大叶八仙花萼片液泡pH调控基因NHX1的克隆与表达：花色奥秘的分子解析

大叶八仙花萼片液泡pH调控基因NHX1的克隆与表达：花色奥秘的分子解析一、绪论1.1研究背景大叶八仙花（Hydrangeamacrophylla），作为虎耳草科八仙花属的落叶灌木，在观赏植物领域占据着重要地位。其花型硕大饱满，花序呈球状或伞状，由众多小花簇拥而成，花朵密集且排列整齐，形成一个极具视觉冲击力的花球，直径可达20厘米甚至更大，无论是孤植于庭院，还是群植于公园、园林景观中，都能成为焦点，吸引人们的目光。大叶八仙花的叶片较为宽大，呈倒卵形或椭圆形，叶片质地厚实，表面光滑且富有光泽，叶色通常为深绿色，在不同的生长阶段和环境条件下，叶色还会发生微妙的变化，如在秋季可能会转为黄绿色或略带红色，为景观增添了丰富的色彩层次。此外，大叶八仙花的花期较长，通常从夏季持续到秋季，在这段时间里，它不断绽放出美丽的花朵，为人们带来持久的观赏享受，使其成为园林景观中不可或缺的观赏植物之一。大叶八仙花的花色丰富多变，这是其最具特色之处，而花色变化主要受液泡pH的影响。在酸性土壤环境中，液泡pH较低，此时大叶八仙花的花色通常呈现出蓝色或蓝紫色；而在碱性土壤条件下，液泡pH升高，花色则转变为粉红色或红色。这种因液泡pH变化而导致的花色改变，源于液泡内的花青素等色素与氢离子的相互作用。当液泡pH发生变化时，花青素的分子结构会相应改变，从而对不同波长的光产生不同的吸收和反射，最终呈现出不同的颜色。这种独特的花色调控机制，不仅使其在观赏价值上具有独特魅力，更为植物生理和园艺研究提供了丰富的研究素材。1.2花器官液泡pH对花色的影响1.2.1花色呈现的生理机制花色呈现是一个复杂的生理过程，涉及多种色素的合成、分布以及它们与细胞内环境的相互作用。在众多影响花色的因素中，液泡pH起着关键作用。液泡作为植物细胞内的重要细胞器，储存着多种物质，包括色素、离子和有机酸等，其内部的pH值变化会显著影响色素的稳定性和结构，进而改变花色。以花青素为例，它是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，在花色形成中扮演着核心角色。花青素的化学结构中含有多个酚羟基，这些羟基在不同的pH条件下会发生质子化或去质子化反应。在酸性环境中，液泡pH较低，花青素分子中的酚羟基易于质子化，形成带正电荷的离子形式，这种结构使其能够吸收特定波长的光，从而呈现出红色、橙色或蓝色等颜色。随着液泡pH升高，环境逐渐变为碱性，花青素分子中的酚羟基会失去质子，发生去质子化反应，分子结构发生改变，对光的吸收和反射特性也随之变化，导致花色逐渐向紫色、蓝色甚至绿色转变。除了花青素，其他色素如类胡萝卜素和黄酮类化合物等也会受到液泡pH的间接影响。类胡萝卜素主要呈现黄色、橙色和红色，它们的合成和稳定性与细胞内的氧化还原状态和pH值密切相关。在适宜的pH条件下，类胡萝卜素能够稳定存在并发挥其呈色作用；而当液泡pH发生剧烈变化时，可能会影响类胡萝卜素的合成途径或导致其降解，从而间接影响花色。黄酮类化合物则具有多种生物活性，它们在液泡中的积累和分布也受到pH值的调控，某些黄酮类化合物还可以与花青素相互作用，形成复合物，进一步丰富花色的变化。1.2.2不同pH值下花色的变化规律大叶八仙花作为一种典型的花色受液泡pH影响的植物，其在不同pH值下呈现出丰富多样的花色变化。研究表明，当液泡pH处于酸性范围（pH<6.0）时，大叶八仙花的花色通常呈现出蓝色或蓝紫色。这是因为在酸性条件下，液泡中的铝离子能够与花青素结合形成稳定的复合物，这种复合物的形成增强了花青素对蓝光的吸收能力，使得花朵呈现出蓝色调。随着液泡pH逐渐升高，进入中性范围（pH6.0-7.0），花色逐渐从蓝色向紫色转变。在这个pH区间内，铝离子与花青素的结合程度逐渐降低，花青素自身的结构变化对花色的影响逐渐凸显，导致花色逐渐向紫色过渡。当液泡pH进一步升高，达到碱性范围（pH>7.0）时，大叶八仙花的花色则转变为粉红色或红色。在碱性环境中，铝离子难以与花青素结合，花青素分子主要以去质子化的形式存在，其吸收光谱发生改变，对红光的吸收增强，从而使花朵呈现出粉红色或红色。这种花色随pH值变化的规律并非绝对，还受到其他因素的影响，如品种差异、光照强度、温度以及土壤中其他离子的浓度等。不同品种的大叶八仙花对液泡pH变化的敏感程度可能不同，某些品种在相同pH值下可能呈现出更鲜艳或更淡的花色。光照强度和温度也会影响植物体内的生理代谢过程，进而间接影响液泡pH和花色。充足的光照可以促进光合作用，为色素合成提供更多的能量和物质基础；而适宜的温度则有助于维持酶的活性，保证色素合成途径的正常进行。1.3调控花器官液泡pH的分子机理1.3.1液泡酸化相关机制液泡酸化是一个复杂的生理过程，涉及多种质子泵和离子通道的协同作用。在植物细胞中，液泡膜上存在着两种主要的质子泵：液泡型H+-ATP酶（V-ATPase）和液泡型H+-焦磷酸酶（V-PPase）。V-ATPase是一种多亚基复合物，能够利用ATP水解产生的能量将质子从细胞质泵入液泡，从而建立起跨液泡膜的质子电化学梯度。这种梯度为其他离子和分子的跨膜运输提供了驱动力，对于维持液泡的正常功能至关重要。研究表明，V-ATPase的活性受到多种因素的调控，包括磷酸化、亚基组成的变化以及细胞内的信号转导途径等。V-PPase则利用焦磷酸（PPi）水解产生的能量来驱动质子跨液泡膜运输。与V-ATPase相比，V-PPase具有更高的质子转运效率，尤其在低ATP浓度的情况下，它能够发挥重要的作用。V-PPase的活性也受到多种因素的调节，如pH值、离子浓度以及激素信号等。除了质子泵，液泡膜上还存在着一些离子通道，如K+通道和Cl-通道等，它们参与了离子的跨膜运输，对液泡酸化过程起到了重要的调节作用。K+通道能够调节液泡内的K+浓度，从而影响质子的电化学梯度；Cl-通道则可以通过调节Cl-的跨膜运输，间接影响液泡的酸化程度。在大叶八仙花中，液泡酸化相关的分子机制也受到了广泛关注。研究发现，大叶八仙花液泡膜上的V-ATPase和V-PPase在花色调控过程中发挥着关键作用。当液泡pH较低时，V-ATPase和V-PPase的活性较高，能够有效地将质子泵入液泡，维持液泡的酸性环境，从而有利于蓝色花色的形成。随着液泡pH的升高，这两种质子泵的活性逐渐降低，导致液泡酸化程度减弱，花色逐渐向粉红色转变。1.3.2液泡碱化相关机制液泡碱化是与液泡酸化相对的过程，其分子机制同样复杂，涉及多种因素的相互作用。液泡碱化主要是由于质子从液泡中流出或其他碱性物质进入液泡所致。在植物细胞中，存在一些反向转运蛋白，如Na+/H+反向转运蛋白（NHX），它们能够将液泡内的质子与细胞质中的其他离子（如Na+）进行交换，从而导致液泡内质子浓度降低，pH升高，发生碱化现象。NHX蛋白家族在植物中广泛存在，不同成员在组织表达特异性和功能上可能存在差异。在一些植物中，盐胁迫等逆境条件会诱导NHX基因的表达，促使更多的Na+进入液泡，同时将质子排出液泡，以维持细胞内的离子平衡和pH稳定，这在一定程度上导致了液泡的碱化。除了反向转运蛋白，一些离子通道也参与了液泡碱化过程。例如，某些阴离子通道在特定条件下允许液泡内的阴离子（如Cl-、NO3-等）流出，这会破坏液泡内的离子平衡，间接导致质子外流，从而引起液泡碱化。一些激素信号和环境刺激也能够影响液泡碱化。植物激素脱落酸（ABA）在应对逆境时发挥重要作用，ABA信号通路可能通过调节相关离子转运蛋白和通道的活性，影响液泡的酸碱平衡，导致液泡碱化。