【《荧光型氧敏感探针研究的国内外文献综述》4700字】

荧光型氧敏感探针研究的国内外文献综述氧敏感荧光探针按化学结构大致分为过渡金属配合物类、有机荧光染料类。1过渡金属配合物荧光探针过渡金属配合物是目前广泛应用的氧气敏感荧光探针，常用的过渡金属中心离子有钌(II)、铱(III)、锇(II)、铂(II)、钯(II)等，常采用联吡啶、邻菲罗琳、卟啉、苯基吡啶等双齿或多齿结构作为配体[37]。过渡金属配合物的量子产率较高而且荧光寿命比较长，荧光的机理属于MLCT机理，电子从过渡金属配合物的基态跃迁到金属-配体电荷转移态[38]，发生氧分子荧光猝灭效应的同时不会消耗氧气含量，在使用环境中能保持稳定，并且对氧分子的检测具有良好的常氧-乏氧循环性，是光学氧传感中一类比较常用的发光材料。氧气会对荧光探针有淬灭作用，根据氧气对探针的淬灭程度测量氧分压[39]。在特定光激发下，被激发的电子进到三重态。当自旋禁止跃迁发生时，电子返回到它的单态基态（如图1.10），并以荧光的形式发出光子[40]。图1.10荧光氧淬灭过程示意图Figure1.10Schematicdiagramoffluorescenceoxygenquenchingprocess[38]由于这些禁止跃迁的存在，荧光探针通常具有更长的荧光寿命(10-6-10-2μs)。然而在猝灭剂氧气的存在下，发光团与猝灭剂之间的快速碰撞作用会导致无辐射衰变，发生荧光猝灭。因此，发射强度和辐射衰减率与局部氧浓度成正比。通过Stern-Volmer方程[41-44]，该方程给出了寿命(或量子产率)和氧分压(或浓度)之间的关系，荧光强度可以转化为氧分压。基于荧光淬灭原理，已经开发了几种不同的乏氧传感策略，其中最直接的方法是基于荧光强度的成像。这种方法利用了荧光在常氧条件下保持淬灭，在乏氧环境下变得活化，如图1.11所示。图1.11基于荧光发射强度的氧淬灭荧光探针Figure1.11Oxygenquenchedfluorescentprobebasedonemissionfluorescenceemissionintensity[42]过渡金属配合物如铱(III)配合物[45,46]、钌(II)配合物[47-50]、金属卟啉[51,52]在过去的几十年里已被用于肿瘤乏氧传感。基于荧光发射强度开发的几种过渡金属配合物在细胞实验和体内荷瘤实验中，都显示了高精确度的乏氧检测能力[53]。Zhang等人[54]为了对体内常氧-乏氧循环进行成像，设计了一种蒽醌修饰配体的联吡啶钌配合物（结构见图1.12），该分子不仅能实现双光子成像，而且可以对肿瘤内乏氧以及还原性微环境进行双重响应。经过配体结构改性的钌配合物在乏氧条件下的荧光寿命最高可以达到160ns，荧光量子产率也达到0.92%。这种新型荧光探针分子可以更深入到生物组织内，在800nm波长的激光辐照下，可以实时观察三维肿瘤组织内部乏氧情况和斑马鱼常氧-乏氧循环过程，在活细胞和体内实现了可逆双光子发光探针循环成像。图1.12用于循环乏氧成像的双光子发光探针钌(II)蒽醌配合物示意图Figure1.12SchematicillustrationoftheRu(II)anthraquinonecomplexesastwo-photonluminescentprobesforcyclinghypoxiaimaging[54]Zheng等人开发了一种pH激活的特异性乏氧成像探针。该探针中，铱(III)配合物和一根带氨基的PEG链通过席夫碱反应共价偶联[55]。亚胺键在酸性条件下发生水解，导致发射峰从610nm红移到705nm（如图1.13所示）。探针在乏氧环境中被激活，被激活探针的数量与氧含量成反比。肝癌小鼠模型证明该探针在肿瘤乏氧和酸性微环境下，705nm处的荧光强度信号增强了10倍。Tobita等人[56]以铱配合物为模板，设计了一类能靶向运输定位到各种不同细胞器中氧敏感探针分子，都表现出良好的细胞内氧检测性能，另外可以通过修饰配体来调控这一类探针分子的荧光发射波长。图1.13荧光分子的化学结构和激活途径Figure1.13Chemicalstructureandactivationpathwayoffluorescentmolecules[55]肿瘤组织和正常组织在氧浓度和pH值上的显著差异，一定程度上会阻碍高灵敏度的肿瘤成像。在肿瘤微环境中，乏氧癌组织的氧浓度为0-3%，常氧值约为20%左右，肿瘤组织pH值始终在5.5-6.0左右，与正常组织(pH=7.4)差距明显[57-60]。