流感病毒鉴定

流感病毒

鉴定PP汇

报

人

：XXXX2025年12月16日流感病毒生物学特性实时荧光定量PCR技术原理流感病毒检测技术概述流感病毒核酸检测流程CONTENTS目

录01030204技术应用与临床价值挑战与未来发展方向检测技术比较与选择CONTENTS目

录05070601流感病毒生物学特性病毒分类与结构特征病毒核心分类依据流感病毒属于正黏病毒科，依据核蛋白

(NP)

和基质

蛋白(MP)抗原性差异，分为甲、乙、丙、丁四型。

甲型变异性强易引发大流行，乙型变异较慢致季节性

流行，丙型症状轻多为散发，丁型主要感染家畜未发

现人感染病例。甲型病毒亚型划分甲型流感病毒根据表面血凝素

(HA)

和神经氨酸酶(NA)

抗原性不同分亚型，已发现18种HA(HI-H18)和11种NA(N1-N11),常见亚型如HIN1

、H3N2等，不

同亚型致病力与流行特征各异，2025年监测显示H3N2

为当前季节性流感主要亚型。病毒基本结构组成流感病毒呈球形(直径80-120nm)

或丝状，结构由外

至内分为包膜、基质蛋白和核心。包膜含HA和NA糖蛋

白刺突，基质蛋白(M1

、M2)

维持结构与参与复制，核心为分节段单负链RNA,

甲、乙型含8个节段，丙型7

个节段，与核蛋白等组成核糖核蛋白复合体。关键蛋白功能作用HA介导病毒吸附与宿主细胞膜融合，是中和抗体主要

靶点；NA水解唾液酸帮助病毒释放，为奥司他韦等药

物作用靶点：M2为离子通道蛋白，与病毒脱壳相关；核蛋白包裹病毒RNA,参与病毒复制与转录，这些蛋白

共同决定病毒感染与传播能力。Rotavirus亚型划分依据甲型流感病毒根据表面血凝素

(HA)和神经氨酸酶(NA)

抗原性差异划分亚型。目前已确认18种HA亚型

(H1-H18)

和11种NA亚型

(N1-N11),不同HA与NA组

合形成多种亚型。动物源亚型的潜在威胁部分亚型主要感染动物，如禽流感病毒

(H5N1

、H7N9、

H5N6等)和猪流感病毒

(H1N1v

、H3N2v等)。这些动物流感病毒在特定条件下可能跨越物种屏障感染人类，引发公共卫生关注。亚型变异与流行关系甲型流感病毒亚型的抗原漂移和转变是导致其持续流

行的重要原因。新亚型出现时，人群普遍缺乏免疫力，

可能引发不同规模的流行，因此监测亚型变化对流感

防控至关重要。常见人类感染亚型季节性流行的主要亚型包括H1N1和H3N2。例如2009年

全球大流行的甲型H1N1流感病毒，以及当前(2025年

监测数据)引起季节性流感的H3N2亚型。甲型流感病毒亚型多样性病毒变异机制与流行特征乙型流感：变异较慢与局部流行乙型流感病毒仅感染人类，抗原变异速度较慢，分

为Victoria

系和Yamagata系，通常引起局部或中小

型季节性流行，历史上未引发大流行。甲型流感：高变异与广泛流行甲型流感病毒变异性最强，宿主范围广(人、禽、

猪等),易发生抗原转变和漂移，是引起季节性流

行和大流行的主要病原体，如HIN1

、H3N2亚型。抗原转变：质变飞跃导致大流行甲型流感病毒因基因重配(如人与动物流感病毒基

因片段交换)产生全新亚型，称为抗原转变。人群

普遍缺乏免疫力，可引发世界性大流行，如2009年

新甲型HNI

流感大流行。抗原漂移：量变积累引发季节性流行流感病毒表面抗原

(HA

、NA)基因发生点突变或小

片段重组，导致抗原性小幅改变，称为抗原漂移。

人群对变异病毒株免疫力下降，引发每年季节性流

行，如甲型H3N2亚型的持续演变。02流感病毒检测技术概述病毒核酸检测病毒抗原检测病毒分离培养血清学检测通过实时荧光定量包括免疫荧光法和胶作为诊断流感的“金检测患者急性期和恢PCR技术检测流感病体金法。免疫荧光法标准”,通过接种呼复期双份血清抗体水毒核酸，具有高灵敏

