微生物检验现场操作方案

微生物检验现场操作方案一、概述

微生物检验是食品、药品、环境等领域质量监控的重要环节。本方案旨在规范现场微生物检验的操作流程，确保检验结果的准确性和可靠性。方案涵盖样品采集、运输、处理、培养及结果判读等关键步骤，适用于实验室外的现场快速检测。

二、样品采集与处理

（一）样品采集

1.选择代表性样品：根据检验目的，从批次的上下、中心及边缘位置采集样品，确保样品均匀。

2.使用无菌工具：采样工具（如无菌棉签、取样勺）需提前灭菌，避免污染。

3.样品量：液体样品取10-50mL，固体样品取10-20g，确保足量检测。

4.标记与记录：样品需标注来源、采集时间等信息，并立即记录。

（二）样品运输

1.低温保存：使用冷藏箱（2-8℃）运输，避免样品变质。

2.防止泄漏：液体样品用密封袋包装，固体样品用无菌袋装。

3.时间控制：运输时间不超过4小时，确保样品活性。

（三）样品处理

1.液体样品：摇匀后取适量稀释，如1:10、1:100梯度稀释。

2.固体样品：采用均质法，如研磨或捣碎后加入无菌生理盐水。

3.无菌操作：处理过程需在超净工作台进行，避免二次污染。

三、微生物培养与检测

（一）培养基准备

1.挑选适宜培养基：如营养琼脂（NA）、麦康凯琼脂（MAC）等。

2.灭菌处理：高压蒸汽灭菌（121℃，15min），确保无菌。

3.冷却后倾注：培养基冷却至45-50℃时倾注培养皿。

（二）接种与培养

1.接种方法：

(1)平板划线法：用于分离纯培养。

(2)显微镜直接涂片：观察形态。

2.培养条件：

(1)温度：35-37℃。

(2)湿度：95%以上。

(3)时间：24-48小时。

（三）结果判读

1.计数方法：

(1)平板计数法：计算CFU/mL或CFU/g。

(2)显微镜计数法：使用血细胞计数板。

2.鉴定依据：

(1)形态观察：菌落形状、颜色、大小。

(2)生化实验：如氧化酶、糖发酵等。

四、质量控制

（一）阳性对照

1.每批次检验加入已知菌悬液，验证培养基及操作有效性。

2.对照菌种：如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

（二）阴性对照

1.空白培养基，检测是否存在污染。

2.如出现菌落，则样品或操作过程需重新检测。

（三）精密度控制

1.重复实验：同一样品平行检测3次，计算变异系数（CV）。

2.允许范围：CV≤5%，视为准确。

五、注意事项

1.个人防护：佩戴手套、口罩，必要时穿防护服。

2.设备消毒：使用75%酒精或消毒液定期清洁工作台。

3.数据记录：详细记录每一步操作及结果，避免遗漏。

六、应急处理

（一）污染发现

1.立即停止操作，隔离污染样品。

2.更换培养基及工具，重新检测。

（二）样品变质

1.检查运输及保存条件是否合规。

2.如无法恢复活性，需报告并废弃样品。

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**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.**选择代表性样品**：

为确保检验结果能反映整体状况，样品的代表性至关重要。应避免随意取样，需按照特定方法从目标批次的多个位置采集。例如，对于散装固体样品（如粮食、粉末），应采用五点取样法：取批次四个角各一份样品，再加取中心一份样品。混合均匀后，按比例取出所需检验样品。对于包装好的产品（如袋装食品、瓶装液体），应从不同批次、不同时间生产的产品中随机抽取，每个批次至少抽取3个样品。取样时，注意避免破坏包装完整性，尤其对于无菌样品。

