微生物学教学课件-第9章-微生物遗传

第九章微生物的遗传

生命最重要的本质之一是性状特征自上代传至下代——遗传。孟德尔（1822－1884）微生物是遗传学研究中的明星

微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。

很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。

对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。第一节遗传变异的物质基础

三个经典实验

转化实验

噬菌体的感染实验

病毒的拆开和重建实验遗传的物质基础：DNA？蛋白质？三个经典实验第一节遗传变异的物质基础(一）肺炎链球菌的经典转化实验实验材料：肺炎链球菌SIII型菌株RII型菌株有荚膜，菌落表面光滑，有致病性无荚膜，菌落表面粗糙，无致病性英国细菌学家（1928，Griffith）1、动物实验:Griffith进行的几组实验R型菌+加热杀死S型+怎么来的呢？？1、动物实验:Griffith进行的几组实验RSSR唯一合理的解释：活的非致病的R型，从被杀死的SIII型菌中获得了遗传物质，使其产生了荚膜称为致病型SIII.Griffith称这种现象为转化。称引起转化的遗传物质为转化因子。2、细菌培养实验热死的S菌不生长活的R菌长出R菌热死的S菌

+

活的R菌培养皿培养培养皿培养培养皿培养长出大量的R菌及10-4的S菌3、S型菌的无细胞抽提液实验从活的S菌中抽提各种细胞成分（DNA，蛋白质，荚膜多糖等），并对各组分进行转化试验（二）噬菌体感染实验1952年侯喜(A.Hershey)和蔡斯(M.Chase)利用示踪元素，对大肠杆菌T2噬菌体进行了这类实验。实验材料：E.coli噬菌体Hershey等用同位素32P和35S分别标记T2噬菌体的DNA与蛋白质.其中蛋白质中含S，DNA中含磷。噬菌体的侵染与繁殖

RNA接种到烟叶→发病

RNARNA酶处理RNA→不发病

TMV

蛋白质：接种后不形成新的TMV

不发病说明在不含DNA的TMV中RNA就是遗传物质（三）.植物病毒重组实验为了进一步论证上述的结论，Frankel-Conrat和Singer实验：质粒与转座子1、质粒的定义及特点质粒：凡游离于原核生物核基因组以外，具有复制能力的小型共价闭合环状的dsDNA分子，即cccDNA称质粒。如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现一质数个缺口，称之为开环DNA（ocDNA）；若质粒DNA经过适当的核酸内切酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子，通称L结构。2、特点①是非必要的遗传物质，一般只控制生物的次要性状，但能自我复制和稳定遗传。质粒也有助于生物在特殊环境下生长；②在细胞内的大小和数量（或拷贝数）不相同。一般大质粒（分子量＞60M道尔顿）的拷贝数较少，而小质粒（分子量＜15M道尔顿）较多。③具互不相容性，即某些属于同一组并具有共同阻遏物的质粒不能在同一细胞中并存；④可转移性，某些质粒能以较高的频率（＞10-6）通过细胞间的接合作用或其它机制从供体细胞向受体细胞转移；2、特点⑤可整合性，在一定条件下质粒可以整合到染色体DNA上并可重新脱落下来；⑥可重组性，不同质粒或质粒与染色体上的基因可以在细胞内或细胞外进行交换重组并形成新的重组质粒；⑦可消除性，质粒经高温、吖啶橙或丝裂霉素C等处理可以消除，宿主细胞同时也将失去质粒所携带的表型性状；⑧耐碱性，与染色体DNA相比，质粒有较强耐碱性，在分离质粒操作中常将pH调至12.4而使染色体DNA变性并通过离心与质粒DNA区分开来。3、质粒的种类按其复制与核染色体的复制是否同步