度和特异性，能快速

判断感染及病毒类型，

数小时内出结果，适

用于各年龄段，尤其

适合症状不典型或需

早期诊断的患者。需在实验室用荧光显

微镜观察，结果可靠

但操作复杂；胶体金

法操作简便，15-30

分钟出结果，灵敏度

略低，但适合儿童、

老年人等需快速初步

判断的人群。吸道标本到细胞培养

并鉴定病毒类型，特

异性高，但操作复杂、

耗时3-10天，主要用

于科研和流行病学调

查，对严重基础疾病

患者可明确病毒特性，

指导治疗。平，效价4倍或以上

升高有诊断价值。主

要用于流行病学研究，

最常用的方法包括补

体结合、血凝抑制试

验、中和试验和ELISA等。实验室检测方法分类各类检测技术性能比较抗原检测操作简便，15-30分钟出结果，敏感性50%-70%,

可能出现假阴性，适合门诊快速筛查，阴性结

果需结合临床判断。血清学检测通过检测双份血清抗体滴度4倍及以上升高进

行回顾性诊断，对急性期诊断价值有限，适用于流行病学研究。病毒分离培养特异性高，可鉴定病毒亚型及耐药性，但操作

复杂、耗时3-10天，主要用于科研和流行病学

调

查

。核酸检测(实时荧光定量PCR)敏感性>95%,特异性高，可区分病毒类型和亚

型，检测时间2-4小时，是确诊的金标准，适

用于重症、住院患者及流行病学监测。替代传统方法的权威认可实时荧光定量PCR技术正逐步替代病毒分离培养，成为流感病毒

检测的“金标准”。其在敏感性、

特异性和检测效率上的综合优势，

使其在临床诊断、流行病学监测

和公共卫生应急中发挥不可替代

的作用。相较于传统病毒培养方法需3-10天，该技术数小时内即可出结果，助力医生迅速锁定病原体，制定

有效治疗方案。尤其能区分甲型

(如H1N1

、H3N2)

和乙型流感病

毒，为重症高危人群早期干预提

供关键依据。实时荧光定量PCR技术检测流感病毒核酸，具有高灵敏度(>95%)

和特异性，能准确识别病毒类型

及亚型，即使病毒数量微少也能

被及时发现，极大减少漏诊和误

诊的可能性。核酸检测技术的金标准地位高灵敏度与特异性的核心优势

快速诊断与精准分型的临床价值03实时荧光定量PCR技术原理核心原理：荧光信号与核酸扩增的同步监测01

实时荧光定量PCR技术结合PCR扩增与实时荧光检测，通过荧光标记的探针或染料，在DNA扩增过程中实时监测荧光信号变化，依据荧光强度与扩增产物量的正相关关

系，实现对靶病毒核酸的定性与定量分析。扩增与荧光标记：探针/染料的特异性结合提取的核酸加入含特异性引物和荧光标记物(如TaqMan探针或SYBR

Green染料)的反应体系，引物与病毒靶基

因序列结合，在PCR扩增时，探针被切割释放荧光分子

或染料嵌入双链DNA发光，荧光信号强度随扩增产物累积而增强。关键流程：样本处理与核酸提取02

首先采集患者鼻咽拭子等呼吸道样本，从中提取流感病毒RNA核酸，为后续扩增反应提供模板，确保样本中病毒遗传物质的有效分离与纯化。定量依据：Ct值与起始模板量的线性关系04