2.**使用无菌工具**：

所有接触样品的工具必须是无菌的，以防止外来微生物污染。常用工具包括：

(1)无菌取样勺/铲：用于固体样品，需使用前用酒精灯火焰烧灼勺柄或使用一次性无菌取样勺。

(2)无菌棉签：用于表面采样或少量液体取样，需从无菌包装中取出，旋紧尾部盖，避免棉签头接触包装外表面。

(3)无菌注射器/移液管：用于液体样品定量取样，需确保针头和管身无菌。

工具在使用前，应通过高压蒸汽灭菌（121℃，15-20分钟）或使用有效的化学消毒剂（如70-75%乙醇溶液）进行灭菌。

3.**样品量**：

样品量的大小直接影响检验结果的准确性和统计意义。一般建议：

(1)液体样品：取10mL至50mL，具体量根据样品预期浓度和检验方法要求确定。

(2)固体样品：取10g至20g，确保有足够的微生物负载。

(3)半固体/凝胶样品：取适量（如5g-10g）置于无菌容器中。

4.**标记与记录**：

每个样品必须进行清晰、持久的标记，并详细记录相关信息，以防混淆。标记内容应包括：

(1)样品编号：唯一标识符。

(2)样品类型：如原辅料、成品、环境表面等。

(3)来源信息：生产批号、生产线、日期等。

(4)采集地点：具体位置。

(5)采集人及日期时间。

记录应存档，以便后续数据追溯。

（二）样品运输

1.**低温保存**：

微生物对温度敏感，尤其是一些致病菌或快速生长的微生物。运输过程中应保持样品处于低温环境，以抑制微生物生长，减缓其代谢活动。通常使用带冰袋或冷藏箱（温度设定在2℃至8℃之间）进行运输。对于要求更严格（如冷冻）的样品，应使用干冰或专用冷冻运输箱。运输时间应尽量缩短，原则上液体样品不超过4小时，固体样品不超过6-8小时，以减少微生物变化。

2.**防止泄漏**：

样品容器应密封良好，特别是液体和半流体样品，以防止运输途中泄漏、污染环境或导致样品成分改变。使用带塞子的瓶装样品，或对袋装样品进行二次包装（如放入密封袋或防漏箱中）。固体样品应使用不易破损的无菌袋或容器。

3.**时间控制**：

运输时间是影响样品状态和检验结果的重要因素。应严格遵守规定的运输时限，超过时限的样品可能需要重新采集或进行特殊处理说明。现场操作人员需记录样品从采集到开始检测的实际时间。

（三）样品处理

1.**液体样品**：

处理液体样品的目标通常是进行稀释，以使样品中的微生物浓度适合后续的平板计数或其它检测方法。稀释步骤通常如下：

(1)**初步稀释**：根据预估的微生物浓度，加入适当体积的无菌稀释液（如生理盐水、BufferedPeptoneWater）进行首次稀释。例如，取1mL样品加入9mL稀释液中，得到10倍稀释液。

(2)**系列稀释**：若初步稀释后的样品仍过浓，可继续进行梯度稀释。常用方法是将前一步稀释液再进行10倍稀释，如此反复，直至获得适宜浓度的稀释液（如平板上预计形成30-300个菌落）。记录每一步的稀释倍数。

(3)**混匀**：每次稀释后，必须充分混匀样品，确保稀释液与样品混合均匀。可用无菌吸管吹吸或轻轻摇动容器。

2.**固体样品**：

固体样品的微生物通常存在于表层或与液体结合的部分。常用处理方法有均质法、倾注法等：

(1)**均质法（用于均质样品）**：将适量固体样品（如肉、蔬菜）放入无菌均质袋或均质器中，加入适量无菌稀释液（通常为样品量的1-5倍），充分混合均匀，制成匀质悬液。

(2)**捣碎法（用于大块或不易均质的样品）**：取适量样品置于无菌研钵中，加入少量稀释液或无菌生理盐水，用无菌压碎棒或研杵充分捣碎，然后加入适量无菌稀释液定容。

(3)**倾注法（直接用于某些固体表面取样）**：用无菌棉签在样品表面多点取样，然后将棉签在含有无菌稀释液的试管中充分搅动，制成样品悬液。

3.**无菌操作**：

样品处理过程必须在严格的无菌环境下进行，以防止环境中的微生物污染样品。推荐在超净工作台或生物安全柜内操作。操作前需洗手消毒，穿戴洁净工作服、手套。所有使用的容器、工具、稀释液均需无菌。操作过程中避免说话、咳嗽等可能造成飞沫污染的行为。处理完毕后，清理操作区域，并正确处理使用过的废弃物。