因此近年来，一些用于pH和氧敏感多重传感的光学传感器受到广泛的关注，上文提到的两种探针就是典型代表。Han等人[61]开发了一类新型的铱(III)荧光探针Ir-1和Ir-2，通过对肿瘤微环境酸性和乏氧的双重感知，在二维单层细胞和三维肿瘤组织中，可以获得比使用单一感知参数(酸性或乏氧)更强的荧光发射强度和更高的荧光寿命，提高了氧敏感成像效果。图1.14（c）MCF-7细胞负载Ir-1的共聚焦图；（d）MCF-7细胞负载Ir-2的共聚焦图Figure1.14(c)ConfocallaserimagesofMCF-7cellsloadedwithIr-1;(c)ConfocallaserimagesofMCF-7cellsloadedwithIr-2[61]钌多吡啶配合物[Ru(dpy)n]n+一般都具有较强的荧光发光强度，较大的Stokes位移，但是这些过渡金属配合物的细胞摄取能力较低，细胞毒性也比较大。Kitajima等人证明[62]，通过合理的分子设计可以降低钌配合物荧光分子的细胞毒性。钌配合物通过化学键共价结合到介孔二氧化硅纳米颗粒的内表面，形成一种新的发光分子(MSN-Ru)，粒径增大(487±54nm)。由于介孔二氧化硅纳米颗粒本身固有的纳米尺度特性，MSN-Ru与初始的钌配合物相比，细胞毒性下降的同时，荧光发射强度也基本保持不变，达到良好的乏氧成像效果。图1.15MSN-Ru孵育的HeLa细胞荧光成像图Figure1.15FluorescenceimageofHeLacellsincubatedwithMSN-Ru[62]本课题组前期[63]制备了一种基于FRET机理实现上转换发光的CD-Ru-mPEG的共轭体系，将氧敏感探针钌配合物Rud2b与荧光供体碳量子点通过化学键接，同时修饰上高分子单甲基聚乙二醇，组成了一种上转换发光的纳米传感器（CD-Ru-mPEG），该传感器体系是一种通过分子间作用力形成的聚集态结构，高分子链的存在将荧光探针有效隔离，从而抑制了荧光聚集淬灭效应，提高了氧浓度响应性，复合探针CD-Ru-mPEG比单独Rud2b探针具有更好的荧光性能以及氧浓度响应性，CD-Ru-mPEG在上转换模式下能进行灵敏的氧浓度检测，实验证明该聚集态结构的纳米探针，不仅在水溶液中和细胞内可以进行乏氧成像，还可用于体内氧浓度的传感以及肿瘤的检测，丰富了生物医用体内上转换乏氧成像体系。图1.16氧探针CD-Ru-mPEG的合成、自组装和胞内光致发光Figure1.16Illustrationofthesynthesis,self-assemblyandintracellularphotoluminescenceofCD-Ru-mPEG[63]在光学乏氧成像中，单波长的荧光强度测量是最常见的成像方法，但是由于探针产生的信号会受到光漂白、激发强度、图像采集设置等参数的很大影响，因此很难获得有关缺氧程度的定量信息。更理想的氧浓度定量模式是基于荧光寿命的成像，因为它可以提供准确的信号。荧光寿命成像需要特殊的软件和硬件来支持检测，要求成像仪器设备更高级，成本较高、测试时间较长。荧光寿命成像显微镜(FLIM)利用荧光探针的荧光寿命只与氧气浓度相关的原理，通过Stern-Volmer方程来测量氧浓度。因为荧光寿命与肿瘤组织中的探针浓度和分布位置无关，这样测量生物组织内的氧气更加准确客观。荧光寿命测量减少了基于荧光强度测量会受到外界多种因素的测试干扰，也消除了细胞自身背景带来的荧光误差，因此采用荧光寿命成像会得到更好的分辨率和灵敏度[64]，信噪比取得极大的提升。钌(II)和铱(III)配合物的荧光寿命大约在30-100μs之间[65]，而金属卟啉具有较长的荧光发射寿命(100-1000μs)。金属卟啉结构由于其独特的光学特性，在乏氧传感方面具有可调控性，因此非常适合设计成分子探针和纳米传感器。Wu课题组[66]制备了一种以Pt卟啉和芴作为单体，通过聚合反应制成一种比率型荧光金属聚合物，在该荧光聚合物中，芴作为能量供体组分，Pt卟啉作为能量受体组分，两者中可以实现Forster能量转移效应（FRET），研究中用365nm的波长激发，荧光发射峰分别处于651nm以及713nm。最后通过自组装形成聚合物纳米粒子，增加了水溶性，进一步改善了荧光探针的生物相容性。研究发现，通过FRET可以极大地提升氧传感性能，该粒子的荧光寿命也从4.7μs（常氧环境下）增大为33.7μs（乏氧环境下），提升的程度高达7倍，最后通过对裸鼠肿瘤乏氧荧光成像成功实现了体内氧敏感成像实验。