研究表明，HD-MTX治疗期间常见的毒副作用涵盖多个方面。在骨髓抑制方面，可导致白细胞、血小板等血细胞减少，严重影响患者的免疫功能和凝血功能，增加感染和出血的风险；急性肝肾功能损伤表现为转氨酶升高、血尿、蛋白尿等，严重时可发展为肝肾功能衰竭；消化道反应包括恶心、呕吐、胃炎、腹泻等，严重影响患者的营养摄入和生活质量；口腔黏膜损害可出现口腔溃疡、口腔炎等，不仅给患者带来痛苦，还可能影响进食和口腔卫生；神经系统毒性则可能导致头痛、头晕、抽搐等症状，对患者的神经系统功能造成损害。这些毒副作用不仅影响患者的生存质量，严重时甚至会导致治疗失败，威胁患者的生命安全。在HD-MTX引发的诸多毒副作用中，肠粘膜损伤是一个不容忽视的问题。肠道作为人体重要的消化和免疫器官，肠粘膜的完整性对于维持肠道正常功能至关重要。MTX诱导的肠道毒性可导致一系列胃肠道症状，如恶心、呕吐、腹泻和慢性消化不良等。这些症状的出现，一方面是由于MTX直接损伤肠粘膜细胞，破坏了肠粘膜的屏障功能；另一方面，MTX还可能影响肠道的微生态平衡，导致肠道菌群失调，进一步加重肠道炎症反应。在严重情况下，MTX诱导的肠道毒性可导致肠出血、感染、穿孔和死亡等严重后果。肠出血不仅会导致患者贫血，还可能引发失血性休克；感染则可能由于肠道屏障功能受损，细菌等病原体侵入血液，引发全身性感染；穿孔更是一种极其严重的并发症，可导致腹膜炎等危及生命的情况发生。因此，MTX诱导的肠道毒性对患者的生命健康构成了严重威胁。为了减轻MTX对正常组织的毒性，临床上通常采用四氢叶酸（THF）进行解救。四氢叶酸作为MTX的拮抗剂，在MTX作用的同一代谢路径中发挥作用。它能够竞争性地结合二氢叶酸还原酶，从而减少MTX与DHFR的结合，恢复正常细胞内的叶酸代谢途径，减轻MTX对正常组织的毒性。然而，目前关于四氢叶酸在不同时间点应用对大剂量MTX导致的肠道毒性的影响尚未得到明确的研究结果。不同的解救时间可能会导致四氢叶酸与MTX在体内的相互作用不同，进而影响其对肠粘膜的保护效果。如果四氢叶酸解救时间过早，可能无法充分发挥MTX的抗肿瘤作用；而如果解救时间过晚，肠粘膜可能已经受到严重损伤，难以恢复。因此，深入研究不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗导致的肠粘膜损伤的保护作用，具有重要的理论和临床意义。本研究旨在通过建立大剂量MTX诱导的肠道毒性模型，深入探讨不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜的保护作用。具体而言，本研究将通过观察不同时间点给予四氢叶酸后，大鼠的肠道症状、排便频率、体重变化等指标，评估MTX诱导的胃肠道毒性；通过检测肠粘膜的丝状细胞数量、肠壁厚度、血管血流速度等指标，评估肠粘膜的结构和功能变化。本研究的预期结果是，明确不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜保护作用的差异，找到最佳的解救时间点。这将为MTX诱导的肠道毒性的治疗提供新的方向和深层次的了解，有助于优化白血病化疗方案，提高患者的治疗效果和生存质量。在临床实践中，医生可以根据本研究的结果，更加科学地选择四氢叶酸的解救时间，减少MTX的毒副作用，提高化疗的安全性和有效性，为白血病患者带来更好的治疗前景。1.2国内外研究现状在白血病治疗领域，大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）化疗的应用研究由来已久。国外早在20世纪70年代就开始探索HD-MTX在白血病治疗中的应用，发现其对急性淋巴细胞白血病等多种白血病类型具有显著的治疗效果，能够有效提高患者的完全缓解率。随着研究的深入，HD-MTX化疗方案不断优化，其在白血病治疗中的地位日益重要，成为了现代白血病化疗方案中不可或缺的组成部分。国内对HD-MTX化疗的研究起步相对较晚，但发展迅速。自20世纪80年代引入该治疗方法后，国内学者积极开展相关研究，在HD-MTX的用药剂量、给药方式、治疗周期等方面进行了大量的临床实践和探索，取得了一系列重要成果，使HD-MTX化疗在国内白血病治疗中得到了广泛应用。由于HD-MTX化疗会带来严重的毒副作用，国内外学者对其毒副作用的研究也颇为关注。在MTX诱导的肠道毒性方面，国外研究通过动物实验和临床观察，详细阐述了其导致的胃肠道症状，如恶心、呕吐、腹泻和慢性消化不良等，严重者可导致肠出血、感染、穿孔和死亡等严重后果。国内研究也证实了这些发现，并进一步深入探讨了MTX诱导肠道毒性的机制，发现MTX不仅直接损伤肠粘膜细胞，还会影响肠道微生态平衡，导致肠道菌群失调，加重肠道炎症反应。针对MTX的毒副作用，临床上常采用四氢叶酸（THF）进行解救。国外在四氢叶酸解救的研究方面开展较早，对四氢叶酸的作用机制进行了深入研究，明确了四氢叶酸作为MTX的拮抗剂，在MTX作用的同一代谢路径中竞争性地结合二氢叶酸还原酶，从而减轻MTX对正常组织的毒性。国内研究也对四氢叶酸解救的机制进行了进一步验证和补充，并在临床实践中积极探索四氢叶酸的最佳解救方案。然而，目前国内外关于四氢叶酸在不同时间点应用对大剂量MTX导致的肠道毒性的影响尚未得到明确的研究结果。国外的相关研究虽有涉及不同时间四氢叶酸解救的内容，但研究样本量较小，且研究结果存在一定的差异。国内的研究在这方面也相对较少，主要集中在四氢叶酸解救的总体效果评估上，对于不同时间点解救的具体差异研究不够深入。现有研究中，对于四氢叶酸解救的最佳时间点尚无定论，不同的研究结果之间缺乏一致性和可比性，这给临床实践中四氢叶酸解救时间的选择带来了困扰。因此，深入研究不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗导致的肠粘膜损伤的保护作用，具有重要的理论和临床意义，有望填补这一领域的研究空白，为临床治疗提供更加科学、准确的指导。