**三、微生物培养与检测**

（一）培养基准备

1.**挑选适宜培养基**：

根据检验目标和待检微生物的特性，选择合适的培养基。常用类型包括：

(1)**通用营养培养基**：如营养琼脂（NutrientAgar,NA），用于通用微生物的总数计数或一般培养。

(2)**选择性培养基**：如麦康凯琼脂（MacConkeyAgar,MAC），用于选择性培养革兰氏阴性菌，并区分乳糖发酵菌。

(3)**鉴别培养基**：如TSI（三糖铁琼脂）、MR-VP琼脂，用于鉴定特定细菌的代谢特性。

(4)**特殊用途培养基**：根据具体需求选择，如含药培养基（用于药敏试验）、特殊营养添加剂的培养基（用于特定微生物）。

2.**灭菌处理**：

培养基必须彻底灭菌，以杀死所有杂菌。最常用的高压蒸汽灭菌法参数为：121℃、15psi（约103kPa）、维持15-20分钟。对于含特殊成分（如某些抗生素）或难溶性成分的培养基，可能需要调整灭菌条件或时间。灭菌前确保包装完好，防止培养基在灭菌过程中吸潮。

3.**冷却后倾注**：

灭菌后的培养基需冷却至适宜倾注的温度，通常为45℃-50℃。温度过高易导致菌落融合，过低则难以倾注均匀。可在水浴锅或培养箱中精确控制温度。倾注时，一手持培养基瓶，另一手持无菌培养皿，快速将培养基倒入皿中，每个皿约15-20mL，迅速盖上皿盖，水平静置冷却凝固。注意避免产生气泡。

（二）接种与培养

1.**接种方法**：

(1)**平板划线法（用于分离纯培养）**：

a.左手持皿，皿盖略微打开形成约30-45度角。

b.右手持接种环（火焰灭菌冷却后），蘸取少量菌悬液或挑取少量菌落。

c.在平板表面平行划三条直线（第一次划线），接种环冷却后重新火焰灭菌，然后转90度，划第二条线（第二次划线），再转90度划第三条线（第三次划线）。

d.每次划线后用火焰灭菌接种环，线条应相互隔离，最终形成分散的单个菌落。

(2)**倾注平板法（用于计数或某些特殊培养）**：

a.将融化的培养基（45-50℃）冷却至45℃左右。

b.左手持皿，皿盖打开约30度。

c.用无菌吸管吸取定量（如0.1mL）的菌悬液，加入皿中。

d.迅速倾倒培养基，立即旋转均匀混匀。

e.静置冷却凝固后倒置培养（防止冷凝水滴落污染菌落）。

(3)**显微镜直接涂片法（用于形态观察或快速检测）**：

a.制备菌悬液或挑取少量菌落。

b.在洁净载玻片上滴加少量生理盐水或固定液。

c.用接种环或刮刀挑取菌样，混入液体中，涂抹均匀成薄层。

d.待干燥后（必要时加温），固定（如火焰烧灼或甲醇固定），进行染色（如革兰染色）后在显微镜下观察。

2.**培养条件**：

培养是微生物生长繁殖的过程，需提供适宜的环境条件：

(1)**温度**：大多数细菌最适生长温度为35-37℃。嗜冷菌在20℃左右，嗜热菌需50℃以上。应根据待检微生物特性选择。培养时，将平板或试管置于恒温培养箱中。

(2)**湿度**：培养环境需保持高湿度（约95%），以防培养基失水，影响微生物生长。通常在培养箱内进行。

(3)**时间**：大多数细菌需24-48小时培养可见典型菌落。有些酵母菌、霉菌生长较慢，可能需48-72小时或更长时间。特定快速检测方法可能缩短至几小时。培养结束后需记录时间。

(4)**气体环境**：大多数需氧菌在空气（氧气充足）中培养。厌氧菌需在无氧环境（如厌氧罐、厌氧袋）中培养。兼性厌氧菌可在空气或微氧条件下生长。

（三）结果判读

1.**计数方法**：

(1)**平板计数法（MPN法或直接计数）**：

a.**直接计数（适用于典型菌落）**：在显微镜下，使用血细胞计数板计数特定区域内的菌落数，结合稀释倍数计算CFU/mL或CFU/g。

b.**菌落计数（最常用）**：观察平板上形成的单个菌落，计数。选择菌落数在30-300个的平板进行计算。计算公式：CFU/mL（或g）=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL或g）。

c.**最可能数法（MPN法，适用于水等液体样品）**：将样品进行系列稀释，接种到三管系列MPN培养管中，培养后计数阳性管数，查MPN表得到估计的微生物数（MPN值）。