Ct

值(循环阈值)指荧光信号达到设定阈值时的PCR循环数，与样本中病毒核酸起始拷贝数呈线性负相关，通

过标准曲线可准确定量样本中流感病毒的初始浓度，实现从定性到定量的精准检测。技术基本工作原理03TaqMan

荧光探针探针两端分别标记报告荧

光基团和淬灭基团，完整

时荧光被淬灭；PCR扩增

时

，Taq酶的5'-3'外切酶

活性将探针酶切降解，释

放荧光分子，荧光信号强度与PCR产物量同步增加。

新型TaqMan-MGB探针可进

行基因定量分析和基因突

变(SNP)

分析。SYBR

荧

光

染

料非特异性掺入DNA双链后

发射荧光，不掺入链中则

荧光信号极低。荧光信号

增加与PCR产物增加完全

同步，可通过溶解曲线确

定PCR反应特异性，操作

简便但可能受非特异性扩

增影响。分子信标5'和3'末端形成发夹结构，使荧光基团与淬灭基团靠近，荧光被淬灭；PCR产物生成后，中间部分与特

定DNA序列配对，荧光基

因与淬灭基因分离产生荧

光，具有高特异性。核酸类似物法包括LNA(锁住核酸)、PNA

(肽核酸)、ZNA(ジップ核酸)等，通过特殊

的核酸类似物设计探针，

可提高探针与靶序列的结

合亲和力和特异性，适用

于特定序列的精准检测。荧光化学物质分类及特性Ct值与定量分析基础两种核心定量方法绝对定量通过构建标准曲线(横轴为核酸起始拷贝数对数，

纵轴为Ct

值),根据样品Ct

值计算初始模板量；相对定量

采用2(-△△CT)法，以管家基因作参照，无需标准曲线

即可实现目标基因相对表达量分析。Ct值与初始模板量的线性关系在PCR扩增指数期，模板Ct

值与起始拷贝数的对数存在严

格线性关系，公式为Ct=-1/1g(1+Ex)*1gXa+1gN/1g(1+Ex),

其中Ex为扩增效率，

X₀

为初始模板量，

N为荧光信号达阈

值时的产物量。Ct值的定义与意义Ct

值

(Cycle

threshold,

循环阈值)指PCR反应中荧光信

号达到设定阈值时所经历的循环数。其大小与模板起始拷

贝数呈负相关，是实时荧光定量PCR定量分析的核心依据。荧光阈值的设定原则默认荧光阈值通常设为3-15个循环的荧光本底信号标准偏

差的10倍

(threshold=10*SDcycle3-15),确保在扩

增反应的指数期内准确捕获荧光信号变化。主要检测方法技术对比核酸检测(实时荧光定量PCR)

