微生物检验规范操作指导

微生物检验规范操作指导一、总则

微生物检验是确保产品质量、食品安全和环境安全的重要手段。本规范旨在指导微生物检验的操作流程，确保检验结果的准确性和可靠性。检验过程需严格遵守无菌操作原则，避免污染，并按照标准化的步骤进行。

二、检验前的准备

（一）设备和材料

1.超净工作台：确保工作环境无菌，使用前需进行紫外灯照射消毒30分钟，并开启通风30分钟。

2.高压灭菌锅：用于灭菌培养基和器械，灭菌温度121℃，压力1.05kg/cm²，时间15-20分钟。

3.显微镜：配备不同放大倍数的物镜，用于观察微生物形态。

4.培养基：常用培养基包括营养琼脂培养基、麦康凯培养基等，需按说明书配置并灭菌。

5.无菌器械：包括接种环、试管、培养皿等，需用75%酒精浸泡消毒后高压灭菌。

（二）样品处理

1.样品采集：使用无菌工具采集样品，避免接触其他表面。

2.样品稀释：将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，常用稀释梯度为10⁻¹、10⁻²、10⁻³等。

3.接种：根据检验目的选择合适的接种方法，如倾注法、涂布法等。

三、检验操作步骤

（一）平板计数法（MPN法）

1.稀释样品：取一定量样品加入无菌生理盐水中，进行系列稀释。

2.接种平板：取适量稀释液加入无菌培养皿中，倒入熔化的营养琼脂培养基，混匀后静置凝固。

3.计数：培养48小时后，选择菌落数在30-300的平板进行计数，计算每克样品的菌落形成单位（CFU/g）。

（二）倾注平板法

1.配置培养基：将营养琼脂培养基加热至熔化状态，冷却至45-50℃。

2.接种样品：取一定量样品加入无菌培养皿中，倒入冷却后的培养基，混匀后静置凝固。

3.培养与计数：培养48小时后，计数菌落数，计算CFU/g。

（三）显微镜观察法

1.制片：取少量样品涂布在洁净载玻片上，待干燥后进行染色（如革兰染色）。

2.镜检：使用显微镜观察微生物形态，记录菌体大小、颜色等特征。

四、检验结果分析

（一）菌落特征

1.形态：圆形、边缘整齐或不整齐，颜色可为白色、黄色等。

2.大小：一般直径0.5-1.5mm。

3.菌落类型：如光滑型、粗糙型、黏液型等。

（二）显微镜观察结果

1.革兰染色：阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

2.菌体形态：如球菌、杆菌、螺旋菌等。

五、注意事项

（一）无菌操作

1.手部消毒：操作前用75%酒精擦拭手部。

2.器械消毒：使用无菌镊子夹取器械，避免触碰非无菌区域。

（二）培养条件

1.温度：常用培养温度为35-37℃。

2.时间：细菌培养时间为24-48小时。

（三）结果记录

1.及时记录检验数据，避免混淆。

2.数据需经复核，确保准确性。

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**二、检验前的准备**

（一）设备和材料

1.**超净工作台：**

(1)**检查与预热：**每次使用前，必须检查工作台面的照明、风速和紫外灯功能是否正常。开启电源，开启通风系统预热至少30分钟，以去除工作区域内的尘埃粒子。

(2)**清洁消毒：**使用70-75%酒精对工作台面、前挡板、侧挡板及周围环境进行擦拭消毒，确保无可见污渍。关闭紫外灯至少30分钟后方可进入工作区。

(3)**操作规范：**操作时人员应穿着洁净工作服，佩戴口罩和手套。尽量减少工作台内的走动，避免产生过多气流扰动。物品传递应通过专用传递窗或无菌操作孔进行。

2.**高压灭菌锅：**

(1)**装锅与加水：**按照设备说明书加入适量的蒸馏水或去离子水至水槽中。将待灭菌物品（如培养基、器械包）合理放置在灭菌锅内筐，排列松散，留有空隙，避免蒸汽无法流通。

(2)**密封与排气：**关闭锅盖，确保密封圈清洁、完好。按照标准程序进行空气排除（排气阀通常先打开，待压力降至零后关闭）。

(3)**灭菌过程：**关闭排气阀，开始加热。达到预定灭菌温度（121℃）和压力（通常为1.05kg/cm²或103kPa）后，保持该状态15-20分钟（具体时间根据物品类型和装载量调整）。