(2)**显微镜计数法**：适用于悬液直接计数或平板菌落计数。使用血细胞计数板或专门微生物计数器，根据视野内菌体数量和稀释倍数计算浓度。

2.**鉴定依据**：

(1)**形态观察**：

a.**菌落形态**：形状（圆形、不规则等）、大小、边缘（整齐、波状、丝状等）、颜色（白、黄、绿、红等）、隆起程度（扁平、凸起、脐状等）、透明度（透明、半透明、不透明）。

b.**菌体形态**：通过革兰染色观察细菌是革兰氏阳性（紫色）还是革兰氏阴性（红色/粉色）。进一步观察细菌的形状（球菌、杆菌、螺旋菌等）、大小、排列方式（单个、对、链、簇等）。

(2)**生化实验**：

a.**糖发酵实验**：检测细菌对特定糖类的代谢能力（如乳糖、蔗糖、葡萄糖发酵产酸产气）。常用TSI、MR-VP实验组合判断。

b.**氧化酶实验**：检测细菌是否产生氧化酶，用于区分某些假单胞菌属等。

c.**其它生化反应**：如凝固酶试验（用于金黄色葡萄球菌鉴定）、卵磷脂酶试验等。

(3)**（可选）分子生物学方法**：如PCR、基因测序等，用于精确鉴定物种，尤其在形态和生化特征不典型时。

**四、质量控制**

（一）阳性对照

1.**目的与操作**：

阳性对照是为了验证培养基是否适宜、灭菌是否彻底、操作过程是否具备检出能力。每次检验都必须包含阳性对照。通常在相同的操作条件下，使用已知浓度和种类的标准微生物悬液（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）进行接种培养。

2.**结果判断**：

阳性对照应能在规定时间内（如24-48小时）形成典型、可见的菌落。若阳性对照未生长，表明培养基有问题、灭菌失败或操作过程存在污染，此次检验结果无效，需查找原因并重新检验。若阳性对照生长不良或菌落形态异常，也需排查原因。

3.**对照菌种**：

常用的阳性对照菌种包括：大肠杆菌（*Escherichiacoli*）、金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）、沙门氏菌（*Salmonella*）等，根据检验项目和法规要求选择。

（二）阴性对照

1.**目的与操作**：

阴性对照用于检测是否存在操作过程中的交叉污染或环境背景微生物污染。通常包括：

(1)**培养基空白对照**：使用未接种任何样品或菌悬液的培养基进行灭菌、倾注、培养，观察是否有菌落生长。

(2)**试剂空白对照**：如使用染液等，需检测试剂本身是否污染。

2.**结果判断**：

所有阴性对照（培养基、试剂等）均不应有任何菌落生长。若出现菌落，表明存在污染，需立即停止当前操作，彻底清洁消毒工作区域、工具，更换无菌物品，并分析污染源，重新进行检验。

（三）精密度控制

1.**重复实验**：

对于同一样品，尤其是在进行计数时，为减少误差，应进行重复检测。通常每个样品或稀释液平行操作至少2-3次。

2.**结果计算**：

计算每次平行实验的数值差异，如标准差（SD）或变异系数（CV=(SD/平均值)×100%）。

3.**允许范围**：

根据实验室经验和相关标准，设定可接受的CV范围。例如，对于平板计数，CV通常应低于5%或10%，具体取决于检验要求。若CV超出允许范围，需检查操作步骤、样品均质性、培养基制备、读数判读等环节是否存在问题，并重新检测。

**五、注意事项**

1.**个人防护**：

-佩戴洁净工作服、口罩、帽子。

-根据操作风险等级，佩戴一次性手套。处理潜在污染样品或进行高风险操作时，应佩戴防护眼镜或面屏。

-避免直接接触眼睛、口腔和皮肤。操作结束后彻底洗手消毒。

2.**设备消毒**：

-工作台面在每次使用前后使用70-75%乙醇溶液或合适的消毒剂擦拭消毒。

-培养箱、超净工作台等设备定期清洁、消毒，并检查运行状态。

-所有接触样品的无菌工具（镊子、接种环等）使用后必须灭菌（如高压蒸汽灭菌或火焰燃烧）。

3.**数据记录**：

-所有操作步骤、参数（温度、时间、稀释倍数等）、观察到的现象（菌落形态、颜色等）、计算结果、最终结论必须详细、准确、实时地记录在实验记录本或电子系统中。

-记录应清晰可辨，避免涂改，如有错误需划线签名更正。

-数据记录是结果追溯和验证的重要依据。

4.**样品保存**：

-未使用完的培养基、试剂应按规范储存，避免污染和变质。

-检验过程中产生的废弃物（如菌液、培养基培养物）需按生物安全规定进行灭活处理（如高压蒸汽灭菌）后才能丢弃。

**六、应急处理**

（一）污染发现

1.**立即隔离**：一旦发现样品、培养基或操作过程中有污染迹象（如阴性对照生长、培养基上出现非预期菌落），应立即将该批次样品或相关操作区域隔离，避免污染其它样品或区域。