严紧型质粒松弛型复制控制质粒

按其功能

接合性质粒：如F质粒抗药性质粒：如R质粒产细菌素的质粒：如Col质粒具有生理功能的质粒：如固氮的mega质粒、降解质粒等产毒质粒：如Ti质粒4、典型质粒简介1）F质粒(Fplasmid)是E.coli等细菌决定性别并有转移功能的质粒。F质粒又称致育因子，大小约100kb，总共编码着19个转移基因，是一种与E.coli的有性生殖现象，即接合作用相关的单拷贝质粒图9-4F质粒的遗传图谱（沈萍，2006）F因子是雄性决定因子，F+又称之为雄性细胞，F-则称之为雌性细胞。在合适的条件下，将雄性细胞和雌性细胞混合培养，通过F+表面的性须的作用，形成雌-雄细胞配对，这就是细菌的接合作用。雄性细胞中的F因子按滚环复制模式，经性须作用进入雌性细胞。配对后F-受体细胞获得F因子，变成了F+细胞。F质粒整合到宿主细胞染色体形成Hfr菌株。当Hfr菌株上的F因子通过重组回复成自主状态时，有时会将相邻染色体的基因一起切割下来，成为携带某一染色体基因的F因子。因此，将这些携带不同基因的F因子统称为F’，带有这些F’的菌株常用F’表示。4、典型质粒简介2）R质粒(Rplasmid)R质粒又称抗性质粒，附加有抗生素抗性基因，抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。抗药性质粒不仅可以在种间进行转移，也可在E.coli和ShigellaCastellani（痢疾志贺氏菌）、proteusspecies（变形杆菌）和Salmonellatyphi（伤寒杆菌）等各属细菌之间转移。带有抗药性因子的细菌有时对几种抗生素或其他药物呈现抗性，例如，R100质粒可使宿主对汞、四环素、链霉素、磺胺、氯霉素等药物及重金属具有抗性。由于R质粒可引起致病菌对多种抗生素的抗性，对传染病防治等医疗实践有极大危害；而将它作菌种筛选时的选择性标记或改造成外源基因的克隆体，则对人类有利。2）R质粒(Rplasmid)图9-6抗药性质粒R100的基因图3）Col质粒(colplasmid)Col质粒是产细菌素的质粒，最初在E.coli中发现而得名。细菌素是某些细菌产生的代谢产物，能够抑制或者杀死其他近缘细菌或同种不同菌株，这些代谢产物是由质粒编码的蛋白质，不具有很广的杀菌谱。Col质粒种类很多，主要分为两类，第一类以colEl为代表，相对分子质量较小，9kb，约5×106，无接合作用，为松弛型控制、多拷贝；第二类以colIb为代表，相对分子质量较大，94kb，约8.0×107，与F因子相似，具有通过接合而转移的功能，属于严紧型控制，只有1～2个拷贝。4）Ti质粒(tumorinducingplasmid)根癌土壤杆菌从一些双子叶植物的受伤根部侵入，最后在其中溶解，释放出Ti质粒，其上的T-DNA片段与植物细胞中的核染色体组发生整合，合成正常菌株所没有的冠瘿碱类，破坏控制细胞分裂的激素调节系统，从而使它转变成癌细胞。致癌区冠婴碱合成区冠婴碱分解区Ti质粒接合转移区(tra)毒性区(vir)DNA复制区(rep)Ti质粒6个功能区：5）毒性质粒(virulenceplasmid)许多致病菌的致病毒素是由其所携带的毒性质粒编码的，例如，产毒素E.coli是引起人类和动物腹泻的主要病原菌之一，其中许多菌株含有一种或多种肠毒素编码的质粒。S.aureus产生的剥脱性毒素、clostridiumtetani(破伤风梭菌)产生的坡上分毒素、Bacillusanthracis(炭疽芽孢杆菌)产生的炭疽毒素等都是由质粒编码的。有些使昆虫致病乃至死亡的细菌毒素也是由质粒编码的，例如苏云金杆菌编码的δ-内毒素的质粒就是此种类型典型的例子。6）代谢质粒(Metabolicplasmid)代谢质粒上携带有能编码某些基质降解酶的基因，含有这类质粒的微生物，可以将复杂的有机化合物降解成为能被利用的简单形式的碳源和能源物质。含有分解甲苯的基因的TOL质粒和含有分解樟脑辛烷基基因的CAM-OCT质粒等，在环境保护方面具有重要的应用前景。7）隐秘质粒(crypticplasmid)上述质粒类型均具有某种可检测的遗传表型，而隐蔽质粒不显示任何表型效应，只有通过物理方法才能检测到它们的存在，例如凝胶电泳检测细胞抽提液的方法。目前，对于它们的存在意义还不了解。二）转座子（1）转座因子的类型和分子结构

转座是一种特殊类型的重组，通常指特定的遗传因子从宿主DNA的一个位点移动到另一个新位点，这些可移动的遗传因子称为转座因子、转座子或跳跃基因。它们可以直接以DNA的形式或者以RNA为介导进行转座。1950年B.McLintock首先在玉米种发现并描述了转座因子，打破了传统遗传学关于基因在染色体上固定排列及同源染色体交换的观点，揭示了基因的可移动性。（2）转座子的遗传效应

转座因子的转座可以引发多种遗传学效应，不仅能给基因组带来新的遗传信息，而且也能诱发突变，同时还能导致DNA的重排。在生物进化上有重要意义，同时也是遗传学研究中重要工具。①诱发突变。当一个转座因子插入到结构基因中时，破坏原有基因结构，使其沉默。例如，玉米中Ds基因插入到色素基因C中，使其失去功能而不能合成相应的色素。而当Ds基因进一步转座到其他地方时，C基因又回复到原有功能。②产生染色体畸变。处在同一染色体不同位置的两个拷贝之间可能发生同源重组，重组的结果取决于两个转座因子相互间的排列方向，如果排列方向相同就会产生缺失，若是排列方向相反则会产生倒位。即染色体畸变。

