动物细胞融合与单克隆抗体课件-高二下学期生物人教版选择性必修3

2.2.2动物细胞融合与单克隆抗体“生物导弹”追踪癌细胞抗体植物体细胞杂交植物细胞融合植物组织培养温故而知新：植物体细胞杂交技术跨越不同种植物之间生殖隔离的屏障，克服远缘杂交不亲和的障碍，培育出新的作物类型。

1970年荧光标记的人-鼠细胞融合实验模式图实例：

如果让动物细胞进行融合，与植物有哪些不同之处？无需去除细胞壁全能性受限制，不能培育成新的动物个体思考：请同学们快速阅读课本P48页回答以下问题

1.什么是动物细胞融合技术（概念）？原理是什么？2.所形成的杂种细胞有什么特点？3.诱导动物细胞融合的方法有哪些？4.

动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？一、动物细胞融合技术1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。4、结果：形成杂交细胞。即融合后形成的原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。2、原理：细胞膜的流动性3、诱导方式物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒时间成果19世纪30年代观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞1858年观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。1876年在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1962年日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1965年英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代发展出了电融合技术(1985年酵母原生质体电融合)（1）补充资料：动物细胞融合技术的发展历史仙台病毒紫外线灭活丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）1、什么是病毒的灭活？

灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。病毒表面的糖蛋白和一些酶与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。2、灭活病毒诱导细胞融合的原理（2）问题：用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程：灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面↓细胞膜被病毒颗粒穿通↓细胞膜连接↓细胞核融合，形成杂交细胞（三）灭活病毒诱导细胞融合过程：不同DNA的两个细胞灭活的病毒融合有丝分裂两个完整的杂交细胞5.动物细胞融合技术全过程:动物细胞融合动物细胞培养知识点一动物细胞融合1.动物细胞融合过程解读:(1)操作过程:细胞膜融合→细胞质融合→细胞核融合(实质)。(2)筛选意义:诱导融合的手段只是促使细胞间的融合,不能保证所有的细胞都发生融合,形成的融合细胞也有多种。(3)融合细胞特点:具有两个细胞的遗传信息,通过动物细胞的培养,杂交细胞表现出两个亲本的特点。正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞

正在融合的鸡血细胞6.动物细胞融合实例：（六）植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途克服远源杂交的障碍，获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（离心、振荡、电激）化学（PEG）物理、化学方法（PEG）

灭活的病毒突破有性杂交局限，使远缘杂交成为可能。获得杂交细胞制备单克隆抗体意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体应用：

一.动物细胞融合技术4.动物细胞融合技术的意义和应用有哪些？2.植物体细胞杂交与动物细胞融合:项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞膜的流动性细胞全能性细胞的增殖融合过程酶解法除去细胞壁注射特定的抗原原生质体融合动物细胞融合杂种细胞的筛选杂交瘤细胞的筛选培养获得杂种植株提取提纯单克隆抗体融合方法物理法:电融合法、离心法化学法:PEG、高Ca2+—高pH融合法物理法:电融合法化学法:PEG融合法生物法:灭活病毒诱导法实例番茄—马铃薯植株单克隆抗体用途培育作物新品种疾病的诊断和治疗1.概念：2.结果：3.原理：细胞膜的流动性5.意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。特别是利用杂交瘤技术制造单克隆抗体。6.应用：4.诱导方法：物理法;化学法和生物法动物细胞融合技术是指使_________动物细胞结合成一个细胞的技术。

形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的细胞，称为________。（七）小结：抗原不纯抗体不纯（八）传统抗体制备方法及缺陷缺陷：

产量低、纯度低，

且抗体的特异性差、灵敏度低。不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原

刺激浆细胞抗体筛选单一B细胞增殖分化

１）体内产生的特异性抗体种类多达百万种以上２）每个B淋巴细胞只分泌一种特异性的抗体1、科学家发现：单克隆抗体

一个B淋巴细胞

抗体

细胞群克隆如何获得大量、单一的抗体？体外培养时，一个B淋巴细胞不能无限增殖2、需解决问题：3、遗憾：如何解决这一难题？癌细胞动物细胞融合思考１：我们所学的哪种细胞是可以无限增殖的思考２：有什么方法能使B细胞产生抗体的能力和无限增殖能力同时具备思考：一个极富创造力的方案：动物细胞融合杂交细胞动物细胞培养单克隆抗体杂交瘤细胞既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体1975年，米尔斯坦和柯勒1984年，诺贝尔生理学或医学奖