(4)**冷却与开盖：**灭菌结束后，自然冷却或采用强制冷却（如打开排气阀，冷水喷淋锅盖外部），待压力完全降至零后，方可开盖取出物品。

3.**显微镜：**

(1)**清洁镜身与物镜：**使用后用纱布或软布擦拭镜身。不同放大倍数的物镜（如10x,40x,100x油镜）使用后需用专用擦镜纸蘸取少量乙醇或乙醚（油镜专用）清洁，避免灰尘和油污残留。

(2)**对光调焦：**使用前检查光源亮度，调整聚光器和光圈，转动物镜转换器，选择低倍镜，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋，使视野清晰。

(3)**存放：**使用完毕后，盖上物镜罩，将显微镜放置在干燥、无尘的环境中。

4.**培养基：**

(1)**配置：**严格按照说明书或标准操作规程（SOP）称量培养基粉末，加入定量的蒸馏水或去离子水，搅拌溶解。

(2)**检查与除菌：**溶解后检查有无不溶物或沉淀。必要时进行过滤除菌。

(3)**分装与灭菌：**将配置好的培养基分装至无菌容器（如试管、三角瓶）中，塞紧棉塞或使用螺旋盖。按高压灭菌锅操作规程进行灭菌。

(4)**质量检查：**灭菌后检查培养基有无霉变、变色或凝固不良现象。熔化时观察有无气泡或沉淀。

5.**无菌器械：**

(1)**分类包装：**接种环、接种针、试管口塞、移液管等器械需用无菌纸巾包裹或放入专用无菌袋/盒中。

(2)**灭菌：**与培养基一同进行高压灭菌，或根据器械类型选择合适的灭菌方法（如火焰灭菌）。

(3)**使用前检查：**灭菌后检查器械有无变形、生锈或损坏。火焰灭菌时需待冷却至适宜温度（如接种环冷却至红热退去）后方可接触样品或培养基。

（二）样品处理

1.**样品采集：**

(1)**工具准备：**使用无菌采样工具（如无菌剪刀、打孔器、拭子）。

(2)**环境清洁：**采样表面应先用无菌湿巾擦拭干净。

(3)**操作规范：**用采样工具避开明显的损伤部位，采集有代表性的样品（如固体样品取中心或多个点，液体样品取表层或混合样）。避免样品间交叉污染。采集量根据检验项目和样品类型确定（通常液体5-10mL，固体5-10g）。

(4)**标识与保存：**样品采集后立即贴上包含样品信息（名称、编号、采集日期、采集人）的无菌标签。根据样品性质选择合适的保存条件（如冷藏4℃），并尽快送往实验室检验。

2.**样品稀释：**

(1)**选择稀释液：**常用稀释液为无菌生理盐水（0.9%NaCl溶液），也可根据需要使用BufferedSalineWater(BSW)、BufferedPeptoneWater(BPW)等。

(2)**系列稀释：**将适量样品（如1g或1mL）加入装有适量稀释液的无菌容器中，充分振摇混匀。取该稀释液1mL（或适当体积）加入新的无菌容器中，加入稀释液至原定体积，混匀。重复此步骤，获得一系列梯度稀释液（如10⁻¹,10⁻²,10⁻³,10⁻⁴...）。