图1.17荧光共轭聚电解质P2的化学结构Figure1.17ThechemicalstructureoffluorescentconjugatedpolyelectrolyteP2[66]Huang等人[67]设计了一种多功能化共轭高分子荧光纳米粒子，高分子共轭主链可以通过FRET将能量供给Pt氧敏感探针，用375nm的波长激发，聚芴的荧光发射峰是420nm，与Pt卟啉荧光激发峰相匹配，Pt卟啉因此被激发，发射出650nm的红光，从Stern-Volmer曲线可以看出线性关系拟合较好，KSV为0.0163M-1。研究证明，这种纳米粒子可以在肿瘤中成功实现乏氧成像诊断和联合光动力治疗。图1.18Pt氧敏感荧光探针的结构Figure1.18ChemicalstructureofPtcomplexfluorescenceprobe[67]2有机类荧光染料有机荧光染料是最开始研究的一类氧气敏感材料，大多数都含有杂原子，如N、O、S原子，分子一般是平面结构，因为苯环的缘故，拥有较强的结构刚性，荧光效率较高。有机荧光染料中含有未键合的孤对电子，所以从基态跃迁到激发态的吸收谱是连续的，荧光激发和发射光谱的区域较宽，其荧光性能满足对氧的检测。但是溶剂的极性和pH等因素容易影响有机染料的荧光性能，这些不利因素会限制它们的应用。多环芳香烃是在有机染料的基础上发展起来的，从结构上来看其最大的特点就是两个以上的芳香环合并在一起，苯环之间有共用的碳原子，这种特殊的分子结构可以形成更大的共轭体系，所以多环芳香烃类染料更易发生的π→π*的跃迁，摩尔吸光系数大，与其他有机染料（n→π*、n→σ*）相比，荧光强度更大，荧光量子产率更高。由硝基咪唑衍生物组成的生物乏氧标记物，已被广泛用作检测乏氧组织的常规材料。硝基咪唑衍生物在氧分压低于10mmHg时与细胞形成共价键，通过免疫组化染色可以看到固定在组织切片乏氧区域的探针分子，但这种方法不适用于活细胞或组织实时检测氧含量。有鉴于此，Nagasawa等人开发了一种不需要免疫组化染色的乏氧标记物，由2-硝基咪唑和三碳花菁组成的近红外(NIR)荧光探针（GPU-167）。实验证明，将GPU-167注入到荷瘤小鼠体内，可以顺利的实现体内肿瘤乏氧成像[68]。Smith等人开发了一种由4-硝基咪唑和吲哚菁绿构成的近红外荧光探针，可以对肿瘤乏氧进行成像[69]。Jayagopal等人合成了由基于2-硝基咪唑的荧光染料。该成像探针能够检测乏氧的视网膜细胞和组织（如图1.19），具有高消光系数，高荧光量子产率，高荧光稳定性和良好的组织穿透性。其中乏氧敏感的功能来源于分子结构中的2-硝基咪唑部分，因为它能在低氧浓度条件下被活性增强的硝基还原酶高效还原，从而实现活体动物的视网膜乏氧检测成像[70]。图1.19视网膜平面的OIR模型Figure1.19RetinalflatoftheOIRmodel[70]Hanaoka等人合成了一种具有FRET效应的荧光分子（RHyCy5），其中FRET共振能量转移的受体是QSY-21，FRET供体是花菁素染料Cy5。在低氧条件下QSY-21发生还原，导致其在660nm处的吸光度显著下降。此时，FRET效应消失，染料荧光变强。当重新暴露于常氧条件后，QSY-21自由基被重新氧化为初始状态[71]，由于FRET的恢复，供体Cy5荧光被猝灭，研究发现该分子可以实现A549细胞的乏氧-常氧多次循环成像。图1.20氧探针RHyCy5可逆检测乏氧的机理Figure1.20ProposedmechanismofreversibledetectionofhypoxiabyRHyCy5[71]Chen等人研究报道了一种高效的荧光探针，通过将光敏剂封装在HIF抗体功能化的脂质体内，用于肿瘤细胞乏氧成像，同时利用硝基还原酶(NTR)来激活光动力治疗从而杀死肿瘤细胞。体内和体外实验表明，脂质体作为光敏剂，具有很高的单线态氧（1O2）产率，能实现对癌细胞的靶向光动力治疗，不会误伤正常细胞[72]。更重要的是，该荧光探针中能够同时检测HIF-1α和NTR两种参数，显著提高了肿瘤乏氧成像的准确性，为肿瘤乏氧诊疗一体化提供了新的途径。图1.21荷瘤小鼠随时间变化的体内荧光成像Figure1.21Time-dependentfluorescenceimagingoftumor-bearingmiceinvivo[72]参考文献[1]KangKJ,PhamTH,MoonH,etal.Amicrobialfuelcellwithimprovedcathodereactionasalowbiochemicaloxygendemandsensor[J].BiotechnologyLetters,2003,25(16):1357-1361.