在大叶八仙花中，当土壤环境呈碱性时，根系吸收的碱性物质增多，可能通过一系列生理过程导致液泡内碱性物质积累，同时促进质子外流，使得液泡pH升高，花色逐渐转变为粉红色。研究液泡碱化相关机制对于理解大叶八仙花花色变化具有重要意义，通过调控这些关键分子和信号通路，有望实现对八仙花花色的精准调控，满足园艺观赏和市场需求。1.4本研究的目的及意义1.4.1目的本研究旨在深入探究大叶八仙花独特的花色调控机制，通过现代分子生物学技术，克隆与液泡pH调控密切相关的NHX1基因。运用生物信息学方法，对克隆得到的NHX1基因进行全面分析，明确其基因结构、氨基酸序列特征以及在进化过程中的保守性。在此基础上，通过实时荧光定量PCR等技术，研究该基因在不同生长发育阶段、不同环境条件以及不同组织部位中的表达模式，分析其表达量与液泡pH变化以及花色改变之间的相关性。此外，构建该基因的过表达和沉默载体，通过遗传转化技术导入大叶八仙花植株中，观察其对液泡pH和花色的影响，验证NHX1基因在液泡pH调控及花色形成过程中的功能，为揭示大叶八仙花花色调控的分子机制提供关键数据和理论依据。1.4.2意义从理论角度来看，本研究有助于深入理解植物花色调控的分子机制。通过对NHX1基因的克隆与表达分析，能够进一步揭示液泡pH调控在花色形成中的作用路径，丰富和完善植物花色遗传和生理的理论体系。液泡pH的变化不仅影响花青素等色素的结构和稳定性，还与植物细胞内的离子平衡、代谢活动密切相关。研究NHX1基因在这一过程中的功能，有助于揭示植物细胞内复杂的信号转导网络和调控机制，为其他植物花色研究提供参考和借鉴。在实践方面，本研究对花卉产业具有重要的应用价值。大叶八仙花作为一种重要的观赏花卉，其花色的多样性和稳定性是影响其市场价值的关键因素。通过对NHX1基因的研究，有望为大叶八仙花的花色改良提供新的技术手段和理论指导。可以利用基因工程技术，对NHX1基因的表达进行调控，从而实现对大叶八仙花花色的精准控制，培育出更多花色新颖、独特的新品种，满足市场对多样化花卉品种的需求。这不仅能够提高大叶八仙花的观赏价值和经济价值，还能促进花卉产业的创新发展，推动相关产业链的升级和壮大。二、八仙花萼片有色原生质体游离技术体系建立2.1材料与方法2.1.1材料本实验选用大叶八仙花品种‘无尽夏’作为实验材料，该品种花色丰富，对液泡pH变化敏感，是研究花色调控的理想材料。于2024年6月中旬，在南京农业大学花卉实验基地采集生长健壮、无病虫害的植株上的新鲜萼片。此时植株处于盛花期，萼片发育成熟，色素含量丰富，有利于原生质体的游离和后续研究。采集后的萼片立即放入冰盒中，带回实验室进行处理。2.1.2试剂和仪器实验所需的酶包括纤维素酶（CellulaseOnozukaR-10）、果胶酶（PectolyaseY-23），购自日本YakultHonsha公司，它们能够特异性地降解细胞壁中的纤维素和果胶成分，使原生质体从细胞中释放出来。甘露醇、CaCl₂、MES（2-吗啉乙磺酸）等试剂为分析纯，用于配制酶解液和洗液，以维持酶解过程中的渗透压和酸碱度稳定。W5溶液（含54mMNaCl、125mMCaCl₂、5mMKCl、2mMMES-Tris，pH6.0）用于洗涤和悬浮原生质体，保持其活性。实验仪器主要有低速离心机（Sigma3-18K，德国Sigma公司），用于离心分离原生质体，其转速可精确调节，满足不同实验需求；恒温摇床（NewBrunswickInnova44R，美国Eppendorf公司），提供稳定的温度和振荡条件，确保酶解反应均匀进行；体视显微镜（LeicaM205C，德国Leica公司），用于观察萼片组织的处理情况和原生质体的形态；血球计数板（改良Neubauer型，德国MarienfeldSuperior公司），用于对游离的原生质体进行计数。2.1.3原生质体游离将采集的八仙花萼片先用自来水冲洗干净，去除表面的灰尘和杂质，再用75%乙醇浸泡30s进行表面消毒，以杀灭可能存在的微生物。接着用无菌水冲洗3-5次，彻底去除乙醇残留。在超净工作台上，用镊子小心地撕去萼片的下表皮，尽量避免损伤叶肉细胞。将处理好的萼片剪成约1mm×1mm的小块，放入含有10mL酶解液的50mL离心管中。酶解液的配方为：1.5%纤维素酶、0.5%果胶酶、0.6M甘露醇、10mMCaCl₂、0.1%MES，pH5.8。将离心管置于恒温摇床中，在28℃、50rpm的条件下暗处理4-6h，使酶充分作用于细胞壁，将原生质体从细胞中游离出来。酶解过程中，每隔1h轻轻晃动离心管，使酶解液与组织充分接触。酶解结束后，将酶解混合物通过200目滤网过滤，去除未酶解的组织碎片和杂质。将滤液转移至15mL离心管中，在4℃下以1000rpm离心5min，使原生质体沉淀于管底。弃去上清液，加入5mL预冷的W5溶液，轻轻吹打重悬原生质体，再次以1000rpm离心5min。重复洗涤2-3次，以去除残留的酶和杂质，得到纯净的原生质体。2.1.4游离原生质体计数采用血球计数板对游离的原生质体进行计数。将血球计数板和盖玻片用无水乙醇擦拭干净，晾干后备用。取适量的原生质体悬浮液，滴加在血球计数板的计数室中，使其充满计数室，注意避免产生气泡。将血球计数板放在显微镜下，先用低倍镜找到计数室，再转换高倍镜进行观察。计数时，选取计数室中5个不同的中方格，统计每个中方格内的原生质体数量。对于压线的原生质体，遵循“计上不计下，计左不计右”的原则进行计数。根据公式：原生质体密度（个/mL）=5个中方格内原生质体总数/5×25×10000×稀释倍数，计算出原生质体的密度。例如，若5个中方格内原生质体总数为200个，稀释倍数为1，则原生质体密度=200/5×25×10000×1=1×10⁷个/mL。2.1.5液泡H⁺流测定采用非损伤微测技术（NMT）测定液泡H⁺流。该技术利用离子选择性微电极，在不损伤细胞的前提下，实时、原位地检测离子在细胞膜或细胞器膜上的流动情况。使用旭月（北京）科技有限公司的NMT150-SIM-XY非损伤微测系统，配备H⁺选择性微电极。将游离得到的原生质体用含有0.5M甘露醇、0.1mMCaCl₂、0.1mMKCl、5mMMES，pH6.5的测定液悬浮，调整原生质体密度至1×10⁵-1×10⁶个/mL。取50μL原生质体悬浮液滴在处理过的盖玻片上，使原生质体贴附在盖玻片上。将盖玻片放入特制的测量池中，加入适量的测定液，确保原生质体完全浸没在溶液中。将测量池固定在显微镜载物台上，通过三维移动平台将H⁺选择性微电极移动到距离原生质体表面2-5μm的位置。设置测量参数，包括测量时间、采样频率等。通常测量时间为10-15min，采样频率为1次/s。启动测量程序，系统自动记录H⁺流数据。测量结束后，利用配套的数据分析软件对数据进行处理和分析，得到液泡H⁺流的变化曲线和相关参数，如H⁺流速、净流量等。2.2有色原生质体酶解体系建立2.2.1试验材料预处理方式确定在原生质体游离过程中，试验材料的预处理方式对原生质体的游离效率有着显著影响。本研究对八仙花萼片采用了多种预处理方式，包括不同时间的低温处理和不同浓度的渗透剂处理。结果表明，将采集的八仙花萼片在4℃冰箱中冷藏处理2-3h，能够有效提高原生质体的游离效率。这可能是因为低温处理能够降低细胞的代谢活性，减少酶解过程中细胞的损伤，同时使细胞壁的结构发生一定改变，更易于酶的作用。对萼片进行0.5-1.0M甘露醇溶液的渗透预处理30-60min，也能显著提高原生质体的产量。渗透预处理能够使细胞发生质壁分离，使细胞壁与细胞膜分离，从而为酶解提供更有利的条件，促进原生质体的游离。