2.**停止操作**：暂停当前检验工作。

3.**评估与处理**：

-确定污染范围：是单一样品污染、单个操作环节问题还是系统性问题？

-**消毒措施**：对污染区域进行彻底消毒，包括工作台面、地面、被污染的工具等。必要时更换所有一次性耗材。

-**废弃物处理**：被污染的培养基、样品、工具等视为高风险废弃物，需进行灭活处理并按规定封装、处置。

-**重新检验**：根据污染原因分析，决定是废弃当前所有结果，还是对剩余样品或重新采集的样品进行检验。

4.**记录与报告**：详细记录污染事件的发生、处理过程、原因分析及后续措施，并向相关负责人汇报。

（二）样品变质

1.**识别变质迹象**：在处理或观察样品时，如发现样品出现异味、颜色异常、质地改变、出现霉斑或沉淀等变质现象，应立即停止使用。

2.**原因分析**：分析样品变质的原因，如储存不当、运输时间过长、操作不当等。

3.**处理措施**：

-**不可使用**：变质样品不能再用于检验，应作为废弃物处理。

-**报告**：记录样品变质情况，并向相关负责人报告。如果变质可能影响检验结果，需报告并可能需要重新采样。

-**改进措施**：分析变质原因，改进样品的采集、运输、保存或处理流程，防止再次发生。

4.**安全注意**：处理变质样品时，应格外注意可能伴随的微生物风险，采取更严格的个人防护措施。

一、概述

微生物检验是食品、药品、环境等领域质量监控的重要环节。本方案旨在规范现场微生物检验的操作流程，确保检验结果的准确性和可靠性。方案涵盖样品采集、运输、处理、培养及结果判读等关键步骤，适用于实验室外的现场快速检测。

二、样品采集与处理

（一）样品采集

1.选择代表性样品：根据检验目的，从批次的上下、中心及边缘位置采集样品，确保样品均匀。

2.使用无菌工具：采样工具（如无菌棉签、取样勺）需提前灭菌，避免污染。

3.样品量：液体样品取10-50mL，固体样品取10-20g，确保足量检测。

4.标记与记录：样品需标注来源、采集时间等信息，并立即记录。

（二）样品运输

1.低温保存：使用冷藏箱（2-8℃）运输，避免样品变质。

2.防止泄漏：液体样品用密封袋包装，固体样品用无菌袋装。

3.时间控制：运输时间不超过4小时，确保样品活性。

（三）样品处理

1.液体样品：摇匀后取适量稀释，如1:10、1:100梯度稀释。

2.固体样品：采用均质法，如研磨或捣碎后加入无菌生理盐水。

3.无菌操作：处理过程需在超净工作台进行，避免二次污染。

三、微生物培养与检测

（一）培养基准备

1.挑选适宜培养基：如营养琼脂（NA）、麦康凯琼脂（MAC）等。

2.灭菌处理：高压蒸汽灭菌（121℃，15min），确保无菌。

3.冷却后倾注：培养基冷却至45-50℃时倾注培养皿。

（二）接种与培养

1.接种方法：

(1)平板划线法：用于分离纯培养。

(2)显微镜直接涂片：观察形态。

2.培养条件：

(1)温度：35-37℃。

(2)湿度：95%以上。

(3)时间：24-48小时。

（三）结果判读

1.计数方法：

(1)平板计数法：计算CFU/mL或CFU/g。

(2)显微镜计数法：使用血细胞计数板。

2.鉴定依据：

(1)形态观察：菌落形状、颜色、大小。

(2)生化实验：如氧化酶、糖发酵等。

四、质量控制

（一）阳性对照

1.每批次检验加入已知菌悬液，验证培养基及操作有效性。

2.对照菌种：如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌。

（二）阴性对照

1.空白培养基，检测是否存在污染。

2.如出现菌落，则样品或操作过程需重新检测。

（三）精密度控制

1.重复实验：同一样品平行检测3次，计算变异系数（CV）。

2.允许范围：CV≤5%，视为准确。

五、注意事项

1.个人防护：佩戴手套、口罩，必要时穿防护服。

2.设备消毒：使用75%酒精或消毒液定期清洁工作台。

3.数据记录：详细记录每一步操作及结果，避免遗漏。

六、应急处理

（一）污染发现

1.立即停止操作，隔离污染样品。

2.更换培养基及工具，重新检测。

（二）样品变质

1.检查运输及保存条件是否合规。

2.如无法恢复活性，需报告并废弃样品。

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**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.**选择代表性样品**：