(3)**记录：**详细记录每一步稀释的体积和稀释倍数。

3.**接种：**

(1)**倾注平板法：**

(a)选择合适的无菌培养皿。

(b)取适量（通常9mL）已灭菌的熔化培养基（45-50℃）倒入培养皿中。

(c)挑取少量（通常0.1mL或10⁻²稀释液）待接种的样品液，滴加到培养基表面。

(d)迅速盖上皿盖，轻轻转动培养皿使样品与培养基混合均匀。

(e)静置冷却，待培养基凝固。

(2)**涂布平板法：**

(a)选择合适的无菌培养皿，加入适量已灭菌的冷却培养基（约45-50℃）。

(b)取无菌涂布棒，蘸取少量（如0.1mL）10⁻¹稀释液。

(c)在皿内培养基表面沿一个方向快速划线（如四区划线法），每次划线后用火焰烧灼涂布棒末端（若使用火焰灭菌涂布棒）。

(d)重复步骤(c)3-4次，每次使用新蘸取的稀释液或更换涂布棒，以分散样品。

(e)静置冷却，待培养基凝固。

(3)**倾注试管法：**

(a)加入适量（如9mL）已灭菌的熔化培养基到无菌试管中。

(b)加入少量（如0.1mL）待接种的样品液。

(c)轻轻混匀，待培养基凝固。

(4)**其他接种方法：**如直接划线接种、针接种等，根据具体检验要求选择并按无菌操作进行。

**三、检验操作步骤**

（一）平板计数法（MPN法）

1.**稀释液选择与梯度制备：**

(1)根据样品污染程度预估稀释倍数，通常从10⁻¹开始。

(2)制备至少三管系列稀释液，每管加入9mL无菌生理盐水。

(3)每管稀释液接种0.1mL（或按公式计算）到相应的平板培养基上。

2.**平板接种与培养：**

(1)按照二（二）3中描述的倾注平板法或涂布平板法接种样品稀释液。

(2)将接种好的平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入培养箱中，温度35-37℃，培养48小时。

3.**菌落计数与计算：**

(1)观察平板上形成的菌落。选择菌落数在30-300个之间的平板进行计数（若菌落数过少或过多，需调整稀释倍数重新检验）。

(2)记录每个平板的菌落数。

(3)计算每克（或每毫升）样品的菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）：

CFU/g(mL)=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL）

例如，10⁻³稀释液平板计数为50个菌落，接种量为0.1mL，则：

CFU/g=(50×10³)/0.1=5.0×10⁶CFU/g

4.**MPN（最可能数）计算（用于液体样品）：**

(1)选择三个连续稀释度（如10⁻¹,10⁻²,10⁻³）的样品管，分别接种到三个平板上，观察是否有菌落生长。

(2)记录每个稀释度接种平板上无菌落生长的管数（c）和有菌落生长的管数（t）。

(3)查MPN表（根据接种量0.1mL或1mL和培养时间48小时等条件选择相应表格），根据观察结果（如10⁻¹管有菌落，10⁻²管有菌落，10⁻³管无菌落）查找对应的MPN值。

(4)计算每100mL样品的MPN值。公式为：

MPN/100mL=(N₁×a+N₂×b+N₃×c)/(a+b+c)