病毒抗原检测采用实时荧光定量PCR技术，扩增病毒特异性基因片段，

敏感性>95%,特异性高，可区分病毒类型和亚型，是

确诊的“金标准”。检测时间约2-4小时，适用于重症

患者、住院患者及流行病学监测，但需专业实验室设

备，成本较高。通过检测病毒表面特异性抗原，常用胶体金法和免疫

荧光法。胶体金法操作简便，15-30分钟出结果，适合

快速初步判断，但灵敏度较低(约50%-70%),可能出现假阴性；免疫荧光法结果可靠但操作复杂，需实验

室荧光显微镜观察。检测患者急性期和恢复期双份血清中病毒特异性抗体

水平，效价4倍或以上升高有回顾性诊断价值，主要用

于流行病学研究，对急性期诊断意义有限，无法区分

当前或既往感染。作为传统“金标准”,将呼吸道标本接种到细胞或鸡

胚培养并鉴定病毒类型，特异性高，但操作复杂、耗

时3-10天，对实验室条件及操作人员要求高，主要用

于科研和流行病学调查，临床应用受限。病毒分离培养

血清学检测04流感病毒核酸检测流程标准采集操作流程采集鼻咽拭子时，将无菌拭子轻轻插入患者后鼻

孔，旋转停留数秒后取出；咽拭子则擦拭咽后壁

及双侧扁桃体。操作需轻柔规范，避免污染，确

保样本质量。样本处理与核酸提取实验室接收样本后，需在生物安全柜内进行处理。

使用商品化核酸提取试剂盒，严格按照说明书操

作，高效提取病毒RNA,

去除样本中的抑制物，为后续实时荧光定量PCR检测奠定基础。样本采集类型与时机首选鼻咽拭子或咽拭子，病毒含量高，尤其鼻咽拭子为推荐类型。最佳采集时间为发病后1-3天

内，此时病毒载量最高，可提高检测准确性；超

过7天可能因病毒减少导致假阴性。样本保存与运输要求采集后的样本应立即置于含病毒保存液的无菌管

中，4℃条件下可短期保存(≤4小时),长期保

存需-70℃及以下。运输过程中需保持低温，避

免反复冻融，以防核酸降解。样本采集与处理规范01020403RNA提取方法选择常用柱提法和磁珠法，柱

提法通过离心吸附与洗脱，

操作简便；磁珠法自动化程度高，适合批量处理，可有效去除蛋白、抑制剂

等杂质。样本采集与预处理采集鼻咽拭子或咽拭子样

本，应立即置于含RNA保

护剂的采样管中，避免RNA降解；对于下呼吸道

样本如痰液，需先进行液

化处理。RNase污染防控实验全程使用无RNase耗

材，操作环境定期用RNase抑制剂清洁；提取

试剂中添加β-巯基乙醇或RNase抑制剂，防止RNA

酶降解目标RNA。提取质量检测指标通过Nanodrop检测RNA浓

度(推荐100-500ng/μL)

和纯度

(A260/A280比值

1.8-2.

1);琼脂糖凝胶

电泳验证RNA完整性，确

保28S和18S条带清晰。RNA提取关键技术要点PCR反应体系优化策略引物与探针设计优化针对流感病毒保守基因区域设计特异性引物与探针，确保扩增效率与特异性。例如针对甲型流感病毒HA或NA基因，避免非特异性结合，可通过软

件预测二级结构及同源性分析提高设计准确性。反应组分浓度优化优化Mg²+浓度(通常1.5-2.5mmol/L)

、dNTPs(0.2-0.4mmol/L)及Taq酶用量(1-2.5U/反

应

)

,

避免引物二聚体及非特异性扩增。对于流感病毒检测，可适当调整探针浓度(0.1-0.3μmol/L)

以增强荧光信号强度。模板核酸提取质量控制采用磁珠法或柱提法高效提取鼻咽拭子等样本中

的病毒RNA,

去除抑制物(如血红蛋白、粘液蛋

白)。建议通过OD260/280比值(1.8-2.0)评估

RNA纯度，确保模板无降解，提高扩增成功率。热循环参数调整根据引物Tm值设置退火温度(通常55-60℃),采

用两步法PCR缩短反应时间。针对高GC含量区域可

适当延长延伸时间(30-60秒),确保流感病毒RNA逆转录及扩增效率，减少假阴性结果。扩增反应体系质量控制每批次检测需设置阳性对照

(已知浓度的流感病毒RNA)