二、单克隆抗体及其应用由单个B淋巴细胞经过无性繁殖（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。1、单克隆抗体：筛选杂交瘤细胞要使用特殊的培养基，一般用HAT培养基。HAT培养基根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途径设计，通过在DMEM(或RPM-1640)培养基中加入次黄嘌呤(hypoxanthineH)、氨基蝶呤(aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)3种关键成分配制而成。DMEM是Dulbecco＂sModifiedEagleMedium的缩写，该培养基应用广泛，常用于壁细胞的培养。RPMI-1640培养基是美国洛斯维・帕克纪念研究所(RoswellParkMemorialInstitute)研发的，RPMI由该研究所名称的首字母组成，1640是培养基的编号，该培养基也是种常用的培养基，主要用于一些悬浮细胞的培养。哺乳动物细胞中合成DNA的途径有两条，一条是从头合成途径(denovosynthesispathway)，简称D途径，该途径是指从氨基酸和其他小分子化合物合成核苷酸开始，合成DNA的过程。在D途径中，叶酸及其行生物是必不可少的，它们参与嘌呤环和啶甲基的合成。HAT培养基中加入的氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，因此它可以阻断细胞利用D途径合成DNA。另一条是补救途径(即salvagepathway，或称为替代途径)，简称S途径。该途径需要次黄呤嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶核苷激酶(TK)的参与，这两种酶可以催化次黄嘌呤和胸腺啶核苷分产生肌苷酸和胸腺啶脱氧核苷酸，它们可以用来合成DNA骨髓瘤细胞是经过人工筛选的基因缺陷型细胞，缺乏HGPRT和TK。9当它处于HAT培养基中时，它合成DNA的D途径被氨基呤阻断;同时，它由于缺乏HGPRT和TK，所以不能利用S途径合成DNA，会很快死亡。而杂交瘤细胞从B淋巴细胞中获得了HGPRT和TK，可以利用补充在培养基中的次黄嘌呤和胸腺啶核苷经过S途径来合成DNA，这样在HAT培养基中它可以生存并增殖。(六)杂交瘤细胞的抗体检测及克降化培养用选择培养基(HAT)筛选出的杂交瘤细胞，大多数不能分泌抗体，仅有少数细胞能分泌所需的特异性抗体，因此需要将这些杂交箱细胞挑选出米如何挑选呢可以根据抗原与抗体特异性结合的原理，运用免疫酶測定法(如常用的酶联免疫吸附试验法)、免疫荧光技术、放射免疫测定法等检测各孔上清液中细胞分泌的抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时进行检测(对小鼠的杂交瘤细胞来说，一般在融合后的10～14d进行检测)。另外，新融合的杂交细胞不稳定，容易失去分抗体的性质，所以一般需要进行几次检测以确保其稳定性。当经过2~3次检测证实在培养孔中存在特异性抗体时，就可以对杂交细胞进行连续克隆化培养了。克隆化是指由单个细胞分裂增殖获得细胞的培养过程。常用的克隆化培养方法包括有限稀释法、软琼脂培养法等。下面以有限稀释法为例进行简要说明将处于对数生长期的杂交瘤细胞用培养液充分稀释，使分配到96孔细胞培养板每个孔中的细胞数不超过1，通过培养让它增殖为单克隆。一般培养4～5d后，如果在倒置显微镜下见到簇紧密生长的细胞，可认为这是单一克隆。经过一次克隆化培养的细胞不能保证其来自单个细胞，一般经过3~4次培养才可以获得稳定的单克隆。这时候，如果再次检測抗体为阳性，就可以进行大规模生产了。二、单克隆抗体的制备B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤√第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。

注射特定抗原

从脾脏中获取多种B淋巴细胞

骨髓瘤细胞

培养骨髓瘤细胞目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合2、单克隆抗体的制备过程B、瘤、BB、B瘤、瘤瘤√多种杂交细胞第一次筛选选择培养基培养多种杂交瘤细胞第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。杂交瘤细胞第二次筛选多孔培养板筛选抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞克隆化培养和抗体检测既能迅速大量增殖又能产生特异性抗体特点既能迅速大量增殖又能产生抗体特点(抗原-抗体特异性结合)第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。阳性细胞单克隆抗体的制备在体外培养注射到小鼠腹腔内培养液中获取从腹水中获取单克隆抗体

补充资料：第一次筛选获得杂交瘤细胞①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基喋呤阻断。②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤B淋巴细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡骨髓瘤细胞及同型融合细胞不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞能无限增殖，生长多孔细胞培养板抗体检测板阳性孔抗体检测的方法——抗原-抗体杂交法将杂交瘤细胞群稀释，约每孔1个细胞进行培养（克隆化培养）一段时间后，检测各孔上清液中细胞分泌的抗体上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔分泌抗体能跟特定抗原结合的细胞即为所需杂交瘤细胞单克隆抗体的制备过程诱导融合选择培养基克隆化培养，专一抗体检验体外培养或小鼠腹腔内增殖动物细胞融合动物细胞培养给小鼠注射特定的抗原蛋白B淋巴细胞（免疫）骨髓瘤细胞杂交细胞杂交瘤细胞单克隆抗体能分泌所需抗体的杂交瘤细胞第一次筛选第二次筛选第1次筛选目的：得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选目的：在杂交瘤细胞中筛选出能产生特定抗体的杂交瘤细胞。3.三种细胞的比较:细胞类型来源特点已免疫的B淋巴细胞由B淋巴细胞受抗原刺激后增殖分化而来能产生单一抗体,但不能无限增殖骨髓瘤细胞从骨髓肿瘤中提取能无限增殖,但不能产生抗体杂交瘤细胞浆细胞与骨髓瘤细胞融合而成既能产生抗体,又能无限增殖1、诊断试剂——最广泛应用抗原-抗体杂交法抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体比原来诊断方法提前了