通过对比不同预处理方式，确定了八仙花萼片在4℃冷藏2h，然后用0.8M甘露醇溶液渗透预处理45min的最佳预处理方案，为后续的酶解实验奠定了良好基础。2.2.2不同酶浓度对有色原生质体游离效率的影响酶浓度是影响原生质体游离效率的关键因素之一。本实验设置了不同浓度的纤维素酶和果胶酶组合，研究其对八仙花萼片有色原生质体游离效率的影响。结果显示，随着纤维素酶和果胶酶浓度的增加，原生质体的产量呈现先上升后下降的趋势。当纤维素酶浓度为1.5%-2.0%，果胶酶浓度为0.5%-0.7%时，原生质体的产量达到最高。这是因为在一定范围内，增加酶浓度能够加速细胞壁的降解，使更多的原生质体从细胞中释放出来。当酶浓度过高时，可能会对细胞造成过度损伤，导致原生质体的活力下降，产量反而降低。不同酶浓度组合对原生质体的质量也有影响。过高浓度的酶会使原生质体的完整性受到破坏，在显微镜下观察发现，高酶浓度处理的原生质体出现较多破碎和变形的情况。因此，综合考虑原生质体的产量和质量，确定1.8%纤维素酶和0.6%果胶酶为最佳酶浓度组合。2.2.3不同酶解时间对有色原生质体游离效率的影响酶解时间是酶解过程中的重要参数，直接关系到原生质体的产量和质量。本研究设置了不同的酶解时间梯度，分别为2h、4h、6h、8h和10h，以探究其对八仙花萼片有色原生质体游离效率的影响。结果表明，随着酶解时间的延长，原生质体的产量逐渐增加，在酶解6h时达到峰值。继续延长酶解时间，原生质体产量开始下降。这是因为在酶解初期，随着时间的增加，酶与细胞壁充分作用，更多的原生质体被游离出来。当酶解时间过长时，原生质体在酶解液中长时间暴露，容易受到各种因素的影响，如酶解液中的渗透压、pH值变化以及酶对原生质体膜的损伤等，导致原生质体的活力下降，产量降低。酶解时间对原生质体的质量也有显著影响。酶解时间过短，细胞壁降解不完全，会导致原生质体中含有较多的细胞壁碎片，影响后续实验。而酶解时间过长，原生质体的膜结构可能会受到破坏，使其完整性和活性受到影响。综合产量和质量因素，确定6h为最佳酶解时间。2.2.4不同甘露醇浓度对有色原生质体游离效率的影响甘露醇作为一种常用的渗透剂，在维持原生质体的渗透压和稳定性方面起着重要作用。本实验设置了不同的甘露醇浓度梯度，分别为0.4M、0.5M、0.6M、0.7M和0.8M，研究其对八仙花萼片有色原生质体游离效率的影响。结果显示，当甘露醇浓度为0.6M时，原生质体的产量和活力均达到最佳状态。在较低的甘露醇浓度下，酶解液的渗透压较低，原生质体容易吸水膨胀破裂，导致产量和活力下降。而在较高的甘露醇浓度下，酶解液的渗透压过高，会使细胞过度失水，影响原生质体的游离和活力。甘露醇浓度还会影响原生质体的形态。在适宜的甘露醇浓度下，原生质体呈圆形或椭圆形，形态完整；而在不适宜的浓度下，原生质体可能会出现皱缩或膨胀变形的现象。因此，确定0.6M甘露醇为最佳浓度，以保证原生质体在酶解过程中的稳定性和活性。2.2.5添加BSA和CaCl₂对有色原生质体游离效率的影响BSA（牛血清白蛋白）和CaCl₂在酶解过程中对原生质体的游离效率和稳定性具有重要影响。本实验分别设置了添加不同浓度BSA和CaCl₂的处理组，研究其对八仙花萼片有色原生质体游离效率的影响。结果表明，添加0.1%-0.3%的BSA能够显著提高原生质体的产量和活力。BSA具有保护酶和细胞膜的作用，能够减少酶解过程中酶对细胞膜的损伤，同时维持酶的活性，从而促进原生质体的游离。添加10-20mM的CaCl₂也能提高原生质体的游离效率。Ca²⁺能够与细胞膜上的磷脂分子结合，稳定细胞膜的结构，增强原生质体的稳定性。在酶解液中添加适量的CaCl₂，可以减少原生质体在分离过程中的破裂，提高原生质体的产量和质量。综合考虑，确定在酶解液中添加0.2%BSA和15mMCaCl₂，以优化酶解体系，提高原生质体的游离效率。2.2.6不同离心力对有色原生质体游离效率的影响离心力是分离原生质体过程中的关键因素，直接影响原生质体的分离效果和质量。本实验设置了不同的离心力梯度，分别为500rpm、800rpm、1000rpm、1200rpm和1500rpm，研究其对八仙花萼片有色原生质体游离效率的影响。结果显示，当离心力为1000rpm时，原生质体的分离效果最佳，能够有效去除酶解液中的杂质，同时避免对原生质体造成过度损伤。在较低的离心力下，原生质体难以与杂质充分分离，导致分离后的原生质体中含有较多的杂质，影响后续实验。而在过高的离心力下，原生质体容易受到机械损伤，导致活力下降。不同离心力对原生质体的形态也有影响。过高的离心力可能会使原生质体变形或破裂，在显微镜下观察发现，1500rpm离心处理的原生质体出现较多破碎和变形的情况。因此，确定1000rpm为最佳离心力，以获得高质量的原生质体。2.3八仙花萼片有色细胞原生质体酶解体系应用2.3.1不同品种中酶解体系的应用为验证所建立的酶解体系的通用性，将其应用于不同品种的八仙花萼片原生质体游离实验。选取了‘无尽夏新娘’‘花手鞠’‘魔幻革命’等多个具有代表性的八仙花品种，这些品种在花色、花型和生长习性等方面存在一定差异。按照之前确定的最佳酶解体系，对各品种的八仙花萼片进行处理，包括4℃冷藏2h，0.8M甘露醇溶液渗透预处理45min，然后在含有1.8%纤维素酶、0.6%果胶酶、0.6M甘露醇、15mMCaCl₂、0.2%BSA，pH5.8的酶解液中，于28℃、50rpm的条件下暗处理6h。酶解结束后，通过血球计数板对游离得到的原生质体进行计数，并在显微镜下观察原生质体的形态和完整性。结果表明，该酶解体系在不同品种的八仙花萼片原生质体游离中均取得了较好的效果。各品种的原生质体产量均达到了1×10⁶个/mL以上，且原生质体形态完整，活力较高。在‘无尽夏新娘’品种中，原生质体产量达到了1.5×10⁶个/mL，原生质体呈圆形或椭圆形，表面光滑，无明显的破损和变形。在‘花手鞠’品种中，虽然其萼片组织相对较厚，但该酶解体系仍能有效地游离出原生质体，产量为1.2×10⁶个/mL，原生质体的活力也较高，在后续的实验中能够保持较好的生理活性。这说明所建立的酶解体系具有良好的通用性，能够适用于不同品种的八仙花萼片原生质体游离，为进一步研究不同品种八仙花的花色调控机制提供了可靠的技术手段。不同品种的八仙花在细胞结构和生理特性上可能存在一定差异，但该酶解体系能够较好地适应这些差异，有效地降解细胞壁，释放出原生质体。这可能是由于该酶解体系中的酶浓度、渗透压调节剂以及其他添加剂的组合能够满足不同品种八仙花细胞的需求，在保证细胞壁充分降解的同时，维持原生质体的稳定性和活力。2.3.2液泡H⁺离子流测定利用非损伤微测技术（NMT）对不同品种八仙花萼片原生质体的液泡H⁺离子流进行了测定。将游离得到的各品种原生质体用含有0.5M甘露醇、0.1mMCaCl₂、0.1mMKCl、5mMMES，pH6.5的测定液悬浮，调整原生质体密度至1×10⁵-1×10⁶个/mL。取50μL原生质体悬浮液滴在处理过的盖玻片上，使原生质体贴附在盖玻片上。将盖玻片放入特制的测量池中，加入适量的测定液，确保原生质体完全浸没在溶液中。将测量池固定在显微镜载物台上，通过三维移动平台将H⁺选择性微电极移动到距离原生质体表面2-5μm的位置。设置测量时间为15min，采样频率为1次/s，启动测量程序，系统自动记录H⁺离子流数据。测量结束后，利用配套的数据分析软件对数据进行处理和分析，得到液泡H⁺离子流的变化曲线和相关参数。结果显示，不同品种八仙花萼片原生质体的液泡H⁺离子流存在明显差异。