、阴性对照(无RNA酶

水)和内参对照(如β

-actin

基因),确保扩增效率在90%-110%,R²值≥0.99。样本采集与处理质量控制采集鼻咽拭子时需深入鼻腔1-2厘米，确保获取足量呼

吸道上皮细胞；样本应在4℃条件下2小时内送检，

-

70℃可长期保存，避免反复

冻融影响核酸完整性。假阴性与假阳性排除措施对Ct值处于灰区样本，可更

换引物探针或采用病毒分离

培养验证；检测前通过柱提法去除样本抑制物(如血红

蛋白、黏液蛋白),降低扩

增干扰。Ct

值结果判读标准甲型流感病毒Ct值≤35为阳性，35-40需重复检测；乙

型流感病毒Ct

值≤38为阳性；

Ct

值>40或无扩增曲线判定为阴性，可排除流感病毒感染

。质量控制与结果判读标准05技术应用与临床价值甲型H3N2亚型流行案例2025年第48周全国流感监测显示，南、北方省份流感阳性率近50%,其中甲型H3N2为主要流行亚型，通过实时荧光定量PCR技术

可快速明确分型，指导临床用药与疫情防控。甲型H1N1亚型鉴别案例2009年全球甲型H1N1流感大流行期间，实时荧光定量PCR技术通过扩增HA和NA基因片段，准确区分该亚型与季节性流感病毒，为早期隔离和抗病毒治疗提供关键依据，降低重症发生率。乙型Victoria

系与Yamagata系鉴别某医院对流感样病例进行核酸检测，发现乙型流感病毒阳性样本

中，Victoria

系占比65%,Yamagata

系占35%,两种谱系的准确鉴

别有助于评估疫苗匹配度及调整防控策略，尤其对儿童和老年人

群体意义重大。流感病毒亚型鉴别案例分析核酸检测敏感性表现实时荧光定量PCR技术检测流感病毒

核酸，敏感性可达>95%,能在病毒载

量极低时准确检出，有效减少漏诊。与抗原检测对比数据相较病毒抗原检测50%-70%的敏感性，

实时荧光定量PCR敏感性显著更高；抗原检测虽15-30分钟出结果，但阴

性结果需结合核酸检测确认。核酸检测特异性优势该技术可特异性区分流感病毒类型及

亚型(如甲型H1N1

、H3N2,

乙

型Victoria

系、Yamagata

系

)