为确保检验结果能反映整体状况，样品的代表性至关重要。应避免随意取样，需按照特定方法从目标批次的多个位置采集。例如，对于散装固体样品（如粮食、粉末），应采用五点取样法：取批次四个角各一份样品，再加取中心一份样品。混合均匀后，按比例取出所需检验样品。对于包装好的产品（如袋装食品、瓶装液体），应从不同批次、不同时间生产的产品中随机抽取，每个批次至少抽取3个样品。取样时，注意避免破坏包装完整性，尤其对于无菌样品。

2.**使用无菌工具**：

所有接触样品的工具必须是无菌的，以防止外来微生物污染。常用工具包括：

(1)无菌取样勺/铲：用于固体样品，需使用前用酒精灯火焰烧灼勺柄或使用一次性无菌取样勺。

(2)无菌棉签：用于表面采样或少量液体取样，需从无菌包装中取出，旋紧尾部盖，避免棉签头接触包装外表面。

(3)无菌注射器/移液管：用于液体样品定量取样，需确保针头和管身无菌。

工具在使用前，应通过高压蒸汽灭菌（121℃，15-20分钟）或使用有效的化学消毒剂（如70-75%乙醇溶液）进行灭菌。

3.**样品量**：

样品量的大小直接影响检验结果的准确性和统计意义。一般建议：

(1)液体样品：取10mL至50mL，具体量根据样品预期浓度和检验方法要求确定。

(2)固体样品：取10g至20g，确保有足够的微生物负载。

(3)半固体/凝胶样品：取适量（如5g-10g）置于无菌容器中。

4.**标记与记录**：

每个样品必须进行清晰、持久的标记，并详细记录相关信息，以防混淆。标记内容应包括：

(1)样品编号：唯一标识符。

(2)样品类型：如原辅料、成品、环境表面等。

(3)来源信息：生产批号、生产线、日期等。

(4)采集地点：具体位置。

(5)采集人及日期时间。

记录应存档，以便后续数据追溯。

（二）样品运输

1.**低温保存**：

微生物对温度敏感，尤其是一些致病菌或快速生长的微生物。运输过程中应保持样品处于低温环境，以抑制微生物生长，减缓其代谢活动。通常使用带冰袋或冷藏箱（温度设定在2℃至8℃之间）进行运输。对于要求更严格（如冷冻）的样品，应使用干冰或专用冷冻运输箱。运输时间应尽量缩短，原则上液体样品不超过4小时，固体样品不超过6-8小时，以减少微生物变化。

2.**防止泄漏**：

样品容器应密封良好，特别是液体和半流体样品，以防止运输途中泄漏、污染环境或导致样品成分改变。使用带塞子的瓶装样品，或对袋装样品进行二次包装（如放入密封袋或防漏箱中）。固体样品应使用不易破损的无菌袋或容器。

3.**时间控制**：

运输时间是影响样品状态和检验结果的重要因素。应严格遵守规定的运输时限，超过时限的样品可能需要重新采集或进行特殊处理说明。现场操作人员需记录样品从采集到开始检测的实际时间。

（三）样品处理

1.**液体样品**：

处理液体样品的目标通常是进行稀释，以使样品中的微生物浓度适合后续的平板计数或其它检测方法。稀释步骤通常如下：

(1)**初步稀释**：根据预估的微生物浓度，加入适当体积的无菌稀释液（如生理盐水、BufferedPeptoneWater）进行首次稀释。例如，取1mL样品加入9mL稀释液中，得到10倍稀释液。

(2)**系列稀释**：若初步稀释后的样品仍过浓，可继续进行梯度稀释。常用方法是将前一步稀释液再进行10倍稀释，如此反复，直至获得适宜浓度的稀释液（如平板上预计形成30-300个菌落）。记录每一步的稀释倍数。