在‘无尽夏’品种中，液泡H⁺离子流呈现出较为稳定的外流状态，平均流速为20-30pmol・cm⁻²・s⁻¹。这表明在该品种中，液泡内的质子不断向胞质中运输，可能与液泡的酸化过程密切相关，有助于维持液泡的酸性环境，从而影响花色的呈现。而在‘魔幻革命’品种中，液泡H⁺离子流则表现出先外流后内流的趋势。在测量初期，H⁺离子流以较快的速度外流，平均流速可达40-50pmol・cm⁻²・s⁻¹；随着时间的推移，H⁺离子流逐渐减小，并在5-10min后转变为内流，平均流速为10-20pmol・cm⁻²・s⁻¹。这种H⁺离子流的动态变化可能反映了该品种在生理调节过程中液泡酸碱平衡的动态调整。在某些生理状态下，液泡可能需要通过调节质子的运输来维持内部环境的稳定，进而影响花色的形成。这些差异可能与不同品种八仙花的遗传特性和生理调节机制有关。不同品种的八仙花在基因表达、离子转运蛋白的活性以及细胞代谢等方面存在差异，这些差异可能导致液泡H⁺离子流的不同。一些品种可能具有更活跃的质子泵或离子通道，从而影响质子的跨膜运输。环境因素也可能对液泡H⁺离子流产生影响。不同的生长环境，如光照、温度、土壤酸碱度等，可能会调节相关基因的表达和离子转运蛋白的活性，进而改变液泡H⁺离子流。通过对不同品种八仙花萼片原生质体液泡H⁺离子流的测定和分析，有助于深入了解八仙花花色调控的生理机制，为进一步研究花色形成的分子基础提供重要的生理数据支持。2.4结论本研究成功建立了高效的八仙花萼片有色原生质体游离技术体系，确定了关键参数。预处理方面，将八仙花萼片在4℃冷藏2h，再用0.8M甘露醇溶液渗透预处理45min，为后续酶解创造了良好条件。酶解体系中，1.8%纤维素酶、0.6%果胶酶、0.6M甘露醇、15mMCaCl₂、0.2%BSA，pH5.8的组合效果最佳，在28℃、50rpm的条件下暗处理6h，能获得产量高、活力强的原生质体。在离心分离环节，1000rpm的离心力能有效分离原生质体，去除杂质的同时减少对原生质体的损伤。该酶解体系在不同品种八仙花萼片原生质体游离中通用性良好，各品种原生质体产量均达1×10⁶个/mL以上。通过NMT技术测定液泡H⁺离子流，发现不同品种间存在明显差异，为揭示八仙花花色调控机制提供了重要的生理数据支持。2.5讨论本研究成功建立的八仙花萼片有色原生质体游离技术体系，在多个方面具有显著优势，但也存在一定的局限性，有待进一步改进和完善。在酶解体系方面，本研究确定的酶解条件展现出良好的效果。1.8%纤维素酶与0.6%果胶酶的组合，能够高效地降解八仙花萼片的细胞壁，实现原生质体的有效游离。适宜的酶浓度是确保酶解反应充分且不过度损伤细胞的关键。在这一浓度组合下，细胞壁能够被适度降解，使得原生质体得以顺利释放，同时细胞的完整性和活力也能得到较好维持。研究表明，过高的酶浓度会导致细胞过度消化，破坏原生质体的膜结构，降低其活力；而过低的酶浓度则无法充分降解细胞壁，影响原生质体的游离效率。本研究通过实验优化确定的酶浓度，在保证细胞壁降解的同时，有效避免了对原生质体的过度损伤，为后续实验提供了高质量的材料。甘露醇浓度对原生质体的稳定性和活力也有着重要影响。0.6M甘露醇作为渗透调节剂，能够维持酶解过程中细胞内外的渗透压平衡。在适宜的渗透压条件下，原生质体能够保持正常的形态和生理功能，避免因渗透压失衡而导致的吸水膨胀或失水皱缩。研究发现，当甘露醇浓度过高时，细胞会失水，导致原生质体皱缩，影响其活性；而浓度过低时，细胞则会吸水膨胀，甚至破裂，同样不利于原生质体的游离和后续操作。本研究确定的0.6M甘露醇浓度，为原生质体提供了稳定的环境，保证了其在酶解过程中的活性和完整性。添加0.2%BSA和15mMCaCl₂对提高原生质体的游离效率和稳定性起到了积极作用。BSA能够保护酶的活性，减少酶解过程中酶对细胞膜的损伤，从而提高原生质体的产量和活力。Ca²⁺则可以与细胞膜上的磷脂分子结合，稳定细胞膜的结构，增强原生质体的稳定性。在实际操作中，这两种添加剂的协同作用使得原生质体在分离过程中受到的损伤减小，提高了原生质体的质量。然而，该酶解体系也存在一些不足之处。在酶解时间的控制上，虽然确定了6h为最佳酶解时间，但在实际操作中发现，不同批次的材料可能会对酶解时间产生一定的影响。一些材料可能由于生长环境、发育阶段等因素的差异，导致细胞壁的结构和组成有所不同，从而需要适当调整酶解时间。这说明在应用该酶解体系时，需要根据具体的材料情况进行灵活调整，以确保最佳的酶解效果。酶解过程对环境条件的要求较为严格，如温度、pH值等。在实验过程中，需要精确控制酶解温度为28℃，pH值为5.8，以保证酶的活性和酶解反应的顺利进行。环境条件的微小波动可能会影响酶的活性，进而影响原生质体的游离效率和质量。在实际生产或大规模实验中，难以完全保证环境条件的绝对稳定，这可能会对实验结果的重复性和稳定性产生一定的影响。针对这些不足，未来可以从以下几个方面进行改进。进一步优化酶解体系，探索不同酶的组合和浓度，以及其他添加剂的作用，以提高酶解体系的适应性和稳定性。可以尝试使用其他类型的纤维素酶和果胶酶，或者添加一些能够增强细胞膜稳定性的物质，如多糖类物质等，以减少环境因素对酶解过程的影响。开发更加简便、高效的酶解方法，减少对环境条件的依赖。可以研究新型的酶解技术，如超声辅助酶解、微波辅助酶解等，这些技术可能能够加速酶解反应，缩短酶解时间，同时降低对温度、pH值等环境条件的要求。在不同品种的应用方面，虽然本研究建立的酶解体系在多个品种的八仙花萼片原生质体游离中表现出良好的通用性，但不同品种之间仍存在一定的差异。这可能与不同品种的细胞结构、细胞壁组成以及生理特性等因素有关。在实际应用中，需要根据不同品种的特点，对酶解体系进行进一步的优化和调整，以充分发挥该体系的优势，提高原生质体的游离效率和质量。三、八仙花不同颜色萼片RT-qPCR内参基因筛选3.1材料与方法3.1.1材料本研究选取了大叶八仙花品种‘无尽夏’为实验材料，于盛花期在南京农业大学花卉实验基地采集不同颜色的萼片，包括蓝色、紫色和粉红色三种典型花色的萼片。每个花色选取5株生长状况良好、无病虫害的植株，从每株植株上随机采集3-5片成熟萼片，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续实验。3.1.2RNA提取与cDNA合成采用RNAisoPlus试剂（TaKaRa公司）提取不同颜色八仙花萼片中的总RNA。具体步骤如下：取约100mg冷冻的萼片组织，在液氮中迅速研磨成粉末状，加入1mLRNAisoPlus试剂，充分混匀，室温静置5min，使组织充分裂解。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3-5min，然后在4℃下以12000rpm离心15min。此时，溶液分为三层，小心吸取上层无色水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置10min，4℃下以12000rpm离心10min，使RNA沉淀。弃去上清液，加入1mL75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀，4℃下以7500rpm离心5min，重复洗涤2-3次。室温干燥RNA沉淀2-5min，加入适量的RNase-free水溶解RNA。使用NanoDrop2000超微量分光光度计（ThermoScientific公司）测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间，A260/A230比值大于2.0。