③引起基因的移动。由于转座作用，可能使一些原来在染色体上相距很远的基因组合到一起，构建成一个操纵子或者表达单元，也可能产生一些具有新的生物学功能的基因和新的蛋白质分子，对于生物进化具有重大意义。

遗传性变异是由基因结构发生改变所致，主要通过基因突变、基因损伤后的修复、基因的转移与重组来实现。第二节基因突变一、基因突变（一）基因突变的定义狭义：点突变点突变:DNA链上的一对或少数几对碱基发生改变。(碱基置换、移码突变)广义：基因突变和染色体畸变染色体畸变:DNA的大段变化损伤现象(添加、缺失、易位、倒位)突变株的表型选择性突变株非选择性突变株营养缺陷型抗性突变型条件致死突变型形态突变型抗原突变型产量突变型(二）基因突变类型

（三）突变率每一个细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率；自发突变几率一般在10-6-10-9范围内；突变率为10-8的含义突变率为10-8的含义突变率为10-8，可指一个细胞在一亿次细胞分裂中，会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代（即分裂1次）中产生突变株的数目来表示。例如，一个含108个细胞的群体，当其分裂为2×108个细胞时，即可平均发生1次突变的突变率也是10-8

。（四）基因突变的特点(7个特点)1、不对应性2、自发性3、稀有性4、独立性5、诱变性6、稳定性7、可逆性1、不对应性（随机性）突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。例如，细菌在有青霉素的环境下，出现了抗青霉素的突变体；在紫外线的作用下，出现了抗紫外线的突变体；在较高的培养温度下，出现了耐高温的突变体等。表面上看来，会认为正是由于青霉素、紫外线或高温的"诱变"，才产生了相对应的突变性状。事实恰恰相反，这类性状都可通过自发的或其任何诱变因子诱发而行。这里的青霉素、紫外线或高仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用。2、自发性各种性状的突变，可以在没有人为的诱变因素处理下自发地发生。“自发突变”决不意味着这种突变是没有原因的，而只是说明人们对它们还没有很好认识而已。3、低频性

自发突变虽可随时发生，但突变的频率是较低和稳定的，一般在10-6~10-9间。4、独立性

突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性，而且还可发生其他不属抗药性的任何突变。某一基因的突变，既不提高也不降低其他基因的突变率。5、诱变性

通过诱变剂的作用，可提高自发突变的频率，一般可提高10-105倍。不论是自发突变或诱发突变(诱变)得到的突变型，它们之间并无本质上的差别，因为诱变剂仅起着提高突变率的作用。6、稳定性

由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新性状也是稳定的、可遗传的。7、可逆性

由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程，称为正向突变，相反的过程则称为回复突变或回变。实验证明，任何性状既有正向突变，也可发生回复突变。在各种基因突变中，抗性突变是最常见的突变类型；细菌产生抗药性的途径基因突变抗药性质粒的转移生理适应由基因突变引起的抗药性的原因？（五）基因突变自发性和不对应性的实验证明两种观点：一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对应的。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，终于解决了这场纷争。

1、Luria等的变量试验（彷徨实验）实验设计者美国的鲁里亚和德尔波留克根据统计学原理设计；时间：1943年实验材料：对T1噬菌体敏感的大肠杆菌实验目的验证突变的性状与引起突变的原因间有无直接对应关系实验过程如果突变的性状与引起突变的原因间呈对应性结果如何？如何解释得到的实验结果？噬菌体的作用？实验结果讨论突变的发生在时间上是随机的结果发现，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿数目基本相同。这就说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突变，不是由所抗的环境因素——噬菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。实验设计者1949年纽康布实验材料对T1噬菌体敏感的大肠杆菌采用固体平板培养实验过程2.Newcombe的涂布试验（1949）结果发现：在涂布过的一组中。共长出抗性菌落353个，要比未经涂布过的(仅28个菌落)高得多。结论：这也意味着该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。噬菌体的加入只起甄别这类自发突变是否发生的作用，而根本不是诱导突变的因素。突变率的计算接种时每一平皿的细胞数：5×104培养5h后每一平皿的细胞数：