(3)**混匀**：每次稀释后，必须充分混匀样品，确保稀释液与样品混合均匀。可用无菌吸管吹吸或轻轻摇动容器。

2.**固体样品**：

固体样品的微生物通常存在于表层或与液体结合的部分。常用处理方法有均质法、倾注法等：

(1)**均质法（用于均质样品）**：将适量固体样品（如肉、蔬菜）放入无菌均质袋或均质器中，加入适量无菌稀释液（通常为样品量的1-5倍），充分混合均匀，制成匀质悬液。

(2)**捣碎法（用于大块或不易均质的样品）**：取适量样品置于无菌研钵中，加入少量稀释液或无菌生理盐水，用无菌压碎棒或研杵充分捣碎，然后加入适量无菌稀释液定容。

(3)**倾注法（直接用于某些固体表面取样）**：用无菌棉签在样品表面多点取样，然后将棉签在含有无菌稀释液的试管中充分搅动，制成样品悬液。

3.**无菌操作**：

样品处理过程必须在严格的无菌环境下进行，以防止环境中的微生物污染样品。推荐在超净工作台或生物安全柜内操作。操作前需洗手消毒，穿戴洁净工作服、手套。所有使用的容器、工具、稀释液均需无菌。操作过程中避免说话、咳嗽等可能造成飞沫污染的行为。处理完毕后，清理操作区域，并正确处理使用过的废弃物。

**三、微生物培养与检测**

（一）培养基准备

1.**挑选适宜培养基**：

根据检验目标和待检微生物的特性，选择合适的培养基。常用类型包括：

(1)**通用营养培养基**：如营养琼脂（NutrientAgar,NA），用于通用微生物的总数计数或一般培养。

(2)**选择性培养基**：如麦康凯琼脂（MacConkeyAgar,MAC），用于选择性培养革兰氏阴性菌，并区分乳糖发酵菌。

(3)**鉴别培养基**：如TSI（三糖铁琼脂）、MR-VP琼脂，用于鉴定特定细菌的代谢特性。

(4)**特殊用途培养基**：根据具体需求选择，如含药培养基（用于药敏试验）、特殊营养添加剂的培养基（用于特定微生物）。

2.**灭菌处理**：

培养基必须彻底灭菌，以杀死所有杂菌。最常用的高压蒸汽灭菌法参数为：121℃、15psi（约103kPa）、维持15-20分钟。对于含特殊成分（如某些抗生素）或难溶性成分的培养基，可能需要调整灭菌条件或时间。灭菌前确保包装完好，防止培养基在灭菌过程中吸潮。

3.**冷却后倾注**：

灭菌后的培养基需冷却至适宜倾注的温度，通常为45℃-50℃。温度过高易导致菌落融合，过低则难以倾注均匀。可在水浴锅或培养箱中精确控制温度。倾注时，一手持培养基瓶，另一手持无菌培养皿，快速将培养基倒入皿中，每个皿约15-20mL，迅速盖上皿盖，水平静置冷却凝固。注意避免产生气泡。

（二）接种与培养

1.**接种方法**：

(1)**平板划线法（用于分离纯培养）**：

a.左手持皿，皿盖略微打开形成约30-45度角。

b.右手持接种环（火焰灭菌冷却后），蘸取少量菌悬液或挑取少量菌落。

c.在平板表面平行划三条直线（第一次划线），接种环冷却后重新火焰灭菌，然后转90度，划第二条线（第二次划线），再转90度划第三条线（第三次划线）。

d.每次划线后用火焰灭菌接种环，线条应相互隔离，最终形成分散的单个菌落。

(2)**倾注平板法（用于计数或某些特殊培养）**：

a.将融化的培养基（45-50℃）冷却至45℃左右。

b.左手持皿，皿盖打开约30度。

c.用无菌吸管吸取定量（如0.1mL）的菌悬液，加入皿中。

d.迅速倾倒培养基，立即旋转均匀混匀。

e.静置冷却凝固后倒置培养（防止冷凝水滴落污染菌落）。

(3)**显微镜直接涂片法（用于形态观察或快速检测）**：

a.制备菌悬液或挑取少量菌落。

b.在洁净载玻片上滴加少量生理盐水或固定液。

c.用接种环或刮刀挑取菌样，混入液体中，涂抹均匀成薄层。

d.待干燥后（必要时加温），固定（如火焰烧灼或甲醇固定），进行染色（如革兰染色）后在显微镜下观察。

2.**培养条件**：

培养是微生物生长繁殖的过程，需提供适宜的环境条件：

(1)**温度**：大多数细菌最适生长温度为35-37℃。嗜冷菌在20℃左右，嗜热菌需50℃以上。应根据待检微生物特性选择。培养时，将平板或试管置于恒温培养箱中。