其中，N₁,N₂,N₃分别为对应稀释度的MPN值，a,b,c为各稀释度有菌落生长的管数。

（二）倾注平板法

1.**培养基准备：**

(1)配置并灭菌营养琼脂或其他选择性培养基。

(2)灭菌后，将培养基冷却至45-50℃，避免产生气泡。

2.**样品接种：**

(1)取适量（如0.1mL）样品液，加入无菌培养皿中。

(2)迅速倒入冷却至45-50℃的培养基（总体积通常为10-15mL），边倒边轻轻转动培养皿，使样品均匀分布在培养基表面。

3.**凝固与培养：**

(1)静置培养皿，待培养基完全凝固（约15-30分钟）。

(2)倒置放入培养箱，35-37℃培养48小时。

4.**计数与结果：**

(1)观察菌落形态和数量。

(2)计算CFU/mL或CFU/g（如倾注10mL培养基，接种0.1mL样品，平板计数为100个菌落）：

CFU/mL=(100×10)/0.1=1.0×10⁵CFU/mL

(3)对于计数菌落总数，此方法比平板计数法（MPN法）更灵敏，尤其适用于低浓度样品。

（三）显微镜观察法

1.**样品制备：**

(1)**直接涂片法：**用无菌吸管吸取少量液体样品或挑取少量固体样品，涂抹在洁净载玻片中央。

(2)**悬液法：**将样品分散在无菌生理盐水中制成均匀悬液，取少许滴于载玻片上。

(3)**染色：**待样品干燥后，进行革兰染色（常用方法：初染、碘液媒染、脱色、复染）。或根据需要选择其他染色法（如美兰染色、抗酸染色）。

2.**镜检操作：**

(1)滴加1-2滴香柏油（油镜用）或普通盖玻片（高倍镜用）覆盖样品。

(2)将载玻片置于显微镜载物台上，使用低倍镜（10x）找到目标区域，然后转高倍镜（40x）。

(3)调节聚光器和光圈，使用细准焦螺旋使视野清晰。

3.**形态观察与记录：**

(1)观察菌体的基本形态（球状、杆状、螺旋状）、大小（可用目镜测微尺测量）、颜色（如革兰染色后的紫色或红色）。

(2)观察排列方式（单个、对生、链状、簇状等）。

(3)如需观察运动性，可制作活体染色观察（如鞭毛染色）。

(4)记录观察到的微生物形态特征，必要时拍照。

**四、检验结果分析**

（一）菌落特征

1.**形态：**

(1)大小：直径通常为0.5-2mm。过小可能为微菌落或计数错误，过大可能为卫星菌落（由卫星现象引起）。

(2)形状：圆形（最常见）、不规则形、椭圆形、链状等。

(3)边缘：整齐、波状、锯齿状、丝绒状等。

(4)表面：光滑、粗糙、黏液状、褶皱状等。

(5)颜色：白色、黄色、粉色、红色、蓝色、绿色等，单一或混合颜色。

(6)线毛状：菌落表面呈绒毛状，显微镜下可见丝状菌。

(7)湿润/干燥：菌落湿润时易挑起，干燥时易碎裂。

2.**生长特性：**

(1)嗜冷/嗜热：在较低（如25℃）或较高（如42℃）温度下生长良好。

(2)嗜酸/嗜碱：在pH偏酸性（如pH5.0）或偏碱性（如pH8.0）环境中生长良好。

(3)需氧/兼性厌氧/厌氧：在氧气充足、氧气存在或无氧条件下生长。

(4)非营养培养基上生长：在无蛋白胨等营养的培养基（如马铃薯葡萄糖琼脂）上能否生长。

3.**特殊现象：**

(1)产色素：产生水溶性色素（使培养基变色）或脂溶性色素（使菌落变色）。

(2)产生气体：在特定培养基（如葡萄糖蛋白胨水）中产气。

(3)产生吲哚：在含铁的蛋白胨水培养基中产生红色物质。

(4)发酵反应：在含糖的培养基（如麦康凯琼脂）上产生不同颜色的菌落（如红色、黄色）。

(5)卫星现象：某些细菌（如金黄色葡萄球菌）在肠杆菌科细菌菌落周围形成小菌落。

(6)溶血现象：在血琼脂平板上溶解红细胞，形成α溶血（绿色）、β溶血（透明）、γ溶血（无变化）。

（二）显微镜观察结果

1.**革兰染色：**

(1)阳性菌：细胞壁厚，肽聚糖含量高，经脱色后仍保留结晶紫-碘复合物，呈紫色。如：葡萄球菌属、链球菌属。