5×104×212.3（5100）=2.6×1086个平皿上共发现28个突变菌落突变率=突变的细胞数/增加的细胞总数

=28/6×（2.6×108-5×104）

=1.8×10-83、平板影印试验所谓平板影印培养法，实质是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。实验设计者1952年，美国的莱德伯格夫妇实验材料E.coliK12实验过程Lederberg的平板培养法(五）基因突变及其机制基因突变只涉及少数DNA分子中一个或几个碱基对的突变，又称为点突变。畸变：指染色体结构发生改变。片段突变是指在基因组DNA分子中某些小的序列片段发生的改变，包括缺失、重复或者重排等。在减数分裂中，同源染色体的错误配对和不等交换式造成缺失、重复和重组的主要原因，而DNA断裂后片段的倒位重接是重排的分子基础。1、同义突变：某个碱基的变化不改变密码子的变化；2、错义突变：碱基的变化造成氨基酸的改变，严重时可造成蛋白质活性丧失，影响表型。3、无义突变：碱基的改变造成密码子变为蛋白质合成的终止密码子（UAA\UAG\UGA），蛋白质合成被提前终止，产生一个短的蛋白质。4、移码突变：DNA分子中插入或缺失1-2个核苷酸，使可读框改变，引起翻译和转录错误。Gly，甘氨酸；Cys,半胱氨酸；Ser，丝氨酸。不同碱基的变化对遗传信息的改变是不同的，可分为4种：诱变剂：凡能显著提高突变频率的理化因子；1）碱基置换转换（transition）嘌呤被嘌呤所置换，或嘧啶被嘧啶所置换颠换（transversion）嘌呤被嘧啶所置换，或嘧啶被嘌呤所置换1、诱发突变碱基置换机制直接引起置换的诱变剂：亚硝酸HNO2CNH2腺嘌呤CO次黄嘌呤(Hk)A..THe..THk..

THk..

CA..THk..

CG..

CCOH次黄嘌呤(He)直接引起置换的诱变剂直接与核酸的碱基发生化学反应，体内或离体均有作用。如：亚硝酸、羟胺、和各种烷化剂；间接引起置换的诱变剂通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中后引起的变化。如：碱基类似物；诱变剂种类以亚硝酸为例说明碱基转换的分子机制亚硝酸可使碱基发生氧化脱氨作用，故它能使A变为H，以及C变为U，从而发生转换。转换过程的环节：①腺嘌呤经氧化脱氨后变成烯醇式次黄嘌呤(He)；②由He通过自发产生的互变异构效应而形成酮式次黄嘌呤(Hk)；③DNA双链第一次复制，结果Hk因其在6位上含有酮基，故只能与6位上含有氨基的胞嘧啶(C)配对；④DNA双链的第二次复制，这时其中的C按常规与G配对，因而最终实现了转换。

移码突变

DNA分子中的一个或少数几个核苷酸的增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和转译错误的一类突变；诱变剂种类：丫啶类染料（原黄素、丫啶黄、丫啶橙、-氨基丫啶等）和ICR类化合物；移码突变ＤＮＡ分子中缺失或增加少数几个碱基对而引起造成突变点以后全部遗传密码转录与转释发生错误ABCABCABCABCABCABCABCABCAB+ABCABCCBACBACBACBACBAABCBCABCABCABCABCABCABCA增添一个碱基缺少一个碱基染色体畸变某些强烈理化因子，如电离辐射（X射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起DNA分子的大片段损伤；染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位；染色体数目的变化；染色体的易位

转座DNA序列通过非同源重组的方式，从染色体某一部位转移到同一染色体上另一部位或其他染色体上某一部位的现象。转座(因)子IS插入序列(insertionsequence)Tn转座子(transposon)Mu噬菌体(mutatorphage)ababab40年代美国遗传学家BarbaraMeclintock首先在玉米中发现了染色体易位。她于1983年度获诺贝尔奖。染色体易位广泛存在于原核和真核细胞中。研究发现这些DNA片断不但可在染色体上移动，而且还可从一个染色体跳到另一个染色体，从一个质粒到另一个质粒或染色体，甚至还可从一个细胞转移到另一个细胞。在这些DNA顺序的跳跃过程中，往往导致DNA链的断裂或重接，从而产生重组交换或某些基因启动和关闭，结果导致突变。2、自发突变机制1、由背景辐射和环境因素引起：例如，充满宇宙空间的各种短波辐射或高温诱变效应，以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等