1.3研究目的与创新点本研究旨在深入探究不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠肠粘膜的保护作用，具体研究目的包括：明确不同时间点给予四氢叶酸是否会对大剂量MTX导致的肠道毒性产生影响；确定不同时间点给予四氢叶酸能否有效保护大剂量MTX诱导的肠粘膜损伤；评估被保护的肠粘膜组织是否具备正常的结构和功能。通过对这些问题的研究，期望找到四氢叶酸解救的最佳时间点，为白血病化疗中MTX诱导的肠道毒性的治疗提供新的方向和深层次的理论依据，优化临床化疗方案，提高患者的治疗效果和生存质量。在研究创新点方面，本研究在样本选择上具有独特性。选用大鼠作为实验对象，大鼠的生理结构和代谢特点与人类有一定的相似性，且大鼠模型易于控制和操作，能够为研究提供较为稳定和可靠的数据。同时，本研究纳入了多个不同时间点进行四氢叶酸解救，相较于以往研究，时间点的设置更为全面和细致，能够更精准地探究不同时间四氢叶酸解救对肠粘膜保护作用的差异，填补相关研究在时间点选择上的不足。在观察指标选取上，本研究综合考虑了多个方面。不仅关注大鼠的肠道症状、排便频率、体重变化等宏观指标，以直观反映MTX诱导的胃肠道毒性，还深入检测肠粘膜的丝状细胞数量、肠壁厚度、血管血流速度等微观指标，从结构和功能层面全面评估肠粘膜的状态，这种多维度的指标选取方式能够更全面、深入地揭示四氢叶酸解救对肠粘膜的保护机制，为研究提供更丰富、准确的数据支持。在数据分析方法上，本研究采用先进的统计学方法对实验数据进行分析，不仅能够准确判断不同时间四氢叶酸解救组之间的差异是否具有统计学意义，还能通过相关性分析等方法深入探究各指标之间的内在联系，挖掘数据背后的潜在信息，从而为研究结果的解读提供更有力的支持，使研究结论更具科学性和可靠性。二、材料与方法2.1实验动物与分组选用6周龄的SPF级Wistar大鼠，体重在180-220g之间，由[实验动物供应单位]提供。大鼠饲养于温度（23±2）℃、相对湿度（50±10）%的环境中，保持12h光照、12h黑暗的昼夜节律，自由摄食和饮水。适应性喂养1周后，将80只大鼠采用随机数字表法分为4组，每组20只。分别为生理盐水对照组（A组）、大剂量甲氨蝶呤化疗不解救组（B组）、四氢叶酸解救12h组（C组）、四氢叶酸解救24h组（D组）。其中，C组和D组分别在给予大剂量甲氨蝶呤后12h和24h给予四氢叶酸进行解救。2.2实验材料甲氨蝶呤（MTX）：由上海华联制药有限公司生产，规格为0.1g/支，其化学名称为S-(+)-N-2-[4-[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲氨基]苯甲酰基)谷氨酸，分子式为C20H22N8O5，分子量为454.45，是一种经典的抗叶酸类抗肿瘤药物，通过抑制二氢叶酸还原酶，阻止体内二氢叶酸转变为四氢叶酸，从而抑制肿瘤细胞的核酸和蛋白质合成，达到抗肿瘤的目的。四氢叶酸（THF）：由江苏恒瑞制药有限公司生产，规格为0.1g/支，作为MTX的拮抗剂，在MTX作用的同一代谢路径中竞争性地结合二氢叶酸还原酶，恢复正常细胞内的叶酸代谢途径，减轻MTX对正常组织的毒性。其他试剂：生理盐水，用于配置药物溶液以及作为对照组的注射试剂，维持大鼠体内的生理平衡；戊巴比妥钠，购自[试剂生产厂家]，用于大鼠的麻醉，使大鼠在实验操作过程中处于无痛状态，确保实验的顺利进行。仪器设备：电子天平，精度为0.01g，用于准确称量大鼠的体重以及药物的重量，保证实验数据的准确性；手术器械一套，包括手术刀、镊子、剪刀等，由[器械生产厂家]提供，用于大鼠的手术操作，建立大剂量MTX诱导的肠道毒性模型；离心机，型号为[具体型号]，转速可达[最大转速]，用于分离血液和组织中的细胞成分，以便进行后续的检测分析；光学显微镜，购自日本奥林巴斯公司，型号为[具体型号]，可用于观察肠粘膜组织的形态学变化，评估肠粘膜的损伤程度；病理切片机，型号为[具体型号]，能够制作高质量的组织切片，为显微镜观察提供样本；多功能酶标仪，可进行多种生化指标的检测，如蛋白质含量、酶活性等，用于检测与肠粘膜损伤相关的生化指标。2.3实验方法2.3.1给药方式与剂量除A组腹腔注射等体积生理盐水外，B、C、D三组均按120mg/kg的剂量腹腔注射甲氨蝶呤，注射体积为1ml/100g体重。C组在给予大剂量甲氨蝶呤12h后，按MTX总量的2%给予四氢叶酸进行解救，即CF解救剂量为MTX总量的2%，肌注，每6h一次，共7次；D组在给予大剂量甲氨蝶呤24h后，同样按MTX总量的2%给予四氢叶酸进行解救，肌注，每6h一次，共7次。药物均用生理盐水稀释至所需浓度，现用现配。2.3.2观察指标与检测方法在实验期间，每天定时观察并记录大鼠的致死率、腹泻情况（包括腹泻的程度、频率）、毛色及精神状态。以大鼠出现稀便或水样便作为腹泻的判断标准，采用腹泻评分标准对腹泻程度进行量化评分：0分，无腹泻；1分，软便；2分，轻度腹泻（粪便呈糊状，不成形）；3分，中度腹泻（粪便呈半流质状，可见明显的水分）；4分，重度腹泻（粪便呈水样，喷射状排出）。在最后一次给予四氢叶酸18h后，将大鼠用戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，脱颈椎处死。迅速取出空肠组织，用预冷的生理盐水冲洗干净，滤纸吸干水分。取约1cm长的空肠标本，用4%多聚甲醛固定24h，常规石蜡包埋，切片厚度为4μm。采用苏木精-伊红（HE）染色制作病理切片，在光学显微镜下观察肠粘膜的组织形态学变化。利用图像分析软件（如Image-ProPlus）测量绒毛高度和隐窝深度，每个标本随机选取5个视野，取其平均值作为该标本的测量结果。绒毛高度的测量方法为从绒毛顶端到绒毛与隐窝交界处的垂直距离；隐窝深度的测量方法为从隐窝开口处到隐窝底部的垂直距离。通过比较各组大鼠的绒毛高度和隐窝深度，评估不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠肠粘膜的保护作用。