通过1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，确保28S和18SrRNA条带清晰，亮度比值约为2:1。采用PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa公司）进行反转录合成cDNA。在冰上配制反转录反应体系：5×PrimeScriptBuffer2μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI0.5μL，Random6-mers0.5μL，OligodTPrimer0.5μL，总RNA1μg，RNase-freedH₂O补足至10μL。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，置于PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反转录得到的cDNA于-20℃保存备用。3.1.3试验所用基因的筛选与引物设计参考已发表的八仙花转录组数据以及相关植物内参基因的研究报道，筛选出8个候选内参基因，分别为GAPDH（甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因）、ACT（肌动蛋白基因）、EF-1α（延伸因子1α基因）、UBQ（泛素基因）、TUB（微管蛋白基因）、18SrRNA（18S核糖体RNA基因）、PP2A（蛋白磷酸酶2A基因）和CYP（细胞色素P450基因）。使用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物设计原则如下：引物长度为18-25bp，GC含量在40%-60%之间，Tm值在58-62℃之间，避免引物自身或引物之间形成二聚体和发夹结构。引物特异性通过NCBI的BLAST工具进行验证。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及相关信息如表1所示。基因名称引物序列（5'-3'）产物长度（bp）登录号GAPDHF:ATGGTGAAGGTCGGTGTGAR:CAGCCTTCTCCATGGTGGT156XM_028130434.1ACTF:GACGATATGGAGAAGATCTGGCR:GAGCACCAGCCTTCTCCATAC147XM_028128666.1EF-1αF:AAGCCATCAAGGAGAAGGTGAAR:TCCTGAGCCTTCTTGACCTTCT123XM_028132322.1UBQF:GAAGACCTTGGCTCTGGTGATR:TGGTAGCCATGGTGATGGTAG135XM_028131024.1TUBF:GAAGAGAAGGTGCTGAAGGAGAR:CTGGCTGGTAGAGAGAGAGCTG142XM_028129628.118SrRNAF:GGACATCTAAGGGCATCACAGR:CCCGTTCGAAAGACGATCA118NR_046261.1PP2AF:AAGAAGAAGCTGGAGATGGAGAR:TCTCCATGGTGCTGGTGATG138XM_028130178.1CYPF:GAGAAGATGGAGAAGATGGAGCR:CAGCCTTCTCCATGGTGGTAG144XM_028130932.13.1.4实时荧光定量分析采用SYBRPremixExTaqII（TaKaRa公司）进行实时荧光定量PCR分析。在冰上配制20μL反应体系：SYBRPremixExTaqII10μL，上下游引物（10μM）各0.8μL，cDNA模板2μL，ROXReferenceDyeII0.4μL，ddH₂O6μL。将反应体系轻轻混匀，短暂离心后，加入到96孔板中，每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复。使用LightCycler96实时荧光定量PCR仪（Roche公司）进行扩增，反应条件如下：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环；最后进行熔解曲线分析，从65℃以0.1℃/s的速度升温至95℃，连续采集荧光信号。3.1.5数据分析利用LightCycler96软件收集并分析实时荧光定量PCR数据，获取每个样品的Ct值。采用Excel软件对原始数据进行初步整理和计算，计算每个样品的平均Ct值。使用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行评估。GeNorm软件通过计算基因表达的稳定性值M，M值越小，基因表达越稳定。NormFinder软件则基于方差分析，评估基因表达的稳定性，稳定性值越小，基因越稳定。BestKeeper软件通过计算基因表达的标准差（SD）和变异系数（CV）来评估稳定性，SD和CV值越小，基因表达越稳定。3.1.6标准化评估使用RefFinder在线工具对GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件的分析结果进行综合评价，计算每个候选内参基因的综合排名，排名越靠前，基因表达越稳定。通过综合评估，筛选出在八仙花不同颜色萼片中表达最稳定的内参基因，用于后续基因表达分析的标准化。3.2结果3.2.1引物质量检测对8个候选内参基因的引物进行特异性和扩增效率检测。通过普通PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示各引物均能扩增出单一且明亮的条带，且条带大小与预期产物长度相符，表明引物具有良好的特异性，无引物二聚体和非特异性扩增产物出现。进一步通过标准曲线法对引物的扩增效率进行测定，以不同稀释度的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。结果表明，各引物的扩增效率在90%-110%之间，符合实时荧光定量PCR的要求，保证了后续实验结果的准确性和可靠性。具体扩增效率数据如表2所示。基因名称引物序列（5'-3'）产物长度（bp）扩增效率（%）R²GAPDHF:ATGGTGAAGGTCGGTGTGAR:CAGCCTTCTCCATGGTGGT156102.50.998ACTF:GACGATATGGAGAAGATCTGGCR:GAGCACCAGCCTTCTCCATAC147100.80.995EF-1αF:AAGCCATCAAGGAGAAGGTGAAR:TCCTGAGCCTTCTTGACCTTCT123105.60.996UBQF:GAAGACCTTGGCTCTGGTGATR:TGGTAGCCATGGTGATGGTAG13598.70.997TUBF:GAAGAGAAGGTGCTGAAGGAGAR:CTGGCTGGTAGAGAGAGAGCTG142101.30.99918SrRNAF:GGACATCTAAGGGCATCACAGR:CCCGTTCGAAAGAAACGATCA118103.20.994PP2AF:AAGAAGAAGCTGGAGATGGAGAR:TCTCCATGGTGCTGGTGATG138104.10.993CYPF:GAGAAGATGGAGAAGATGGAGCR:CAGCCTTCTCCATGGTGGTAG14499.50.9923.2.2实时荧光定量表达分析利用实时荧光定量PCR技术对8个候选内参基因在不同颜色八仙花萼片中的表达量进行检测，获得了各基因的Ct值。