[2]FerreiraKN,IversonTM,MaghlaouiK,etal.Architectureofthephotosyntheticoxygen-evolvingcenter[J].Science,2004,303(5665):1831-1838.[3]JiangJ,GaoL,ZhongW,etal.Developmentoffiberopticfluorescenceoxygensensorinbothinvitroandinvivosystems[J].RespiratoryPhysiology&Neurobiology,2008,161(2):160-166.[4]SakaueH,GregoryJW,SullivanJP,etal.Porouspressure-sensitivepaintforcharacterizingunsteadyflowfields[J].AIAAJournal,2002,40(6):1094-1098.[5]KamalesonAS,GonsalvesMJ,KumarS,etal.Spatio-temporalvariationsinsulfur-oxidizingandsulfate-reducingbacterialactivitiesduringupwellingoffsouth-westcoastofIndia[J].Oceanologia,2019,61(4):427-444.[6]SidhureddyB,DondapatiJS,ChenA,etal.Shape-controlledsynthesisofCo3O4forenhancedelectrocatalysisoftheoxygenevolutionreaction[J].ChemicalCommunications,2019,55(25):3626-3629.[7]JeonGW,SheldonRA,FerrieroDM,etal.Hypoxia-induciblefactor:roleincellsurvivalinsuperoxidedismutaseoverexpressingmiceafterneonatalhypoxia-ischemia[J].KoreanJournalofPediatrics,2019,62(12):444-449.[8]SegardT,RobinsPD,YusoffLF,etal.Detectionofhypoxiawith18F-FMISOPET/CTinsuspectedorprovenpancreaticcancer[J].ClinicalNulcearMedicine,2013,38(1):1-6.[9]DesikanRS,SegonneF,FischlB,etal.AnautomatedlabelingsystemforsubdividingthehumancerebralcortexonMRIscansintogyralbasedregionsofinterest[J].Neuroimage,2006,31(3):52-60.[10]LinH,ShenY,ChenD,etal.Feasibilitystudyonquantitativemeasurementsofsingletoxygengenerationusingsingletoxygensensorgreen[J].JournalofFluorescence,2013,23(1):41-47.[11]BiancoAD,BaldiniF,BacciM,etal.Anewkindofoxygen-sensitivetransducerbasedonanimmobilizedmetallo-organiccompound[J].Sensors&ActuatorsBChemical,1993,11(1193):347-350.[12]YuC,LiY,LiangM,etal.Characteristicsandhazardsofthecinnamaldehydeoxidationprocess[J].RSCAdvances,2020,10(32):19124-19138.[13]MagdalenaP,OlgaRS,LeanneMR,etal.Reducedadiposetissueoxygenationinhumanobesityevidenceforrarefaction,macrophagechemotaxis,andinflammationwit