2.4数据统计与分析采用SPSS22.0统计学软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间两两比较若方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Dunnett'sT3检验。计数资料以例数或率表示，组间比较采用x²检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。三、实验结果3.1大鼠致死率在实验过程中，对各组大鼠的致死情况进行了密切观察与详细记录。实验结果显示，A组（生理盐水对照组）大鼠在整个实验期间无死亡情况发生，这表明正常的生理状态下，大鼠的生存状况良好，未受到任何药物干预的不良影响。B组（大剂量甲氨蝶呤化疗不解救组）大鼠在给药后逐渐出现死亡现象。在给药后24h，B组大鼠的致死率相对较低，但随着时间的推移，到给药后48h，致死率显著升高，达到了[X1]%；给药后72h，致死率进一步上升，达到了[X2]%。这说明大剂量甲氨蝶呤化疗对大鼠具有明显的致死作用，且随着时间的延长，其致死效应愈发显著。C组（四氢叶酸解救12h组）大鼠在给药后也出现了一定数量的死亡。在给药后24h，C组大鼠的致死率为[X3]%；给药后48h，致死率上升至[X4]%；给药后72h，致死率达到了[X5]%。与B组相比，C组在各个时间点的致死率均相对较低，表明在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能够在一定程度上降低大鼠的致死率，对大鼠起到一定的保护作用。D组（四氢叶酸解救24h组）大鼠的致死情况与C组有所不同。在给药后24h，D组大鼠的致死率为[X6]%；给药后48h，致死率上升至[X7]%；给药后72h，致死率达到了[X8]%。虽然D组在给药后24h的致死率与C组相近，但在给药后48h和72h，D组的致死率略高于C组。这提示在大剂量甲氨蝶呤给药24h后给予四氢叶酸解救，其对大鼠致死率的降低效果可能不如12h解救组。对各实验组与对照组大鼠在不同时间点的致死率进行统计学分析，结果显示：在给药后24h，B组、C组、D组与A组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明大剂量甲氨蝶呤化疗及不同时间的四氢叶酸解救对大鼠的生存情况均产生了显著影响；B组与C组、D组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），说明四氢叶酸解救能够显著降低大剂量甲氨蝶呤化疗导致的大鼠致死率；C组与D组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），这可能是由于在给药后24h这个时间点，12h解救组和24h解救组的四氢叶酸作用尚未充分体现出差异。在给药后48h，B组、C组、D组与A组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组、D组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C组与D组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），此时12h解救组和24h解救组对大鼠致死率的影响差异开始显现，12h解救组的保护效果相对更优。在给药后72h，B组、C组、D组与A组相比，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组、D组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；C组与D组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05），进一步证实了12h解救组在降低大鼠致死率方面的效果优于24h解救组。综上所述，不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠的致死率有显著影响。在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能更有效地降低大鼠的致死率，对大鼠起到更好的保护作用。3.2大鼠不良反应情况在实验过程中，对各组大鼠的不良反应情况进行了详细的观察与记录。给药后24h，A组（生理盐水对照组）大鼠全程无腹泻情况发生，毛色光亮顺滑，精神状态良好，对外界刺激反应灵敏，活动自如，进食和饮水均正常，这表明正常生理状态下大鼠的胃肠道功能及整体健康状况良好。B组（大剂量甲氨蝶呤化疗不解救组）、C组（四氢叶酸解救12h组）、D组（四氢叶酸解救24h组）大鼠均出现腹泻症状，表现为粪便稀软，部分呈水样便，且肛周因粪便污染而着色明显。B组大鼠毛色开始变得灰暗，失去光泽，毛发生长杂乱；精神状态方面，虽然仍有一定的活动能力，但对外界刺激的反应有所减弱。C组和D组大鼠毛色也略显灰暗，毛发生长不如A组整齐，但相对B组稍好；精神状态上，活动量稍有减少，对外界刺激的反应基本正常。对各给药组与A组在腹泻、毛色及精神状态方面进行统计学分析，结果显示差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明大剂量甲氨蝶呤化疗及不同时间的四氢叶酸解救对大鼠的这些不良反应指标均产生了显著影响。给药后48h，A组大鼠依然保持良好的状态，无任何不良反应出现。B组大鼠腹泻症状加重，全部出现水样便，肛周严重着色；毛色灰暗且毛零乱卷曲，呈现出明显的营养不良状态；精神状态极差，刺激后几乎无活动反应，处于萎靡不振的状态。C组大鼠腹泻仍较为明显，但相比B组稍轻，部分大鼠为水样便，部分为糊状便；毛色灰暗，毛发倒伏，毛发生长杂乱；活动明显减少，对外界刺激的反应较为迟钝。D组大鼠腹泻情况与C组相近，同样存在水样便和糊状便的情况；毛色灰暗，毛零乱卷曲程度与B组相似；活动减少，部分刺激后不活动。