；2、由微生物自身有害代谢物引起：通过对环境诱变原的研究发现，通常存在细胞内的天然物质中也有表现诱变原性的物质。如微生物细胞内的咖啡碱、硫氰化合物、重氮丝氨酸、过氧化氢等；3、由DNA复制过程中碱基配对错误引起等。（六）紫外线对DNA的损伤及其修复1、DNA的损伤嘧啶对紫外线的敏感性要比嘌呤强得多，嘧啶的光化产物主要是二聚体。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响DNA的复制和转录，并使细胞死亡。胞嘧啶水合物胸腺嘧啶二聚体二氢胸腺嘧啶胸腺嘧啶-胞嘧啶二聚体2、DNA的修复微生物能以多种方式去修复损伤后的DNA，主要有以下两种：光复合作用暗修复作用1）光复活作用光复合作用：光解酶PHr在黑暗中专一地识别嘧啶二聚体，并与之结合形成光解酶-DNA复合物。当给予光照时，酶利用光能（PHr本身无发色基团，与损伤的DNA结合后才能吸收光，起光解作用），解开二聚体，恢复原状，使DNA损伤得到修复。由于在一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。光复活作用PREA-AT=TPREA-AT=TA-AT-TPREUV可见光二聚体解离PRE光激活酶(photoreactivatingenzyme)A-AT-T5‘3‘5‘3‘A-AT-T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘A-AT=T5‘3‘5‘3‘OHPA-A5‘3‘5‘3‘OHPT=TA-AT-T5‘3‘5‘3‘UV酶I酶II酶III酶IV2）暗修复（切除修复）酶I——核酸内切酶酶II——核酸外切酶酶III——DNA聚合酶酶IV——DNA连接酶暗复活并非只在黑暗中进行，而是光对此不起任何作用。这种修复是利用双链DNA中一段完整的互补链，去恢复损伤链所遗失的信息，就是把含有二聚体的DNA片段切除，然后通过新的核苷酸链的再合成进行修复。因此又叫切除修复。（一）转化（transformation）1.定义：受体菌直接吸收供体菌的DNA片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的杂种后代称为转化子。供体菌的DNA片段称为转化因子。2.能进行转化的微生物种类肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属和根瘤菌属等20多种菌等。但肠道菌科的细菌如E.coli等很难进行转化。不论是否处于感受态，细菌都能够吸附并结合DNA，但只有处在感受态的细胞，接合的DNA才会被吸收。转化是一个消耗能量的过程第三节接合、转导、转化3.影响菌株间发生转化的因素受体和供体染色体的同源性；最易与细胞表面结合的是dsDNA；发生转化的细胞必须处于感受态;转化的频率（0.1-1%，最高为20%）;受体细胞的限制酶系统和其他核酸酶，它们决定转化因子在整合前是否被分解;4.感受态（competence）指受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。不同菌种感受态细胞所占比例、出现的时间和维持时间不同外界环境因子如环腺苷酸（cAMP）和Ca2+等可提高受体细胞的感受态水平。调节感受态的是一类特异蛋白—感受态因子dsDNA供体（strR）感受态受体（strS）同源区段配对单链整合，形成一小段杂合DNA区段转化子（strR）非转化子（strS）复制与分离5、转化过程转化时只有一条链进入受体细胞，而另一条链被细胞表面的核酸外切酶彻底降解。（二）转导1.定义：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。获得的重组细胞称为转导子。携带供体部分遗传物质的噬菌体称为转导噬菌体或转导颗粒。在噬菌体内仅含有供体DNA的称为完全缺陷噬菌体；在噬菌体内同时含有供体DNA和噬菌体DNA的称为部分缺陷噬菌体。2.根据噬菌体和转导DNA产生途径的不同，转导的种类普遍转导局限转导普遍转导：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何DNA小片段的“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象；一般用温和噬菌体作为普遍转导的媒介；可分为完全普遍转导和流产普遍转导；普遍转导完全普遍转导供体受体流产普遍转导：经转导而获得了供体菌DNA片段的受体菌，其外源DNA片段不与受体细胞核染色体组进行交换、整合和复制，仅表现稳定的转录、转译和性状表达，且每经过一次分裂，就受到一次“稀释”。通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；特点：只局限于传递供体菌核染色体上的个别特定基因；该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带；缺陷噬菌体的形成方式是在脱离宿主核染色体过程中，发生低频率（-10-5）的误切；需要通过UV等因素对溶源菌的诱导；分为低频转导和高频转导局限转导gal

dgal1)低频转导（LFT）部分缺陷噬菌体以大肠杆菌

噬菌体为例

galbio

正常切割不正常切割biodbio

其频率为10-4—10-6

（LFT裂解物）E.coliK12gal-

少数稳定的gal+转导子低m.o.i.2)高频转导（HFT）双重溶源菌（doublelysogen）同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌；被紫外线等诱导时，正常的

噬菌体具有补偿缺陷噬菌体（如

dgal）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体；双重溶源菌产生的裂解物中含有等量的

和

dgal粒子

HFT裂解物

低m.o.i.

Ecoli.K12gal-

高频地把它转化成稳定的gal+转导子；高m.o.i.的LFT裂解物

感染

Ecoli.K12gal-

?低频转导和高频转导的异同点相同点只能转导供体菌的个别特定基因该特定基因由部分缺陷的温和噬菌体携带不同点低频转导：在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例极低，称为低频转导裂解物。用其感染宿主，只获得极少量的局限转导子高频转导：产生高频转导裂解物，用其感染宿主，可获得较多的转导子。