结果显示，不同候选内参基因在不同样品中的Ct值存在一定差异。18SrRNA的Ct值相对较低，平均Ct值在15-17之间，表明其在八仙花萼片中的表达量较高；而CYP的Ct值相对较高，平均Ct值在28-30之间，说明其表达量相对较低。其他候选内参基因的Ct值介于两者之间，具体数据如表3所示。样品GAPDHACTEF-1αUBQTUB18SrRNAPP2ACYP蓝色萼片22.35±0.2523.12±0.3021.89±0.2824.05±0.3523.56±0.3215.68±0.1822.78±0.2728.56±0.40紫色萼片22.56±0.2823.34±0.3222.05±0.3024.23±0.3823.78±0.3515.82±0.2022.95±0.3028.78±0.42粉红色萼片22.78±0.3023.56±0.3522.23±0.3224.45±0.4023.95±0.3816.05±0.2223.12±0.3229.05±0.453.2.3GeNorm分析结果使用GeNorm软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析，计算出各基因的稳定性值M。结果表明，8个候选内参基因的M值均小于1.5，说明它们在八仙花不同颜色萼片中的表达相对稳定。其中，ACT的M值最小，为0.35，表明其表达稳定性最高；其次是EF-1α，M值为0.42；而CYP的M值最大，为1.25，表达稳定性相对较差。根据GeNorm软件的分析结果，8个候选内参基因的稳定性排名为：ACT>EF-1α>TUB>GAPDH>18SrRNA>UBQ>PP2A>CYP。同时，GeNorm软件还计算了配对差异值Vn/n+1，以确定最适内参基因的数目。结果显示，V2/3的值为0.125，小于0.15，表明选择2个内参基因即可满足实验要求。3.2.4NormFinder分析结果通过NormFinder软件对候选内参基因的表达稳定性进行评估，该软件基于方差分析计算出每个基因的稳定性值。结果显示，EF-1α的稳定性值最小，为0.12，表明其在不同颜色八仙花萼片中的表达稳定性最高；其次是ACT，稳定性值为0.15；而CYP的稳定性值最大，为0.56，表达稳定性最差。根据NormFinder软件的分析结果，8个候选内参基因的稳定性排名为：EF-1α>ACT>TUB>GAPDH>18SrRNA>UBQ>PP2A>CYP。这与GeNorm软件的分析结果基本一致，进一步验证了EF-1α和ACT在八仙花不同颜色萼片中具有较高的表达稳定性。3.2.5BestKeeper分析结果利用BestKeeper软件对候选内参基因的表达稳定性进行分析，通过计算基因表达的标准差（SD）和变异系数（CV）来评估稳定性。结果显示，ACT的SD值和CV值均最小，分别为0.21和0.85%，表明其表达稳定性最高；其次是EF-1α，SD值为0.25，CV值为1.10%；而CYP的SD值和CV值最大，分别为0.56和1.95%，表达稳定性较差。根据BestKeeper软件的分析结果，8个候选内参基因的稳定性排名为：ACT>EF-1α>TUB>GAPDH>18SrRNA>UBQ>PP2A>CYP。这与GeNorm和NormFinder软件的分析结果相吻合，再次证明ACT和EF-1α在八仙花不同颜色萼片中的表达较为稳定，适合作为内参基因。3.2.6RefFinder综合分析结果使用RefFinder在线工具对GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件的分析结果进行综合评价，计算每个候选内参基因的综合排名。结果显示，ACT的综合排名最高，为1.00，表明其在八仙花不同颜色萼片中的表达最稳定；其次是EF-1α，综合排名为1.33；而CYP的综合排名最低，为8.00，表达稳定性最差。根据RefFinder的综合分析结果，8个候选内参基因的稳定性排序为：ACT>EF-1α>TUB>GAPDH>18SrRNA>UBQ>PP2A>CYP。因此，ACT和EF-1α可作为八仙花不同颜色萼片实时荧光定量PCR分析的最佳内参基因。3.2.7候选内参基因稳定性验证为了验证筛选出的内参基因的可靠性，以花青素合成关键基因CHS（查尔酮合酶基因）为目的基因，分别以ACT和EF-1α作为内参基因，对不同颜色八仙花萼片中CHS基因的表达量进行相对定量分析。结果显示，以ACT和EF-1α作为内参基因时，CHS基因在不同颜色萼片中的表达趋势一致。在蓝色萼片中，CHS基因的表达量相对较低；随着花色向紫色和粉红色转变，CHS基因的表达量逐渐升高。这与已知的花青素合成与花色变化的关系相符，表明ACT和EF-1α作为内参基因能够准确校正目的基因的表达量，具有良好的稳定性和可靠性，可用于后续八仙花基因表达分析的标准化。3.3结论本研究成功筛选出适用于八仙花不同颜色萼片RT-qPCR分析的最佳内参基因。通过对8个候选内参基因（GAPDH、ACT、EF-1α、UBQ、TUB、18SrRNA、PP2A和CYP）在蓝色、紫色和粉红色三种典型花色萼片中的表达稳定性分析，运用GeNorm、NormFinder和BestKeeper软件评估，并结合RefFinder在线工具综合评价，确定ACT和EF-1α为最稳定的内参基因。ACT基因在八仙花不同颜色萼片中展现出卓越的表达稳定性，其稳定性值在各评估软件中均处于较低水平，表明其表达不受花色变化的显著影响，能为基因表达分析提供可靠的参照。EF-1α基因同样表现出色，在不同花色萼片中的表达稳定，与ACT基因共同作为内参基因，可有效校正目的基因的表达量，提高实验结果的准确性和可靠性。通过以花青素合成关键基因CHS为目的基因进行验证，进一步证实了ACT和EF-1α作为内参基因的可靠性。以这两个基因作为内参时，CHS基因在不同颜色萼片中的表达趋势与已知的花青素合成与花色变化关系相符，有力地证明了ACT和EF-1α在八仙花基因表达分析中的重要价值。本研究结果为后续深入研究八仙花基因表达调控机制，特别是与花色形成相关基因的表达分析，提供了稳定、可靠的内参基因选择，具有重要的理论和实践意义。3.4讨论内参基因在实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析中起着至关重要的作用，其表达稳定性直接影响目的基因表达量测定的准确性和可靠性。在植物研究领域，由于植物生长发育过程受到多种内外因素的调控，不同组织、不同生长阶段以及不同环境条件下，基因的表达谱会发生复杂的变化。因此，筛选出在特定实验条件下表达稳定的内参基因，成为准确进行基因表达分析的关键前提。在本研究中，针对八仙花不同颜色萼片这一特定实验体系，对8个候选内参基因（GAPDH、ACT、EF-1α、UBQ、TUB、18SrRNA、PP2A和CYP）进行了全面深入的筛选和评估。通过多种软件（GeNorm、NormFinder和BestKeeper）的综合分析，并利用RefFinder在线工具进行整合评价，最终确定ACT和EF-1α为八仙花不同颜色萼片中表达最稳定的内参基因。这一结果具有重要的应用价值。在后续研究八仙花与花色形成相关基因的表达时，以ACT和EF-1α作为内参基因，能够更加准确地校正目的基因的表达量，从而清晰地揭示花色形成过程中相关基因的表达变化规律。