,

特

异

性

强，与其他呼吸道病毒无交叉反应。临床实验验证结果某临床研究显示，实验组采用实时荧

光定量PCR检测流感病毒，准确率显

著高于对照组免疫荧光层析法，低病毒载量检出率优势明显

(P<0.05)。敏感性与特异性实验数据重症病例早期诊断应用高危人群筛查价值

低病毒载量检出优势

指导抗病毒治疗时机

混合感染鉴别意义通过快速明确诊断，帮助医

生在发病48小时内及时启动奥司他韦等抗病毒药物治疗，提升治疗效果，减少并发症

发

生

。对老年人、年幼儿童、孕产

妇及有慢性基础疾病等重症高危人群，实时荧光定量PCR

技术可实现早期诊断，显著

降低重症发生率和死亡率。可有效识别流感病毒与其他

呼吸道病原体的混合感染情

况，为重症病例的综合治疗方案制定提供关键依据，加

强重症风险预警。该技术极高的灵敏度能检测

出微量病毒核酸，即使在感

染早期或病毒载量较低时也

可准确识别，避免因漏诊导

致重症风险延误。EPIDEMJOLOGY防控策略制定依据依据监测数据明确高危人群(如儿童、老年人、孕产妇及有基础疾病

者)感染率和重症率，可针对性制

定疫苗接种策略、医疗资源调配方

案及重点场所防控措施，提升公共

卫生应急响应效率。流行趋势早期预警通过实时荧光定量PCR技术对哨点

医院流感样病例进行监测，可及时

发现流感病毒活动强度变化，如2025年第48周全国哨点医院住院严

重急性呼吸道感染病例流感病毒核

酸检测阳性率达19.0%,为流行趋

势研判提供数据支撑。病毒变异动态追踪该技术能精准区分流感病毒类型及

亚型，如监测到当前季节性流感主

要亚型为甲型H3N2,有助于掌握病

毒变异情况，为流感疫苗株的选择

和更新提供科学依据，应对病毒抗

原漂移带来的防控挑战。公共卫生决策支持通过对流感病毒流行特征、传播链

及耐药性等信息的监测分析，为政

府部门制定季节性流感防控规划、

评估干预措施效果(如抗病毒药物

使用和隔离措施)提供关键科学依

据，保障公众健康。流行病学监测实践价值06检测技术比较与选择检测原理差异敏感性与特异性检测耗时与操作复杂度临床应用场景核酸检测基于实时荧光定量

PCR技术，通过扩增病毒特

异性基因片段实现检测；抗

原检测则通过免疫反应检测

病毒表面的特异性蛋白。核酸检测敏感性高(>95%)、

特异性强，是确诊“金标准”;抗原检测敏感性较低

(约50%-70%),可能出现

假阴性，特异性约90%-95%。核酸检测需专业实验室设备，耗时2-6小时；抗原检测操作简便，15-30分钟即可出结果，适合门急诊快速筛查。核酸检测适用于重症患者、

住院患者、流行病学监测及

需明确病毒亚型的情况；抗

原检测适用于症状明显的早

期患者快速初步判断，阴性

结果需结合临床综合判断。核酸检测与抗原检测对比操作复杂且周期长该技术操作繁琐，对实验室条件

及操作人员素质要求高，培养周

期长，通常需要3-10天才能出结

果，限制了其在临床快速诊断中的应用。传统诊断“金标准”病毒分离培养是诊断流感的传统

“金标准”,通过将呼吸道标本

接种到特定细胞(如原猴肾细胞、

Vero

细胞)或鸡胚中进行培养，利用红细胞吸附、血凝试验等方

法鉴定病毒类型，特异性高。科研与流行病学价值突出尽管临床应用受限，但病毒分离

培养可获得活病毒，用于病毒特

性研究、疫苗研发、药物敏感性

试验及流行病学调查，为流感防

控策略制定提供科学依据。病毒分离培养技术特点早期诊断与重症患者场景实时荧光定量PCR技术检测流感病

毒核酸，具有高灵敏度和特异性，

数小时内出结果，适用于症状不

典型、高危人群及住院患者，能

快速锁定病原体并分型。回顾性诊断与免疫评估场景血清学检测通过比较急性期和恢

复期双份血清抗体滴度(4倍及以

上升高)进行回顾性诊断，适用

于流行病学调查及评估疫苗免疫

效果。门急诊快速筛查场景病毒抗原检测(胶体金法)操作

简便，15-30分钟出结果，适用于

儿童、老年人等需快速初步判断

的人群，但灵敏度略低，阴性结

果需结合临床判断。科研与流行病学调查场景病毒分离培养作为诊断“金标准”,特异性高，但操作复杂、

耗时3-10天，主要用于病毒特性

研究、疫苗研发及追踪病毒变异

情况。不同检测方法适用场景07挑战与未来发展方向抗原检测：灵敏度不足易漏诊快速抗原检测(如胶体金法)操作简便，15-30分钟

出结果，但灵敏度较低(约50%-70%),可能出现假

阴性，尤其在病毒载量低时，需结合临床症状判断。血清学检测：时效性差难早期诊断通过检测急性期和恢复期双份血清抗体滴度变化(需间隔2-4周),主要用于回顾性诊断或流行病学

研究，对急性期感染诊断价值有限，无法指导早期

治疗。病毒分离培养：耗时冗长难应急作为传统“金标准”,病毒分离培养特异性高，但

操作复杂、耗时3-10天，对实验室条件及人员要求

高，主要用于科研和流行病学调查，无法满足临床

快速诊断需求。核酸检测：成本与技术门槛较高实时荧光定量PCR虽为“金标准”,但检测耗时2-6

小时，需专业实验室设备和技术人员，成本较高，基层医疗机构普及受限，且存在样本抑制物干扰等

问

题

。现有技术局限性分析单一体系多重病毒鉴别技术