当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。溶源转变（三）细菌的接合作用(conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程．实验证据：1946年，JoshuaLederberg和EdwardL.Taturm：细菌的多重营养缺陷型杂交实验接合（conjugation）供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把F质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。能进行接合的微生物种类主要在细菌和放线菌中存在；研究得最清楚的是E.coli；E.coli有性别分化，决定性别的是一种质粒，即F因子。根据F因子在细胞内的存在方式，将E.coli分为四种类型：Hfr（高频重组）菌株：F因子整合在核染色体组特定位点上，并与宿主染色体同步复制。大肠杆菌的四种类型F’菌株：F因子整合到染色体上是一种可逆过程，当F因子从Hfr菌染色体上脱落时，会出现一定概率的错误基因交换，从而使F因子带上宿主染色体的遗传因子，这时的F因子称为F′。（♀）（♂）（♂）（♂）F质粒的4种存在方式及相互关系F-菌株：不含F因子，细胞表面没有性菌毛。F+菌株：菌株F因子以游离状态存在，可独立于染色体外进行自主复制。一般有1-4个，且细胞表面有相当数量的性菌毛。大肠杆菌的接合方式F+×F-

F++F+

Hfr×

F-

Hfr+

F-（多数情况下）Hfr×

F-

Hfr+

Hfr（少数情况下）F’×F-

F’+F’F因子转导以F’质粒通过接合来传递供体基因的方式举例：F+×F-杂交当F+菌株和F-菌株在一起时，它们通过性菌毛连接在一起形成胞质桥；然后F+菌株中的F因子的一条DNA链在特定的位置发生断裂而解开；其中一条单链通过胞质桥进入F-菌株,同时留下的另一条单链在供体细胞内重新合成一条新的环状单链。在F-菌株细胞中外来的供体DNA单链也合成一条互补的新DNA链，并随之恢复成一条环状的双链F因子。这样F-菌株就变成了F+菌株。F+菌株的F因子向F-细胞转移，但含F因子的宿主细胞的染色体DNA一般不被转移。举例：Hfr×F-杂交

当Hfr细菌与F-细菌混合时，两细胞结合配对，接着从Hfr细胞把染色体通过接合管定向转移给F-细胞。对于F因子，进入F-菌株的机会很少，引起性别变化的可能性也非常小。二、突变与育种（一）自发突变育种从生产中育种定向培育优良菌株（二）诱变育种指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。（一）自发突变与育种（1）从生产中选育在日常生产中微生物会以一定频率发生自发突变。此时可以抓住良机选育优良的生产菌种。例如，从污染噬菌体的发酵液中有可能分离到抗噬菌体的自发突变株。

（2）定向培养优良菌种定向培育一般是指用某一特定环境长期处理某一微生物培养物，同时不断对它们进行移种传代，是达到积累和选择合适的自发突变体的一种古老的育种方法。培育新种的过程十分缓慢。由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，所以培育新种的过程一般十分缓慢。与诱变育种、杂交育种和基因工程技术相比，定向培育法带有守株待兔的被动状态。例如，当今世界上应用最广的预防结核病制剂——卡介苗(BCGvaccine)的获得，便是定向育种的结果。这是法国科学家Calmette和Guerin经历了l3年时间，把牛型结核分支杆菌接在牛胆汁、甘油、马铃薯培养基上，连续转接了230代，才在1923年成功地获得了这种减毒的活菌苗--卡介苗。诱变育种的基本环节诱变育种的原则突变株的筛选方法

产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选第4节微生物育种1、诱变育种的基本环节以高产为目标的诱导育种大致路线如下：2、诱变育种工作中应考虑的几个原则（1）选择简便有效的诱变剂（2）选优良的出发菌株（3）处理单孢子（或单细胞）悬液（4）选用最适剂量（5）利用复合处理的协同效应（6）利用和创造形态，生理与产量间的相关性（7）设计或采用高效筛选方案或方法在选用理化因子作诱变剂时，在同样效果下，应选用最方便的因素；而在同样方便的情况下，则应选择最高效的因素。在物理诱变剂中，尤以紫外线为最方便，而化学诱变剂中，以NTG（烷化剂：亚硝基胍）

最为有效。目前在实践上常用的诱变剂主要有紫外线(u.v.)、氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍(NTG或MNNG)和亚硝基甲脲(NMU)等。后两种因为有突出的诱变效果，所以被誉为“超诱变剂”。（1）选择简便有效的诱变剂选择简便有效的诱变剂:紫外线、亚硝基胍出发菌株含诱变剂的液体培养基接种培养培养接种分离紫外线选择优良突变株艾姆氏试验：是一种利用细菌营养缺陷型的回复突变来检测环境或食品中是否存在化学致癌剂的简便有效方法。美国加利福尼亚大学的BruceAmes教授于1966年发明，因此称为Ames试验具体操作：检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率。回复突变：突变体失去的野生型性状，可以通过第二次突变得到恢复，这种第二次突变称为回复突变。