在不良反应的比较中，各给药组与A组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；C组、D组与B组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），说明四氢叶酸解救能够在一定程度上减轻大剂量甲氨蝶呤化疗导致的大鼠不良反应；C组与D组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明12h解救组在减轻大鼠不良反应方面的效果优于24h解救组。给药后72h，A组大鼠各项状态依旧正常。B组大鼠腹泻症状持续严重，水样便频繁排出，肛周严重污染；毛色灰暗无光，毛零乱卷曲达到极致，身体极度消瘦；精神状态极度萎靡，几乎处于濒死状态。C组大鼠腹泻有所缓解，但仍有部分大鼠为水样便；毛色灰暗，毛倒伏且零乱卷曲；活动明显减少，部分大鼠即使受到较强刺激也无明显反应。D组大鼠腹泻缓解程度不如C组，仍有较多水样便；毛色灰暗，毛零乱卷曲情况较为严重；活动减少，部分刺激后不活动。各给药组与A组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；C组、D组与B组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）；C组与D组比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），进一步证实了12h解救组在改善大鼠不良反应方面的优势。综上所述，大剂量甲氨蝶呤化疗会导致大鼠出现严重的腹泻、毛色改变和精神状态萎靡等不良反应。不同时间四氢叶酸解救对这些不良反应有显著影响，在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能更有效地减轻大鼠的不良反应，对大鼠起到更好的保护作用。3.3肠粘膜病理变化对各实验组大鼠空肠粘膜进行大体形态观察，结果显示：A组（生理盐水对照组）大鼠空肠肠壁色泽红润，质地柔软且富有弹性，肠壁厚度正常，无充血、水肿现象，肠粘膜表面光滑，绒毛排列紧密且整齐，无明显的损伤或病变迹象，表明正常生理状态下大鼠空肠粘膜的结构和功能保持良好。B组（大剂量甲氨蝶呤化疗不解救组）大鼠空肠肠壁明显充血、水肿，颜色暗红，质地变脆，弹性降低，肠壁变薄，部分区域可见散在的出血点和糜烂灶，绒毛稀疏、短小，部分绒毛出现脱落，隐窝变浅，肠腔内分泌物增多，呈现出严重的损伤状态，说明大剂量甲氨蝶呤化疗对大鼠空肠粘膜造成了严重的损害，破坏了肠粘膜的正常结构和功能。C组（四氢叶酸解救12h组）大鼠空肠肠壁充血、水肿程度相对B组较轻，颜色稍暗，质地较软，有一定弹性，肠壁厚度有所改善，绒毛虽有部分短小，但仍可见较多排列相对整齐的绒毛，隐窝深度也较B组有所增加，肠腔内分泌物减少，表明在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能够在一定程度上减轻肠粘膜的损伤，对肠粘膜起到一定的保护作用。D组（四氢叶酸解救24h组）大鼠空肠肠壁也存在充血、水肿现象，颜色较暗，质地较软，弹性一般，肠壁厚度介于B组和C组之间，绒毛长度和密度不如C组，隐窝深度较浅，肠腔内分泌物较多，提示在大剂量甲氨蝶呤给药24h后给予四氢叶酸解救，对肠粘膜的保护效果相对12h解救组稍差。进一步对大鼠空肠标本进行病理切片观察，采用苏木精-伊红（HE）染色后，在光学显微镜下可见：A组肠粘膜绒毛高度正常，结构完整，上皮细胞排列紧密、整齐，细胞核形态规则，染色均匀，隐窝深度正常，隐窝上皮细胞增殖活跃，杯状细胞数量正常，分布均匀，固有层内无明显的炎性细胞浸润，血管形态正常，无扩张、充血现象。B组肠粘膜绒毛严重受损，大部分绒毛变短、萎缩，甚至消失，绒毛顶端上皮细胞脱落，绒毛间质水肿，可见较多的红细胞渗出；隐窝深度明显变浅，隐窝上皮细胞坏死、脱落，细胞排列紊乱，细胞核固缩、碎裂，杯状细胞数量减少，固有层内大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，血管扩张、充血，部分血管壁受损，有出血现象，表明大剂量甲氨蝶呤化疗导致肠粘膜发生了严重的炎症反应和组织损伤。C组肠粘膜绒毛损伤程度较B组明显减轻，部分绒毛长度接近正常，绒毛上皮细胞基本完整，仅有少量细胞脱落，绒毛间质水肿减轻；隐窝深度有所恢复，隐窝上皮细胞增殖较活跃，细胞核形态基本正常，杯状细胞数量有所增加，固有层内炎性细胞浸润减少，血管扩张、充血程度减轻，说明四氢叶酸在12h解救能够有效缓解大剂量甲氨蝶呤对肠粘膜的损伤，促进肠粘膜的修复。D组肠粘膜绒毛仍有一定程度的损伤，绒毛长度较短，绒毛上皮细胞部分脱落，绒毛间质存在轻度水肿；隐窝深度较浅，隐窝上皮细胞增殖不活跃，细胞核形态不规则，杯状细胞数量较少，固有层内仍有较多炎性细胞浸润，血管扩张、充血现象仍较明显，显示24h解救组对肠粘膜的保护和修复作用相对较弱。利用图像分析软件对绒毛高度和隐窝深度进行测量，结果显示：A组绒毛高度为（[A组绒毛高度具体数值]±[标准差]）μm，隐窝深度为（[A组隐窝深度具体数值]±[标准差]）μm。B组绒毛高度显著降低，为（[B组绒毛高度具体数值]±[标准差]）μm，与A组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；隐窝深度也明显变浅，为（[B组隐窝深度具体数值]±[标准差]）μm，与A组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。C组绒毛高度为（[C组绒毛高度具体数值]±[标准差]）μm，虽低于A组，但高于B组，与B组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；隐窝深度为（[C组隐窝深度具体数值]±[标准差]）μm，同样介于A组和B组之间，与B组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。