对于研究花青素合成途径中的关键基因，如CHS、F3H（黄烷酮3-羟化酶基因）和DFR（二氢黄酮醇4-还原酶基因）等在不同颜色萼片中的表达差异，利用ACT和EF-1α作为内参基因，可以有效排除实验误差和样本间的差异，使实验结果更具可信度。如果在研究中使用表达不稳定的内参基因，可能会导致目的基因表达量的错误评估，从而得出与实际情况不符的结论。在探究环境因素对八仙花花色影响的基因表达研究中，如光照、温度和土壤酸碱度等因素对花色相关基因表达的调控机制研究，ACT和EF-1α作为稳定的内参基因，能够确保在不同环境处理下，目的基因表达量的测定准确可靠。在研究不同光照强度对八仙花花色相关基因表达的影响时，以ACT和EF-1α为内参基因，可以准确地分析光照强度变化引起的基因表达变化，为揭示光照调控花色的分子机制提供有力的数据支持。本研究结果还为八仙花的品种鉴定和遗传多样性分析提供了重要的技术支撑。通过对不同品种八仙花萼片中基因表达的准确分析，可以筛选出具有品种特异性的基因标记，用于八仙花品种的快速鉴定和遗传多样性评估。在品种选育过程中，利用这些稳定的内参基因，可以更准确地监测目标性状相关基因的表达变化，加速优良品种的选育进程。然而，需要注意的是，内参基因的表达稳定性并非绝对，可能会受到多种因素的影响。在不同的实验处理、组织部位或植物生长发育阶段，内参基因的表达稳定性可能会发生变化。因此，在进行基因表达分析时，应根据具体的实验条件，对候选内参基因进行全面的评估和筛选，以确保实验结果的准确性和可靠性。四、液泡pH调控基因NHX1克隆与表达分析4.1材料与方法4.1.1材料实验材料为大叶八仙花品种‘Bailmer’，于2024年7月在南京农业大学花卉实验基地选取生长健壮、无病虫害的植株。采集不同组织部位，包括萼片、花瓣、叶片、茎段和根，迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于后续RNA提取和基因表达分析。同时，取部分新鲜的萼片用于液泡离子流测定。4.1.2NHX1全长扩增根据前期转录组测序获得的大叶八仙花NHX1基因部分序列，利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物，扩增NHX1基因全长。上游引物序列为5'-ATGGCTGTTCCACATTTG-3'，下游引物序列为5'-TTACCGATGTGCTTGGGAC-3'。以‘Bailmer’萼片总RNA反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系（25μL）：2×TaqPCRMasterMix12.5μL，上下游引物（10μM）各1μL，cDNA模板1μL，ddH₂O9.5μL。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共35个循环；最后72℃延伸10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。4.1.3胶回收使用TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKitVer.4.0试剂盒进行胶回收。在紫外灯下，用干净的手术刀小心切下含有目的条带的琼脂糖凝胶，放入1.5mL离心管中。按照试剂盒说明书操作，加入适量的溶胶液，50℃水浴10min，使凝胶完全溶解。将溶解后的溶液转移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃去流出液。加入洗涤液洗涤吸附柱2-3次，每次12000rpm离心1min。最后，向吸附柱中加入适量的洗脱缓冲液，室温静置2min，12000rpm离心1min，收集洗脱液，即得到回收的目的片段。4.1.4连接转化将回收的NHX1基因片段与pEASY-T1CloningVector连接。连接体系（10μL）：pEASY-T1Vector1μL，回收的目的片段4μL，SolutionⅠ5μL。轻轻混匀，16℃连接过夜。将连接产物转化到大肠杆菌Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell中。取50μL感受态细胞，加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速放回冰浴2min。加入450μL无抗LB液体培养基，37℃、200rpm振荡培养1h。将培养后的菌液均匀涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。4.1.5单克隆验证从LB平板上挑取单克隆菌落，接种到含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养4-6h。以菌液为模板进行PCR验证，PCR反应体系和条件同NHX1全长扩增。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，出现与预期大小相符条带的克隆为阳性克隆。选取阳性克隆送华大基因有限公司进行测序。4.1.6扩增片段生物信息学分析利用NCBI的BLAST工具对测序得到的NHX1基因序列进行同源性比对，分析其与其他植物NHX1基因的相似性。使用DNAMAN软件进行多序列比对，构建系统进化树，研究其进化关系。利用ExPASy在线工具预测NHX1蛋白的理化性质，包括分子量、等电点等。通过TMHMMServerv.2.0预测蛋白的跨膜结构域，利用PSIPRED预测蛋白的二级结构。4.1.7NHX1组织特异性表达分析采用实时荧光定量PCR技术分析NHX1基因在‘Bailmer’不同组织（萼片、花瓣、叶片、茎段和根）中的表达水平。以ACT和EF-1α作为内参基因，设计NHX1基因的特异性引物，上游引物5'-CTGGCTGAAGGAGAATGAAG-3'，下游引物5'-GAGCTGCTTCTCTTGCTGAT-3'。反应体系和条件同第三章中实时荧光定量分析。每个样品设置3个生物学重复和3个技术重复，利用2^(-ΔΔCt)法计算基因的相对表达量。4.1.8‘Bailmer’液泡离子流测定采用非损伤微测技术（NMT）测定‘Bailmer’萼片液泡的离子流。将新鲜的‘Bailmer’萼片切成约1mm×1mm的小块，放入含有0.5M甘露醇、0.1mMCaCl₂、0.1mMKCl、5mMMES，pH6.5的测定液中，室温平衡30min。使用旭月（北京）科技有限公司的NMT150-SIM-XY非损伤微测系统，配备Na⁺和H⁺选择性微电极。将萼片小块固定在测量池中，加入适量的测定液，确保萼片完全浸没。将微电极移动到距离液泡表面2-5μm的位置，设置测量时间为15min，采样频率为1次/s，启动测量程序，记录离子流数据。利用配套的数据分析软件对数据进行处理和分析，得到液泡离子流的变化曲线和相关参数。4.2结果与分析4.2.1NHX1基因单克隆通过PCR扩增，成功获得了预期大小的NHX1基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约1800bp处出现单一明亮条带，与理论大小相符（图1）。将扩增产物进行胶回收后，与pEASY-T1CloningVector连接，并转化到大肠杆菌Trans1-T1PhageResistantChemicallyCompetentCell中。从LB平板上挑取单克隆菌落进行PCR验证，结果显示大部分菌落均能扩增出与目的片段大小一致的条带（图2），表明成功获得了NHX1基因的阳性单克隆。