（2）选择合适的出发菌株出发菌株:是指用于育种的起始菌株。有利性状:高产、生长速度快、营养要求粗放、产孢子早而多的菌株等。最好选用来自生产中的自发突变菌株。选用具有有利于进一步研究或应用性状的菌株。可选用已发生过其他突变的菌株。选用对诱变剂敏感性较高的增变变异株。

(3)处理单细胞或单孢子悬液在诱变育种中，所处理的细胞必须是单孢子或单细胞悬液状态。其目的是：一方面分散状态的细胞可以均匀接触诱变剂；另一方面又可避免长出不纯菌落。在某些微生物中，即使用这种单细胞悬液来处理，还是很容易出现不纯菌落，这是由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核的原故。(4)选用最适剂量各种诱变剂有不同的剂量表示方式。剂量一般指强度与作用时间的乘积。化学诱变剂常以一定温度下诱变剂的浓度和处理时间来表示。由于诱变剂是用来提高突变率、扩大产量变异的幅度和使产量变异向正突变的方向移动，因此，凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是合适的剂量。

就一般微生物而言，诱变率往往随剂量的增高而提高，但达到一定剂量后，再提高剂量反而会使诱率下降。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变效应的研究结果，发现正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变较多地出现于偏高的剂量中；还发现经多次诱变而提高产量的菌株中，更容易出现负变。因此，在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量。(5)利用复合处理的协同效应诱变剂的复合处理常常呈现一定的协同效应，这对育种实践是很有参考价值的。两种或多种诱变剂先后使用两种或多种诱变剂同时使用同种诱变剂重复使用(7)设计和采用高效筛选方案和方法通过诱变处理，在微生物群体中会出现种种突变型个体，绝大多数是负变体，要在其中把极个别的产量提高较显著的正变体筛选到手，就要求采用效率较高的科学筛选方案和方法。筛选过程以分初筛与复筛两阶段进行为好。前者以量(选留菌株的数量)为主，后者以质(测定数据的精确度)为主。一个出发菌株诱变剂处理选出200个单孢子菌菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株第一轮第二轮五个出发菌株初筛（每株1瓶）选出50株复筛（每株4瓶）选出5株40株40株40株40株40株诱变剂处理3、诱变育种中突变株的筛选方法产量突变株的筛选抗药性突变株的筛选营养缺陷型突变株的筛选

春日霉素产生菌的孢子悬液

诱变

涂布平板

培养2天（29℃）

培养4-5天(29℃)生物鉴定板上含供试菌种

培养17-18小时(29℃）

检查抑菌圈的大小保持合适的温、湿度产量突变株的筛选抗性突变体的筛选方法青霉素浓缩法梯度平板法青霉素浓缩法培养基(含青霉素)

接入敏感菌液（含抗性突变株）涂布抗青霉素菌落培养梯度平板法弱抗性中抗性强抗性底层不含异烟肼，上层含异烟肼接敏感菌含突变株抗药性突变株的筛选抗生素法菌丝过滤法青霉素法制霉菌素法原菌株(出发菌株)诱变剂处理淘汰野生型检出缺陷型鉴定缺陷型同一培养皿夹层培养法限量补充培养法不同培养皿逐个检出法影印接种法生长谱法营养缺陷型突变株的筛选方法举例——枯草杆菌氨基酸缺陷型菌体前培养氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定细胞悬浮液制备诱变处理中间培养淘汰野生型营养缺陷型菌株的检出：基本和完全培养基（使细胞处于对数生长期）（UV照射60s）（调整细胞浓度为108个/ml）（30度CM中振荡过夜培养）（青霉素法）（生长谱法）营养缺陷型突变株的筛选方法CM：完全培养基Amestest测定潜在化学治癌物理论依据一切生物的遗传物质基础都是核酸尤其是DNA，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。生物化学统一性法则生物的“三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变；反之亦然。基本原理Salmonellatyphimurium

的his-菌株在[-]的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。试验步骤：可疑“三致”试样

+

鼠肝匀浆S.this-[-]吸入滤纸片保温S.this+[-]

阳性

阴性

培养基因重组和杂交育种基因重组的定义两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。重组和杂交的关系重组是在核酸分子水平上的杂交，与细胞水平上的杂交有明显区别杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交一种形式。原生质体融合(protoplastfusion)通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。原生质体融合技术打破了微生物的种属界限，为远缘微生物间的重组育种展示了广阔前景。能进行原生质体融合的细胞极其广泛原核生物、真核生物、高等动植物、人体原生质体融合的主要步骤：①标记菌株的筛选；②原生质体的制备；③原生质体的再生；④原生质体的融合；⑤融合子的检出与鉴定。原生质体融合基本过程图原生质体融合的主要步骤：（1）标记菌株的筛选

在原生质体融合的过程中，所用的亲本需要携带一定的遗传标记以便于融合子的筛选。一般多采用营养缺陷型和抗性突变作为标记，也可以采用热致死（灭活）、孢子颜色、菌落形态作为标记。（2）原生质体的制备