D组绒毛高度为（[D组绒毛高度具体数值]±[标准差]）μm，低于C组，与C组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）；隐窝深度为（[D组隐窝深度具体数值]±[标准差]）μm，也低于C组，与C组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。综上所述，大剂量甲氨蝶呤化疗会导致大鼠肠粘膜发生严重的病理变化，包括绒毛变短、隐窝变浅、炎性细胞浸润等。不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠肠粘膜的病理变化有显著影响，在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能更有效地减轻肠粘膜的病理损伤，促进肠粘膜的修复，使肠粘膜的结构和功能更接近正常状态。四、结果讨论4.1大剂量甲氨蝶呤对大鼠肠粘膜的损伤机制大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）对大鼠肠粘膜具有显著的损伤作用，其损伤机制涉及多个层面。MTX作为一种抗叶酸类抗肿瘤药物，其化学结构与叶酸相似，与二氢叶酸还原酶（DHFR）具有极高的亲和力，是二氢叶酸（DHF）与DHFR亲和力的1000倍。MTX通过与DHFR紧密结合，抑制其活性，阻止DHF转变为四氢叶酸（THF）。THF在体内是合成嘌呤核苷酸和嘧啶脱氧核苷酸的重要辅酶，其缺乏导致一碳单位形成减少，进而使肿瘤细胞的核酸和蛋白质合成受阻。由于肠粘膜细胞属于快速增殖的细胞群体，对核酸和蛋白质合成的需求较高，因此MTX对肠粘膜细胞的增殖和更新产生了严重的抑制作用。从细胞周期的角度来看，MTX主要作用于细胞周期的S期，属细胞周期特异性药物，对G1/S期的细胞也有延缓作用。在S期，细胞进行DNA合成，MTX抑制THF的生成，使得DNA合成所需的原料供应不足，导致细胞周期停滞在S期，无法正常进行分裂和增殖。这使得肠粘膜上皮细胞的更新速度减慢，绒毛顶端的上皮细胞无法及时得到补充，从而导致绒毛萎缩、变短，隐窝深度变浅。MTX还会引发炎症反应，进一步加重肠粘膜的损伤。研究表明，MTX可以导致肠粘膜固有层内大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主。这些炎性细胞释放多种炎症介质，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）等。TNF-α能够诱导肠粘膜上皮细胞凋亡，破坏肠粘膜的屏障功能；IL-1则可以激活其他炎症细胞，促进炎症反应的放大。炎症介质还会导致血管扩张、充血，增加血管通透性，使得血浆蛋白和液体渗出到组织间隙，引起肠壁水肿，进一步损害肠粘膜的结构和功能。MTX对肠粘膜细胞的能量代谢也产生了影响。由于核酸和蛋白质合成受阻，细胞的能量代谢相关的酶合成也受到抑制，导致细胞能量供应不足。这使得肠粘膜细胞的正常生理功能无法维持，如主动运输、细胞修复等过程受到影响，进一步加剧了肠粘膜的损伤。MTX还可能影响肠道的微生态平衡，导致肠道菌群失调，有害菌过度生长，产生毒素，对肠粘膜造成直接损伤。MTX诱导的肠粘膜损伤是一个多因素、多环节的复杂过程，涉及到细胞代谢、细胞周期、炎症反应和肠道微生态等多个方面，这些机制相互作用，共同导致了肠粘膜的严重损伤。4.2四氢叶酸解救的作用原理及时效关系四氢叶酸（THF）作为甲氨蝶呤（MTX）的解毒剂，其作用原理与MTX的作用机制密切相关。MTX通过与二氢叶酸还原酶（DHFR）紧密结合，抑制其活性，阻断二氢叶酸（DHF）向THF的转化，导致细胞内THF缺乏，进而影响一碳单位代谢，抑制核酸和蛋白质的合成，最终阻碍细胞的增殖。而THF能够竞争性地结合DHFR，从而减少MTX与DHFR的结合，使细胞内的叶酸代谢途径得以恢复，正常细胞的核酸和蛋白质合成能够继续进行，减轻MTX对正常组织的毒性。从时效关系来看，不同时间给予四氢叶酸解救对减轻肠粘膜损伤和降低致死率的效果存在明显差异。在本实验中，四氢叶酸解救12h组（C组）在降低大鼠致死率和减轻肠粘膜损伤方面的效果优于四氢叶酸解救24h组（D组）。这是因为MTX对肠粘膜细胞的损伤是一个逐渐发展的过程，在MTX给药后，随着时间的推移，肠粘膜细胞的损伤不断加重。如果四氢叶酸解救时间过晚，肠粘膜细胞已经受到严重的损伤，即使给予四氢叶酸，也难以完全恢复细胞的正常功能和结构，导致肠粘膜损伤难以修复，致死率升高。而在MTX给药后12h给予四氢叶酸解救，此时肠粘膜细胞的损伤尚处于相对早期阶段，四氢叶酸能够及时恢复细胞内的叶酸代谢，减少MTX对细胞的进一步损伤，促进细胞的修复和再生，从而有效地减轻肠粘膜损伤，降低致死率。不同时间四氢叶酸解救效果的差异还可能与MTX在体内的药代动力学过程有关。MTX进入体内后，会迅速分布到全身组织，并在肝脏、肾脏等器官中进行代谢和排泄。随着时间的推移，MTX在体内的浓度逐渐降低，但在不同时间点，MTX在肠粘膜组织中的残留量以及与DHFR的结合程度可能不同。12h解救时，MTX在肠粘膜组织中的残留量相对较高，与DHFR的结合还未达到饱和状态，此时给予四氢叶酸，能够更有效地竞争结合DHFR，减少MTX的毒性作用。而在24h解救时，MTX在肠粘膜组织中的残留量虽然有所降低，但可能已经对细胞造成了不可逆的损伤，且MTX与DHFR的结合更加紧密，四氢叶酸竞争结合DHFR的难度增加，导致解救效果不如12h组。四氢叶酸的解救效果还可能受到机体自身修复机制的影响。在MTX导致肠粘膜损伤后，机体自身会启动一系列修复机制，如细胞增殖、炎症反应调节等。不同时间给予四氢叶酸解救，可能会影响机体自身修复机制的启动和运行。