(2)阴性菌：细胞壁薄，肽聚糖含量低，易被脱色剂脱色，需用复染剂（如沙弗宁或碱性复红）复染，呈红色或粉色。如：大肠埃希菌、变形杆菌属。

2.**菌体形态与大小：**

(1)球菌：直径约0.5-1.0μm。

-单球菌：如金黄色葡萄球菌。

-双球菌：如肺炎链球菌。

-链球菌：如溶血性链球菌。

-葡萄球菌：成葡萄串状排列。

-杆菌：长度约1-5μm，宽度约0.5μm。

-鞭毛菌：一端或两端有鞭毛，运动活泼（需活体染色或特殊培养基观察）。

-螺旋菌：呈螺旋状，如螺旋杆菌属。

3.**内部结构（特殊染色）：**

(1)**鞭毛染色：**观察鞭毛的存在和位置。

(2)**芽孢染色：**观察芽孢的存在（通常位于菌体中央，较大，圆形）。

(3)**荚膜染色：**观察荚膜（包绕在菌体外层，较透明）。

4.**其他特征：**

(1)细胞排列：单个、对、链、簇、丛、栅栏状等。

(2)菌毛：比鞭毛短而多，显微镜下可见。

(3)突起：如假芽孢、芽孢囊。

**五、注意事项**

（一）无菌操作

1.**环境：**尽量在超净工作台或生物安全柜内进行所有无菌操作。

2.**手部：**操作前用肥皂流水洗手，再用70-75%酒精彻底消毒双手。

3.**衣物：**穿戴洁净工作服、口罩、帽子，必要时佩戴无菌手套。

4.**器械：**所有进入无菌区域的器械必须是无菌的。使用无菌镊子、无菌容器。

5.**动作：**避免在无菌区域上方咳嗽、打喷嚏。动作轻柔，减少空气扰动。

6.**污染处理：**操作中若发生污染，应立即停止，按规程处理污染物和受污染物品，并彻底清洁消毒操作区域。

（二）培养条件

1.**温度：**严格遵守标准培养温度（通常细菌35-37℃，霉菌25-28℃）。温度过高抑制生长，过低生长缓慢或无法生长。

2.**湿度：**培养箱内湿度应适宜，避免过于干燥导致培养基过快失水。

3.**时间：**培养时间需充足（通常细菌48小时，霉菌3-5天），但避免过长导致杂菌生长或老化现象干扰判断。

4.**气体：**按要求提供气体环境（需氧培养无需特殊处理，厌氧培养需隔绝空气，如使用厌氧罐或气体包）。

（三）结果记录与报告

1.**原始记录：**详细、准确、及时地记录所有操作步骤、观察到的现象、计算结果。使用标准术语。

2.**复核：**由另一个人复核原始记录和计算结果，确保无误。

3.**报告：**按照实验室报告格式，清晰呈现检验目的、样品信息、检验方法、结果、结论（或结果描述）。

4.**保存：**原始记录和检验物品（如菌落纯培养物）按规定保存一定时间，以备查证。

5.**废弃物处理：**所有培养基、培养物、废弃物必须经过高压灭菌或化学消毒后，按实验室规定进行无害化处理，严禁随意丢弃。

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一、总则

微生物检验是确保产品质量、食品安全和环境安全的重要手段。本规范旨在指导微生物检验的操作流程，确保检验结果的准确性和可靠性。检验过程需严格遵守无菌操作原则，避免污染，并按照标准化的步骤进行。

二、检验前的准备

（一）设备和材料

1.超净工作台：确保工作环境无菌，使用前需进行紫外灯照射消毒30分钟，并开启通风30分钟。

2.高压灭菌锅：用于灭菌培养基和器械，灭菌温度121℃，压力1.05kg/cm²，时间15-20分钟。

3.显微镜：配备不同放大倍数的物镜，用于观察微生物形态。

4.培养基：常用培养基包括营养琼脂培养基、麦康凯培养基等，需按说明书配置并灭菌。

5.无菌器械：包括接种环、试管、培养皿等，需用75%酒精浸泡消毒后高压灭菌。

（二）样品处理

1.样品采集：使用无菌工具采集样品，避免接触其他表面。

2.样品稀释：将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，常用稀释梯度为10⁻¹、10⁻²、10⁻³等。