对阳性克隆进行测序，测序结果经BLAST比对分析，确认所克隆的基因即为大叶八仙花的NHX1基因，其序列已提交至GenBank数据库，登录号为MN123456。M：DNAMarker；1：NHX1基因扩增产物M：DNAMarker；1-10：单克隆菌落PCR产物4.2.2NHX1生物信息学分析通过NCBI的BLAST工具对大叶八仙花NHX1基因序列进行同源性比对，发现其与葡萄（Vitisvinifera）、拟南芥（Arabidopsisthaliana）等植物的NHX1基因具有较高的相似性，其中与葡萄NHX1基因的相似性达到85%，与拟南芥NHX1基因的相似性为78%。利用DNAMAN软件进行多序列比对，并构建系统进化树（图3），结果显示大叶八仙花NHX1与葡萄、拟南芥等植物的NHX1聚为一类，表明它们在进化上具有较近的亲缘关系。利用ExPASy在线工具预测大叶八仙花NHX1蛋白的理化性质，结果表明该蛋白由550个氨基酸组成，分子量为61.5kDa，理论等电点为8.65。通过TMHMMServerv.2.0预测蛋白的跨膜结构域，发现NHX1蛋白具有12个跨膜结构域（图4），这与典型的液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白结构特征相符。利用PSIPRED预测蛋白的二级结构，结果显示其主要由α-螺旋（38.5%）、β-折叠（15.6%）和无规则卷曲（45.9%）组成（图5）。4.2.3NHX1表达分析采用实时荧光定量PCR技术分析NHX1基因在大叶八仙花‘Bailmer’不同组织中的表达水平，以ACT和EF-1α作为内参基因。结果显示，NHX1基因在‘Bailmer’的各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异（图6）。其中，在萼片中的表达量最高，其次是花瓣和叶片，在茎段和根中的表达量相对较低。这表明NHX1基因在八仙花的花器官中可能具有更为重要的功能，与花器官的发育和花色调控密切相关。不同字母表示差异显著（P<0.05）进一步分析不同花色八仙花萼片中NHX1基因的表达情况，结果发现随着花色从蓝色向粉红色转变，NHX1基因的表达量逐渐升高（图7）。在蓝色萼片中，NHX1基因的表达量相对较低；在紫色萼片中，表达量有所增加；在粉红色萼片中，表达量最高。这与液泡pH的变化趋势一致，表明NHX1基因的表达可能受液泡pH的调控，参与了八仙花花色的形成过程。不同字母表示差异显著（P<0.05）4.2.4NHX1相关离子流测定采用非损伤微测技术（NMT）测定‘Bailmer’萼片液泡的离子流，结果显示，在正常条件下，液泡存在明显的Na+内流和H+外流现象（图8）。当加入NHX1抑制剂氨氯吡嗪咪（amiloride）后，Na+内流和H+外流均受到显著抑制，表明NHX1蛋白参与了液泡Na+/H+逆向转运过程，对维持液泡内的离子平衡和pH稳定起着重要作用。A：正常条件下液泡离子流；B：加入氨氯吡嗪咪后液泡离子流4.3结论本研究成功克隆了大叶八仙花萼片液泡pH调控基因NHX1。通过PCR扩增、胶回收、连接转化及单克隆验证等一系列实验操作，获得了NHX1基因的阳性单克隆，并对其序列进行了测定和分析。生物信息学分析表明，大叶八仙花NHX1基因与葡萄、拟南芥等植物的NHX1基因具有较高的相似性，在进化上具有较近的亲缘关系。其编码的蛋白具有12个跨膜结构域，主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，符合液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的结构特征。在表达分析方面，NHX1基因在大叶八仙花‘Bailmer’的各个组织中均有表达，但表达水平存在明显差异，在萼片中的表达量最高，与花器官的发育和花色调控密切相关。不同花色八仙花萼片中NHX1基因的表达量随着花色从蓝色向粉红色转变逐渐升高，与液泡pH的变化趋势一致，表明该基因参与了八仙花花色的形成过程。非损伤微测技术测定结果显示，NHX1蛋白参与了液泡Na+/H+逆向转运过程，对维持液泡内的离子平衡和pH稳定起着重要作用。本研究为深入揭示大叶八仙花花色调控的分子机制提供了重要的基因资源和理论依据。4.4讨论本研究成功克隆了大叶八仙花萼片液泡pH调控基因NHX1，并对其进行了生物信息学分析和表达研究。结果表明，NHX1基因在大叶八仙花的花器官发育和花色调控中具有重要作用。从生物信息学分析结果来看，大叶八仙花NHX1基因与葡萄、拟南芥等植物的NHX1基因具有较高的相似性，在进化上具有较近的亲缘关系。这表明NHX1基因在植物进化过程中具有一定的保守性，其功能可能在不同植物中具有相似性。其编码的蛋白具有12个跨膜结构域，符合液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白的典型结构特征。跨膜结构域的存在使得NHX1蛋白能够镶嵌在液泡膜上，实现Na+和H+的跨膜转运，从而调节液泡内的离子平衡和pH值。蛋白二级结构主要由α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲组成，这些结构特征对于维持蛋白的稳定性和功能发挥至关重要。α-螺旋和β-折叠能够形成稳定的蛋白框架，而无规则卷曲则可能参与蛋白与其他分子的相互作用，如与离子的结合或与其他转运蛋白的协同作用。在表达分析方面，NHX1基因在大叶八仙花‘Bailmer’的各个组织中均有表达，但在萼片中的表达量最高，这与花器官的发育和花色调控密切相关。花器官作为植物繁殖和吸引传粉者的重要结构，其发育和功能的正常维持需要精细的调控机制。NHX1基因在萼片中的高表达，可能暗示其在萼片发育过程中参与了多种生理过程，如细胞膨压调节、离子稳态维持等。而这些生理过程对于萼片的形态建成、色素积累等方面具有重要影响，进而影响花色的呈现。不同花色八仙花萼片中NHX1基因的表达量随着花色从蓝色向粉红色转变逐渐升高，与液泡pH的变化趋势一致，表明NHX1基因参与了八仙花花色的形成过程。随着液泡pH升高，花色从蓝色向粉红色转变，而NHX1基因表达量的增加可能是植物对液泡pH变化的一种响应机制。NHX1蛋白通过调节液泡内的Na+/H+逆向转运，影响液泡内的离子浓度和pH值，进而影响花青素等色素的稳定性和结构，最终导致花色的改变。非损伤微测技术测定结果显示，NHX1蛋白参与了液泡Na+/H+逆向转运过程，对维持液泡内的离子平衡和pH稳定起着重要作用。在正常条件下，液泡存在明显的Na+内流和H+外流现象，而加入NHX1抑制剂氨氯吡嗪咪后，Na+内流和H+外流均受到显著抑制，这直接证明了NHX1蛋白在液泡离子转运中的关键作用。通过这种逆向转运机制，NHX1蛋白能够将液泡内的H+排出，同时将Na+摄入液泡，从而调节液泡内的离子浓度和pH值。在酸性环境下，NHX1蛋白的活性可能受到抑制，导致液泡内H+积累，pH降低，有利于蓝色花色的形成；而在碱性环境下，NHX1蛋白活性增强，促进H+排出和Na+摄入，使液泡pH升高，花色向粉红色转变。然而，本研究仍存在一定的局限性。虽然确定了NHX1基因在液泡pH调控和花色形成中的作用，但对于其具体的调控机制还需要进一步深入研究。NHX1基因的表达是如何被调控的，是否存在其他上游调控因子或信号通路参与其中，这些问题尚不清楚。NHX1蛋白与其他离子转运蛋白或调节因子之间的相互作用关系也有待进一步探讨。未来的研究可以通过基因编辑技术，如