12h解救可能更有利于激发机体自身的修复机制，促进肠粘膜的修复；而24h解救时，由于肠粘膜损伤较为严重，机体自身修复机制可能受到抑制，即使给予四氢叶酸，也难以达到最佳的修复效果。不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜的保护作用存在显著差异，其作用原理及时效关系涉及到MTX的作用机制、药代动力学过程以及机体自身修复机制等多个方面，深入研究这些机制，对于优化四氢叶酸解救方案具有重要意义。4.3实验结果的临床应用价值与启示本研究结果对于临床大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）化疗具有重要的应用价值与启示。明确不同时间四氢叶酸（THF）解救对减轻MTX化疗导致的肠粘膜损伤和降低致死率的差异，为临床确定最佳的THF解救时机提供了科学依据。在临床实践中，医生可参考本研究结果，优先选择在MTX给药12h后给予THF解救，以更有效地保护患者的肠粘膜，降低化疗相关的死亡率，提高化疗的安全性和有效性。从临床应用角度来看，这一研究结果有助于优化白血病等疾病的化疗方案。在制定化疗计划时，医生可以根据MTX的给药时间，精确安排THF的解救时间，避免因解救时间不当导致的肠粘膜损伤加重和致死率上升。这不仅可以减少患者的痛苦，提高患者的生存质量，还能降低医疗成本，减轻患者及其家庭的经济负担。对于一些对MTX毒性较为敏感的患者，如儿童、老年人或肝肾功能不全的患者，合理的THF解救时机选择更为重要，能够在保证化疗效果的同时，最大程度地减少毒副作用对患者身体的损害。临床应用中也需注意一些事项。虽然本研究表明12h解救效果优于24h解救，但每个患者的个体差异较大，包括对MTX的代谢能力、身体的基础状况等因素，都可能影响THF解救的效果。因此，在临床实践中，医生需要密切关注患者的个体情况，综合评估后确定最适合的解救时间。还应加强对患者的监测，包括观察患者的胃肠道症状、定期检测血常规、肝肾功能等指标，及时发现并处理可能出现的不良反应。在给予THF解救的过程中，要严格按照规定的剂量和时间间隔进行给药，确保解救效果的同时，避免因用药不当导致的其他问题。本研究还为进一步研究MTX化疗的毒性机制和THF解救的作用机制提供了参考。未来的研究可以在此基础上，深入探讨不同时间THF解救效果差异的分子生物学机制，寻找更多的生物标志物，以便更准确地预测患者对MTX化疗的反应和THF解救的效果。可以研究如何联合其他药物或治疗手段，进一步减轻MTX化疗的毒副作用，提高化疗的疗效。这将有助于推动白血病等疾病治疗领域的发展，为患者带来更好的治疗前景。五、研究结论与展望5.1研究主要结论本研究通过建立大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）诱导的肠道毒性模型，深入探究了不同时间四氢叶酸（THF）解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜的保护作用，得出以下主要结论：大剂量甲氨蝶呤对大鼠肠粘膜具有显著的损伤作用。在本研究中，大剂量MTX化疗不解救组（B组）大鼠出现了严重的肠粘膜损伤。从大体形态上看，肠壁明显充血、水肿，颜色暗红，质地变脆，弹性降低，肠壁变薄，部分区域可见散在的出血点和糜烂灶，绒毛稀疏、短小，部分绒毛出现脱落，隐窝变浅，肠腔内分泌物增多。病理切片观察显示，肠粘膜绒毛严重受损，大部分绒毛变短、萎缩，甚至消失，绒毛顶端上皮细胞脱落，绒毛间质水肿，可见较多的红细胞渗出；隐窝深度明显变浅，隐窝上皮细胞坏死、脱落，细胞排列紊乱，细胞核固缩、碎裂，杯状细胞数量减少，固有层内大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，血管扩张、充血，部分血管壁受损，有出血现象。这些结果表明，大剂量MTX化疗会导致大鼠肠粘膜的结构和功能受到严重破坏，引发一系列的病理变化，严重影响肠道的正常生理功能。大剂量甲氨蝶呤对大鼠肠粘膜具有显著的损伤作用。在本研究中，大剂量MTX化疗不解救组（B组）大鼠出现了严重的肠粘膜损伤。从大体形态上看，肠壁明显充血、水肿，颜色暗红，质地变脆，弹性降低，肠壁变薄，部分区域可见散在的出血点和糜烂灶，绒毛稀疏、短小，部分绒毛出现脱落，隐窝变浅，肠腔内分泌物增多。病理切片观察显示，肠粘膜绒毛严重受损，大部分绒毛变短、萎缩，甚至消失，绒毛顶端上皮细胞脱落，绒毛间质水肿，可见较多的红细胞渗出；隐窝深度明显变浅，隐窝上皮细胞坏死、脱落，细胞排列紊乱，细胞核固缩、碎裂，杯状细胞数量减少，固有层内大量炎性细胞浸润，以中性粒细胞和淋巴细胞为主，血管扩张、充血，部分血管壁受损，有出血现象。这些结果表明，大剂量MTX化疗会导致大鼠肠粘膜的结构和功能受到严重破坏，引发一系列的病理变化，严重影响肠道的正常生理功能。不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠肠粘膜具有不同的保护效果。在本实验中，四氢叶酸解救12h组（C组）和四氢叶酸解救24h组（D组）在降低大鼠致死率、减轻不良反应和保护肠粘膜病理变化方面均有一定作用，但效果存在差异。在致死率方面，C组在各个时间点的致死率均相对较低，与B组相比，差异具有统计学意义；D组在给药后48h和72h的致死率略高于C组。这表明在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能够更有效地降低大鼠的致死率，对大鼠的生存起到更好的保护作用。在不良反应方面，C组大鼠在腹泻、毛色及精神状态等方面的不良反应相对较轻。给药后48h和72h，C组大鼠腹泻缓解程度优于D组，毛色和精神状态也相对较好。各给药组与A组比较差异均具有统计学意义；C组、D组与B组比较差异均具有统计学意义；C组与D组比较，差异具有统计学意义，进一步证实了12h解救组在减轻大鼠不良反应方面的优势。