3.接种：根据检验目的选择合适的接种方法，如倾注法、涂布法等。

三、检验操作步骤

（一）平板计数法（MPN法）

1.稀释样品：取一定量样品加入无菌生理盐水中，进行系列稀释。

2.接种平板：取适量稀释液加入无菌培养皿中，倒入熔化的营养琼脂培养基，混匀后静置凝固。

3.计数：培养48小时后，选择菌落数在30-300的平板进行计数，计算每克样品的菌落形成单位（CFU/g）。

（二）倾注平板法

1.配置培养基：将营养琼脂培养基加热至熔化状态，冷却至45-50℃。

2.接种样品：取一定量样品加入无菌培养皿中，倒入冷却后的培养基，混匀后静置凝固。

3.培养与计数：培养48小时后，计数菌落数，计算CFU/g。

（三）显微镜观察法

1.制片：取少量样品涂布在洁净载玻片上，待干燥后进行染色（如革兰染色）。

2.镜检：使用显微镜观察微生物形态，记录菌体大小、颜色等特征。

四、检验结果分析

（一）菌落特征

1.形态：圆形、边缘整齐或不整齐，颜色可为白色、黄色等。

2.大小：一般直径0.5-1.5mm。

3.菌落类型：如光滑型、粗糙型、黏液型等。

（二）显微镜观察结果

1.革兰染色：阳性菌呈紫色，阴性菌呈红色。

2.菌体形态：如球菌、杆菌、螺旋菌等。

五、注意事项

（一）无菌操作

1.手部消毒：操作前用75%酒精擦拭手部。

2.器械消毒：使用无菌镊子夹取器械，避免触碰非无菌区域。

（二）培养条件

1.温度：常用培养温度为35-37℃。

2.时间：细菌培养时间为24-48小时。

（三）结果记录

1.及时记录检验数据，避免混淆。

2.数据需经复核，确保准确性。

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**二、检验前的准备**

（一）设备和材料

1.**超净工作台：**

(1)**检查与预热：**每次使用前，必须检查工作台面的照明、风速和紫外灯功能是否正常。开启电源，开启通风系统预热至少30分钟，以去除工作区域内的尘埃粒子。

(2)**清洁消毒：**使用70-75%酒精对工作台面、前挡板、侧挡板及周围环境进行擦拭消毒，确保无可见污渍。关闭紫外灯至少30分钟后方可进入工作区。

(3)**操作规范：**操作时人员应穿着洁净工作服，佩戴口罩和手套。尽量减少工作台内的走动，避免产生过多气流扰动。物品传递应通过专用传递窗或无菌操作孔进行。

2.**高压灭菌锅：**

(1)**装锅与加水：**按照设备说明书加入适量的蒸馏水或去离子水至水槽中。将待灭菌物品（如培养基、器械包）合理放置在灭菌锅内筐，排列松散，留有空隙，避免蒸汽无法流通。

(2)**密封与排气：**关闭锅盖，确保密封圈清洁、完好。按照标准程序进行空气排除（排气阀通常先打开，待压力降至零后关闭）。

(3)**灭菌过程：**关闭排气阀，开始加热。达到预定灭菌温度（121℃）和压力（通常为1.05kg/cm²或103kPa）后，保持该状态15-20分钟（具体时间根据物品类型和装载量调整）。

(4)**冷却与开盖：**灭菌结束后，自然冷却或采用强制冷却（如打开排气阀，冷水喷淋锅盖外部），待压力完全降至零后，方可开盖取出物品。

3.**显微镜：**

(1)**清洁镜身与物镜：**使用后用纱布或软布擦拭镜身。不同放大倍数的物镜（如10x,40x,100x油镜）使用后需用专用擦镜纸蘸取少量乙醇或乙醚（油镜专用）清洁，避免灰尘和油污残留。

(2)**对光调焦：**使用前检查光源亮度，调整聚光器和光圈，转动物镜转换器，选择低倍镜，调节粗准焦螺旋和细准焦螺旋，使视野清晰。

(3)**存放：**使用完毕后，盖上物镜罩，将显微镜放置在干燥、无尘的环境中。

4.**培养基：**

(1)**配置：**严格按照说明书或标准操作规程（SOP）称量培养基粉末，加入定量的蒸馏水或去离子水，搅拌溶解。

(2)**检查与除菌：**溶解后检查有无不溶物或沉淀。必要时进行过滤除菌。

(3)**分装与灭菌：**将配置好的培养基分装至无菌容器（如试管、三角瓶）中，塞紧棉塞或使用螺旋盖。按高压灭菌锅操作规程进行灭菌。

(4)**质量检查：**灭菌后检查培养基有无霉变、变色或凝固不良现象。熔化时观察有无气泡或沉淀。

5.**无菌器械：**

(1)**分类包装：**接种环、接种针、试管口塞、移液管等器械需用无菌纸巾包裹或放入专用无菌袋/盒中。

(2)**灭菌：**与培养基一同进行高压灭菌，或根据器械类型选择合适的灭菌方法（如火焰灭菌）。

(3)**使用前检查：**灭菌后检查器械有无变形、生锈或损坏。火焰灭菌时需待冷却至适宜温度（如接种环冷却至红热退去）后方可接触样品或培养基。

（二）样品处理

1.**样品采集：**

(1)**工具准备：**使用无菌采样工具（如无菌剪刀、打孔器、拭子）。

(2)**环境清洁：**采样表面应先用无菌湿巾擦拭干净。

(3)**操作规范：**用采样工具避开明显的损伤部位，采集有代表性的样品（如固体样品取中心或多个点，液体样品取表层或混合样）。避免样品间交叉污染。采集量根据检验项目和样品类型确定（通常液体5-10mL，固体5-10g）。