获得有活力和去壁较为完全的原生质体是原生质体融合育种的关键步骤。在细菌和放线菌主要采用溶菌酶去壁，制备原生质体；在酵母菌和霉菌中一般采用蜗牛酶和纤维素酶。（3）原生质体的再生

酶解去壁后得到的原生质体应具有再生能力，即能重建细胞壁，恢复细胞完整形态并能生长、分裂，这是原生质体融合育种的必要条件。原生质体已经失去细胞壁，仅有一层10nm的细胞质膜，是失去了原有细胞形态的球状体。它具有生物活性，但不是一种正常的细胞，在普通培养基平板上不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生出来，以恢复细胞原有形态和功能。原生质体的再生必须使用再生培养基，再生培养基由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。（4）原生质体的融合

制备好的二亲本原生质体可以通过生物助融、物理助融或化学助融的方法融合。生物助融是通过病毒聚合剂，如仙台病毒等病毒和某些生物提取物使原生质体融合。物理助融是通过离心沉淀、电脉冲、激光等物理方法刺激原生质体融合。化学助融是通过化学助融剂刺激其融合，早期主要是用硝酸盐类，现在应用较多的是PEG加Ca2+。（5）融合子的检出与鉴定

融合子的检出主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。原生质体融合后产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体；另一种是细胞质发生了融合，而细胞核没有融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以以异核状态移接几代。因此，要获得真正的融合子，必须在融合的原生质体再生后，进行几代自然分离和选择，才能加以确定。对经过传代选出的稳定融合子，可以从形态学、生理生化及遗传学等几个方面进行鉴定，并最终筛选出稳定高产的融合子原生质体融合的特点1.重组频率高2.不受亲缘关系的影响3.能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种4.两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）原生质体融合真核微生物的基因重组基因重组的方式：有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化；（一）有性杂交

指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。生产实践中利用有性杂交培育优良品种的举例—酿酒酵母（S.cerevisiae）例如用乙醇发酵的酵母和利用面包发酵的酵母虽然是同一种酿酒酵母，但两者是不同的菌株。表现在前者产乙醇率高而对麦芽糖和葡萄糖发酵力弱，后者则产乙醇率低而对麦芽糖和葡萄糖的发酵力强。两者通过杂交，就得到了既能生产乙醇，又能将其残余的菌体综合利用作为面包厂和家用发面酵母的优良菌种。

以工业上常用的酿酒酵母加以说明。酿酒酵母有其完整的生活史。从自然界中分离到的，或在工业生产中应用的酵母，一般都是双倍体细胞。将不同生产性状的甲、乙两个亲本，分别接种到醋酸钠培养基等产孢子培养基斜面上，使其产生子囊，经过减数分裂后，在每个子囊内会形成4个单倍体子囊孢子，经机械法或者酶法破坏子囊，再经离心，然后用获得的子囊孢子涂布平板，就能得到单倍体菌落。

把两个亲本性别不同的单倍体细胞密集在一起就有更多机会出现双倍体的杂交后代。它们的双倍体细胞核单倍体细胞有很大不同，便于识别。有了各种双倍体的杂交子代后，就可以进一步从中筛选出优良性状的个体。比较项目双倍体单倍体细胞菌落液体培养在产孢培养基上大，椭圆形大，形态均一繁殖较快，细胞较分散会形成子囊小，球形小，形态变化多繁殖较慢，细胞常聚集成团不形成子囊酿酒酵母的双倍体和单倍体的比较准性生殖是一种类似于有性生殖，但更为原始的一种生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。准性生殖过程菌丝联结——频率低形成异核体——质配后两个单倍体核集中到同一细胞。核融合——异核体中的两个细胞核，低频率产生双倍体杂合子体细胞染色体交换和单倍体化—

双倍体杂合子不稳定，在进行有丝分裂过程中，极少数核内的染色体会发生交换和单倍体化，从而形成具有新性状的单倍体杂合子。（二）准性杂交比较项目准性生殖有性生殖参与接合的亲本细胞独立生活的异核体阶段接合后双倍体的细胞形态双倍体变为单倍体的途径接合发生的几率形态相同的体细胞有与单倍体基本相同有丝分裂偶然发现，几率低形态或生理上有分化的性细胞无与单倍体明显不同减数分裂正常出现，几率高

准性生殖和有性生殖的比较准性杂交育种选择亲本：营养缺陷型强制异合：分生孢子相互混匀[-]移单菌落：长出的菌落接种到[-]斜面检验稳定性：夹层法促进变异：诱变处理

增加新性状国内在灰黄霉素生产菌荨麻青霉的准性杂交育种（1）选择亲本由于荨麻青霉不产生有性孢子，因此只有极个别的细胞间才发生联结，且联结后的细胞在形态上无显著的特