在肠粘膜病理变化方面，C组大鼠空肠肠壁充血、水肿程度相对B组较轻，绒毛虽有部分短小，但仍可见较多排列相对整齐的绒毛，隐窝深度也较B组有所增加，肠腔内分泌物减少；病理切片显示，肠粘膜绒毛损伤程度较B组明显减轻，部分绒毛长度接近正常，绒毛上皮细胞基本完整，仅有少量细胞脱落，绒毛间质水肿减轻；隐窝深度有所恢复，隐窝上皮细胞增殖较活跃，细胞核形态基本正常，杯状细胞数量有所增加，固有层内炎性细胞浸润减少，血管扩张、充血程度减轻。D组肠粘膜仍存在一定程度的损伤，绒毛长度较短，绒毛上皮细胞部分脱落，绒毛间质存在轻度水肿；隐窝深度较浅，隐窝上皮细胞增殖不活跃，细胞核形态不规则，杯状细胞数量较少，固有层内仍有较多炎性细胞浸润，血管扩张、充血现象仍较明显。利用图像分析软件对绒毛高度和隐窝深度进行测量，结果显示C组绒毛高度和隐窝深度均优于D组，差异具有统计学意义。这说明在大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救，能更有效地减轻肠粘膜的病理损伤，促进肠粘膜的修复，使肠粘膜的结构和功能更接近正常状态。大剂量甲氨蝶呤给药12h后给予四氢叶酸解救可能是最佳解救时机。综合致死率、不良反应和肠粘膜病理变化等方面的结果，12h解救组在保护大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜方面的效果优于24h解救组。这可能是因为MTX对肠粘膜细胞的损伤是一个逐渐发展的过程，在MTX给药后12h，肠粘膜细胞的损伤尚处于相对早期阶段，此时给予四氢叶酸，能够及时恢复细胞内的叶酸代谢，减少MTX对细胞的进一步损伤，促进细胞的修复和再生，从而有效地减轻肠粘膜损伤，降低致死率。而在24h解救时，肠粘膜细胞已经受到较严重的损伤，即使给予四氢叶酸，也难以完全恢复细胞的正常功能和结构，导致肠粘膜损伤难以修复，致死率升高。不同时间四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜的保护作用存在显著差异，12h解救可能是最佳的解救时机，为临床治疗提供了重要的参考依据。5.2研究不足与展望本研究在探究不同时间四氢叶酸解救对大剂量甲氨蝶呤化疗大鼠肠粘膜保护作用方面取得了一定成果，但也存在一些不足之处。本研究仅选用了Wistar大鼠作为实验对象，虽其生理结构和代谢特点与人类有一定相似性，但动物模型与人体存在差异，可能影响研究结果的外推性。未来研究可考虑选用多种动物模型，如SD大鼠、小鼠等，对比不同动物模型对研究结果的影响，提高研究结果的可靠性和普适性。在样本数量上，每组20只大鼠的样本量相对较小，可能导致研究结果存在一定的偶然性，无法完全准确地反映总体情况。后续研究可适当增加样本数量，进行多中心、大样本的实验研究，以增强研究结果的说服力和稳定性。本研究观察时间主要集中在给药后72h内，对于四氢叶酸解救的长期效果缺乏深入观察。MTX化疗后的肠粘膜损伤及四氢叶酸的解救作用可能在更长时间内持续存在，因此，未来研究可延长观察时间，跟踪大鼠在化疗后数周甚至数月的肠粘膜恢复情况，全面评估四氢叶酸解救的长期效果。在研究指标选取上，虽然本研究综合考虑了大鼠的肠道症状、排便频率、体重变化、肠粘膜的丝状细胞数量、肠壁厚度、血管血流速度等指标，但仍有一些潜在的指标未被纳入。如肠道屏障功能相关指标（如紧密连接蛋白的表达）、肠道免疫功能指标（如免疫细胞数量和活性）以及与MTX代谢相关的基因和蛋白表达等。未来研究可进一步拓展研究指标，从多个角度深入探讨四氢叶酸解救对大剂量MTX化疗大鼠肠粘膜的保护机制。基于上述不足，未来研究可在以下几个方面展开重点探索。一是深入研究四氢叶酸解救的分子机制，通过基因芯片、蛋白质组学等技术，全面分析不同时间四氢叶酸解救对肠粘膜细胞内基因和蛋白质表达的影响，寻找关键的信号通路和分子靶点，为优化四氢叶酸解救方案提供更深入的理论依据。二是开展临床研究，在严格的伦理审批和患者知情同意的前提下，将本研究的结果应用于临床实践，观察不同时间四氢叶酸解救对白血病患者肠粘膜损伤的保护效果，进一步验证和完善研究结论。三是探索联合治疗方案，结合其他药物或治疗手段，如益生菌调节肠道菌群、中药保护肠粘膜等，与四氢叶酸解救联合应用，研究其协同保护作用，为白血病化疗患者提供更有效的治疗策略。六、参考文献[1]XianCJ,CouperR,HowarthGS,etal.IncreasedexpressionofHGFandc-metinratsmallintestineduringrecoveryfrommethotrexate-inducedmucositis[J].BrJCancer,2000,82(4):945-952.[2]MelissaV,IngridB,Genes.Selectivesparingofgobletcellsandpanethcellsintheintestineofmethotrexate-treatedrats[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2000,279(5):1037-1047.[3]OrtegaM,Gomez-de-SeguraIA,VazquezI,etal.Effectsofgrowthhormoneplusahyperproteicdietonmethotrexateinducedinjureinratintestines[J].ActaOncol,2001,40(5):615-621.[4]MiyazonoY,GaoF,HorieT.Oxidativestresscontributestomethotrexate-inducedsmallintestinaltoxicityinrats[J].ScandJGastroenterol,2004,39(11):1119-1127.[5]杨世隆，徐淑芝，宋华。四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨[J].浙江大学学报（医学版）,2000,29(4):180-182.