(4)**标识与保存：**样品采集后立即贴上包含样品信息（名称、编号、采集日期、采集人）的无菌标签。根据样品性质选择合适的保存条件（如冷藏4℃），并尽快送往实验室检验。

2.**样品稀释：**

(1)**选择稀释液：**常用稀释液为无菌生理盐水（0.9%NaCl溶液），也可根据需要使用BufferedSalineWater(BSW)、BufferedPeptoneWater(BPW)等。

(2)**系列稀释：**将适量样品（如1g或1mL）加入装有适量稀释液的无菌容器中，充分振摇混匀。取该稀释液1mL（或适当体积）加入新的无菌容器中，加入稀释液至原定体积，混匀。重复此步骤，获得一系列梯度稀释液（如10⁻¹,10⁻²,10⁻³,10⁻⁴...）。

(3)**记录：**详细记录每一步稀释的体积和稀释倍数。

3.**接种：**

(1)**倾注平板法：**

(a)选择合适的无菌培养皿。

(b)取适量（通常9mL）已灭菌的熔化培养基（45-50℃）倒入培养皿中。

(c)挑取少量（通常0.1mL或10⁻²稀释液）待接种的样品液，滴加到培养基表面。

(d)迅速盖上皿盖，轻轻转动培养皿使样品与培养基混合均匀。

(e)静置冷却，待培养基凝固。

(2)**涂布平板法：**

(a)选择合适的无菌培养皿，加入适量已灭菌的冷却培养基（约45-50℃）。

(b)取无菌涂布棒，蘸取少量（如0.1mL）10⁻¹稀释液。

(c)在皿内培养基表面沿一个方向快速划线（如四区划线法），每次划线后用火焰烧灼涂布棒末端（若使用火焰灭菌涂布棒）。

(d)重复步骤(c)3-4次，每次使用新蘸取的稀释液或更换涂布棒，以分散样品。

(e)静置冷却，待培养基凝固。

(3)**倾注试管法：**

(a)加入适量（如9mL）已灭菌的熔化培养基到无菌试管中。

(b)加入少量（如0.1mL）待接种的样品液。

(c)轻轻混匀，待培养基凝固。

(4)**其他接种方法：**如直接划线接种、针接种等，根据具体检验要求选择并按无菌操作进行。

**三、检验操作步骤**

（一）平板计数法（MPN法）

1.**稀释液选择与梯度制备：**

(1)根据样品污染程度预估稀释倍数，通常从10⁻¹开始。

(2)制备至少三管系列稀释液，每管加入9mL无菌生理盐水。

(3)每管稀释液接种0.1mL（或按公式计算）到相应的平板培养基上。

2.**平板接种与培养：**

(1)按照二（二）3中描述的倾注平板法或涂布平板法接种样品稀释液。

(2)将接种好的平板倒置（防止冷凝水滴落污染菌落），放入培养箱中，温度35-37℃，培养48小时。

3.**菌落计数与计算：**

(1)观察平板上形成的菌落。选择菌落数在30-300个之间的平板进行计数（若菌落数过少或过多，需调整稀释倍数重新检验）。

(2)记录每个平板的菌落数。

(3)计算每克（或每毫升）样品的菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）：

CFU/g(mL)=(平板菌落数×稀释倍数)/接种量（mL）

例如，10⁻³稀释液平板计数为50个菌落，接种量为0.1mL，则：

CFU/g=(50×10³)/0.1=5.0×10⁶CFU/g

4.**MPN（最可能数）计算（用于液体样品）：**

(1)选择三个连续稀释度（如10⁻¹,10⁻²,10⁻³）的样品管，分别接种到三个平板上，观察是否有菌落生长。

(2)记录每个稀释度接种平板上无菌落生长的管数（c）和有菌落生长的管数（t）。

(3)查MPN表（根据接种量0.1mL或1mL和培养时间48小时等条件选择相应表格），根据观察结果（如10⁻¹管有菌落，10⁻²管有菌落，10⁻³管无菌落）查找对应的MPN值。