(2)**湿度**：培养环境需保持高湿度（约95%），以防培养基失水，影响微生物生长。通常在培养箱内进行。

(3)**时间**：大多数细菌需24-48小时培养可见典型菌落。有些酵母菌、霉菌生长较慢，可能需48-72小时或更长时间。特定快速检测方法可能缩短至几小时。培养结束后需记录时间。

(4)**气体环境**：大多数需氧菌在空气（氧气充足）中培养。厌氧菌需在无氧环境（如厌氧罐、厌氧袋）中培养。兼性厌氧菌可在空气或微氧条件下生长。

（三）结果判读

1.**计数方法**：

(1)**平板计数法（MPN法或直接计数）**：

a.**直接计数（适用于典型菌落）**：在显微镜下，使用血细胞计数板计数特定区域内的菌落数，结合稀释倍数计算CFU/mL或CFU/g。

b.**菌落计数（最常用）**：观察平板上形成的单个菌落，计数。选择菌落数在30-300个的平板进行计算。计算公式：CFU/mL（或g）=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL或g）。

c.**最可能数法（MPN法，适用于水等液体样品）**：将样品进行系列稀释，接种到三管系列MPN培养管中，培养后计数阳性管数，查MPN表得到估计的微生物数（MPN值）。

(2)**显微镜计数法**：适用于悬液直接计数或平板菌落计数。使用血细胞计数板或专门微生物计数器，根据视野内菌体数量和稀释倍数计算浓度。

2.**鉴定依据**：

(1)**形态观察**：

a.**菌落形态**：形状（圆形、不规则等）、大小、边缘（整齐、波状、丝状等）、颜色（白、黄、绿、红等）、隆起程度（扁平、凸起、脐状等）、透明度（透明、半透明、不透明）。

b.**菌体形态**：通过革兰染色观察细菌是革兰氏阳性（紫色）还是革兰氏阴性（红色/粉色）。进一步观察细菌的形状（球菌、杆菌、螺旋菌等）、大小、排列方式（单个、对、链、簇等）。

(2)**生化实验**：

a.**糖发酵实验**：检测细菌对特定糖类的代谢能力（如乳糖、蔗糖、葡萄糖发酵产酸产气）。常用TSI、MR-VP实验组合判断。

b.**氧化酶实验**：检测细菌是否产生氧化酶，用于区分某些假单胞菌属等。

c.**其它生化反应**：如凝固酶试验（用于金黄色葡萄球菌鉴定）、卵磷脂酶试验等。

(3)**（可选）分子生物学方法**：如PCR、基因测序等，用于精确鉴定物种，尤其在形态和生化特征不典型时。

**四、质量控制**

（一）阳性对照

1.**目的与操作**：

阳性对照是为了验证培养基是否适宜、灭菌是否彻底、操作过程是否具备检出能力。每次检验都必须包含阳性对照。通常在相同的操作条件下，使用已知浓度和种类的标准微生物悬液（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）进行接种培养。

2.**结果判断**：

阳性对照应能在规定时间内（如24-48小时）形成典型、可见的菌落。若阳性对照未生长，表明培养基有问题、灭菌失败或操作过程存在污染，此次检验结果无效，需查找原因并重新检验。若阳性对照生长不良或菌落形态异常，也需排查原因。

3.**对照菌种**：

常用的阳性对照菌种包括：大肠杆菌（*Escherichiacoli*）、金黄色葡萄球菌（*Staphylococcusaureus*）、沙门氏菌（*Salmonella*）等，根据检验项目和法规要求选择。

（二）阴性对照

1.**目的与操作**：

阴性对照用于检测是否存在操作过程中的交叉污染或环境背景微生物污染。通常包括：

(1)**培养基空白对照**：使用未接种任何样品或菌悬液的培养基进行灭菌、倾注、培养，观察是否有菌落生长。

(2)**试剂空白对照**：如使用染液等，需检测试剂本身是否污染。

2.**结果判断**：

所有阴性对照（培养基、试剂等）均不应有任何菌落生长。