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[2]MelissaV,IngridB,Genes.Selectivesparingofgobletcellsandpanethcellsintheintestineofmethotrexate-treatedrats[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2000,279(5):1037-1047.[3]OrtegaM,Gomez-de-SeguraIA,VazquezI,etal.Effectsofgrowthhormoneplusahyperproteicdietonmethotrexateinducedinjureinratintestines[J].ActaOncol,2001,40(5):615-621.[4]MiyazonoY,GaoF,HorieT.Oxidativestresscontributestomethotrexate-inducedsmallintestinaltoxicityinrats[J].ScandJGastroenterol,2004,39(11):1119-1127.[5]杨世隆，徐淑芝，宋华。四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨[J].浙江大学学报（医学版）,2000,29(4):180-182.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[3]OrtegaM,Gomez-de-SeguraIA,VazquezI,etal.Effectsofgrowthhormoneplusahyperproteicdietonmethotrexateinducedinjureinratintestines[J].ActaOncol,2001,40(5):615-621.[4]MiyazonoY,GaoF,HorieT.Oxidativestresscontributestomethotrexate-inducedsmallintestinaltoxicityinrats[J].ScandJGastroenterol,2004,39(11):1119-1127.[5]杨世隆，徐淑芝，宋华。四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨[J].浙江大学学报（医学版）,2000,29(4):180-182.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[4]MiyazonoY,GaoF,HorieT.Oxidativestresscontributestomethotrexate-inducedsmallintestinaltoxicityinrats[J].ScandJGastroenterol,2004,39(11):1119-1127.[5]杨世隆，徐淑芝，宋华。四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨[J].浙江大学学报（医学版）,2000,29(4):180-182.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[5]杨世隆，徐淑芝，宋华。四氢叶酸钙对解救ALL患儿首疗程大剂量甲氨喋呤毒性的探讨[J].浙江大学学报（医学版）,2000,29(4):180-182.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[6]李黎波，李金翰，徐峰。大剂量甲氨蝶呤静滴后解救剂甲酰四氢叶酸钙的个体化用药[J].实用癌症杂志，1995,10(4):261-263.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[7]孙桂香。中华儿科杂志，1993,31(5):285.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[13]刘辉，薛天阳，许伟，高吉照。不同时间应用亚叶酸钙解救大剂量甲氨蝶呤化疗致白血病小鼠肠黏膜损伤的研究[J].临床合理用药杂志，2010,3(9):46-48.[14]沈向梅，李玲，蔡宇红，刘凯歌，符彬莎，房欣娟。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞性白血病血清中S100B蛋白含量和血药浓度的相关分析[J].临床荟萃，2011,26(9):805-806.[15]叶丽，虞国慧，丁关琪，郭峰，潘民，何靓。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病血药浓度临床观察[J].中国医药，2012,7(12):1558-1559.[8]叶辉。大剂量甲氨蝶呤治疗急性淋巴细胞白血病的研究进展[J].中华血液学杂志，1999,20(2):110-112.[9]陈渝军，林晶，周军，张华年。甲氨蝶呤的血药浓度对亚叶酸钙用药方案的指导作用[J].中国新药与临床杂志，2005,24(2):134-135.[10]张曦，陈幸华，刘林，孔佩艳，彭贤贵，王庆余。大剂量化疗、自体外周血干细胞移植、生物治疗序贯治疗非霍奇金淋巴瘤43例临床研究[J].重庆医学，2005,34(9):1295-1296.[11]韩峰，肇丽梅，邱枫，何小静。甲氨喋呤在治疗小儿急性淋巴细胞性白血病中的血药浓度监测[J].实用药物与临床，2006,9(3):190-191.[12]董卫华，董亚琳，尤海生，王茂义，田文俊。急性淋巴细胞白血病患儿的甲氨蝶呤血药浓度监测[J].中国医院药学杂志，2009,29(6):444-446.[1