(4)计算每100mL样品的MPN值。公式为：

MPN/100mL=(N₁×a+N₂×b+N₃×c)/(a+b+c)

其中，N₁,N₂,N₃分别为对应稀释度的MPN值，a,b,c为各稀释度有菌落生长的管数。

（二）倾注平板法

1.**培养基准备：**

(1)配置并灭菌营养琼脂或其他选择性培养基。

(2)灭菌后，将培养基冷却至45-50℃，避免产生气泡。

2.**样品接种：**

(1)取适量（如0.1mL）样品液，加入无菌培养皿中。

(2)迅速倒入冷却至45-50℃的培养基（总体积通常为10-15mL），边倒边轻轻转动培养皿，使样品均匀分布在培养基表面。

3.**凝固与培养：**

(1)静置培养皿，待培养基完全凝固（约15-30分钟）。

(2)倒置放入培养箱，35-37℃培养48小时。

4.**计数与结果：**

(1)观察菌落形态和数量。

(2)计算CFU/mL或CFU/g（如倾注10mL培养基，接种0.1mL样品，平板计数为100个菌落）：

CFU/mL=(100×10)/0.1=1.0×10⁵CFU/mL

(3)对于计数菌落总数，此方法比平板计数法（MPN法）更灵敏，尤其适用于低浓度样品。

（三）显微镜观察法

1.**样品制备：**

(1)**直接涂片法：**用无菌吸管吸取少量液体样品或挑取少量固体样品，涂抹在洁净载玻片中央。

(2)**悬液法：**将样品分散在无菌生理盐水中制成均匀悬液，取少许滴于载玻片上。

(3)**染色：**待样品干燥后，进行革兰染色（常用方法：初染、碘液媒染、脱色、复染）。或根据需要选择其他染色法（如美兰染色、抗酸染色）。

2.**镜检操作：**

(1)滴加1-2滴香柏油（油镜用）或普通盖玻片（高倍镜用）覆盖样品。

(2)将载玻片置于显微镜载物台上，使用低倍镜（10x）找到目标区域，然后转高倍镜（40x）。

(3)调节聚光器和光圈，使用细准焦螺旋使视野清晰。

3.**形态观察与记录：**

(1)观察菌体的基本形态（球状、杆状、螺旋状）、大小（可用目镜测微尺测量）、颜色（如革兰染色后的紫色或红色）。

(2)观察排列方式（单个、对生、链状、簇状等）。

(3)如需观察运动性，可制作活体染色观察（如鞭毛染色）。

(4)记录观察到的微生物形态特征，必要时拍照。

**四、检验结果分析**

（一）菌落特征

1.**形态：**

(1)大小：直径通常为0.5-2mm。过小可能为微菌落或计数错误，过大可能为卫星菌落（由卫星现象引起）。

(2)形状：圆形（最常见）、不规则形、椭圆形、链状等。

(3)边缘：整齐、波状、锯齿状、丝绒状等。

(4)表面：光滑、粗糙、黏液状、褶皱状等。

(5)颜色：白色、黄色、粉色、红色、蓝色、绿色等，单一或混合颜色。

(6)线毛状：菌落表面呈绒毛状，显微镜下可见丝状菌。

(7)湿润/干燥：菌落湿润时易挑起，干燥时易碎裂。

2.**生长特性：**

(1)嗜冷/嗜热：在较低（如25℃）或较高（如42℃）温度下生长良好。

(2)嗜酸/嗜碱：在pH偏酸性（如pH5.0）或偏碱性（如pH8.0）环境中生长良好。

(3)需氧/兼性厌氧/厌氧：在氧气充足、氧气存在或无氧条件下生长。

(4)非营养培养基上生长：在无蛋白胨等营养的培养基（如马铃薯葡萄糖琼脂）上能否生长。

3.**特殊现象：**

(1)产色素：产生水溶性色素（使培养基变色）或脂溶性色素（使菌落变色）。

(2)产生气体：在特定培养基（如葡萄糖蛋白胨水）中产气。

(3)产生吲哚：在含铁的蛋白胨水培养基中