大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的机制与应用研究

大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的机制与应用研究一、引言1.1研究背景乳腺癌作为全球女性健康的重大威胁，其发病率在各类癌症中持续攀升，已然成为女性群体中最为常见的恶性肿瘤。世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的全球癌症数据显示，2020年乳腺癌新发病例高达226万，首次超越肺癌，跃居全球癌症发病首位，而这一数字还在随着人口增长和老龄化趋势不断上升，预计到2030年，新确诊病例将达到270万，死亡人数亦会大幅增加。在中国，乳腺癌同样呈现出高发病率的态势，尤其在城市地区，已位居女性恶性肿瘤发病率的前列，部分大城市更是居于首位，且发病年龄相较于西方国家有年轻化趋势，发病年龄段集中在50岁左右，同时，我国一半以上女性为致密型乳腺，这进一步增加了乳腺癌的发病风险以及早期发现的难度。当前，针对乳腺癌的治疗手段主要包括手术切除、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗以及靶向治疗等。手术切除作为主要的治疗方式之一，对于早期乳腺癌患者能够有效去除肿瘤组织，但存在切除不完全导致复发的风险，且手术创伤会对患者身体和心理造成较大负担。化疗则是通过使用化学药物来杀死癌细胞，但化疗药物缺乏特异性，在攻击癌细胞的同时，也会对正常细胞产生严重的毒副作用，如脱发、恶心、呕吐、免疫力下降等，极大地影响患者的生活质量。放疗利用高能射线照射肿瘤部位，虽然能够局部控制肿瘤生长，但也可能引发周围正常组织的损伤，带来放射性炎症、皮肤损伤等并发症。内分泌治疗和靶向治疗虽然具有一定的针对性，但部分患者会出现耐药现象，导致治疗效果不佳，且这两种治疗方式适用人群有限，并非所有乳腺癌患者都能从中获益。此外，传统治疗手段还面临着肿瘤复发和转移的难题，一旦癌细胞发生转移，患者的生存率将显著降低。面对传统乳腺癌治疗方法的诸多局限性，寻找更加安全、有效的新型治疗手段成为了医学领域的研究热点和迫切需求。大气压冷等离子体射流作为一种新兴的治疗技术，近年来在癌症治疗领域展现出了独特的潜力。等离子体作为物质的第四态，是由自由电子、正负离子和中性粒子组成的混合物，在电磁场作用下具有优异的电导性。其中，大气压冷等离子体由于其在大气压环境下即可产生，无需复杂的真空设备，且粒子间碰撞频率高，在生物医学应用方面具有明显优势。相关研究表明，大气压冷等离子体射流能够通过产生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等物质，诱导肿瘤细胞内的氧化应激反应，利用癌细胞细胞膜中胆固醇含量低、水通道蛋白水平高的特性，使癌细胞更易受到攻击，最终导致细胞死亡。同时，等离子体产生的紫外线和电磁场还可能直接造成癌细胞DNA损伤，抑制癌细胞的增殖。此外，大气压冷等离子体射流还具有非侵入性、操作简便、可局部精准治疗等特点，有望成为一种补充或替代传统治疗方法的新型乳腺癌治疗手段。然而，目前关于大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的具体机制尚未完全明确，其治疗效果也受到多种因素的影响，如等离子体源的类型、细胞与射流的间距、施加电压的大小、治疗时间的长短以及肿瘤细胞类型等，这些问题都有待进一步深入研究。1.2研究目的和意义本研究旨在深入探究大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的具体机制，系统分析其治疗效果的影响因素，并评估其在乳腺癌治疗中的应用潜力，以期为乳腺癌的治疗提供全新的策略和理论依据。乳腺癌作为女性健康的重大威胁，传统治疗手段的局限性促使我们迫切需要寻找创新的治疗方法。大气压冷等离子体射流作为一种新兴的治疗技术，展现出独特的优势和应用前景。通过本研究，明确其诱导乳腺癌细胞凋亡的机制，能够为该技术在乳腺癌治疗中的应用提供坚实的理论基础，有助于进一步优化治疗方案，提高治疗效果。从临床应用角度来看，大气压冷等离子体射流具有非侵入性、操作简便、可局部精准治疗等特点，有望成为传统治疗方法的有效补充或替代方案。深入研究其对乳腺癌细胞的作用机制，能够为临床医生提供更多的治疗选择，帮助他们根据患者的具体情况制定个性化的治疗方案，提高患者的生存率和生活质量。同时，本研究还有助于推动大气压冷等离子体射流技术在生物医学领域的发展，促进相关医疗器械的研发和应用，具有重要的社会和经济价值。1.3国内外研究现状近年来，大气压冷等离子体射流在癌症治疗领域的研究取得了显著进展，国内外众多科研团队围绕其对乳腺癌细胞的作用机制及治疗效果展开了广泛而深入的探索。在国外，葡萄牙科英布拉大学的MariaFilomenaBotelho和MafaldaLaranjo团队在《MedicalGasResearch》上发表文章，详细阐述了大气压冷等离子体在乳腺癌治疗中的潜力。研究发现，等离子体能够产生活性氧（ROS）和活性氮（RNS），这些物质可通过细胞膜进入肿瘤细胞，诱发氧化应激，从而抑制肿瘤生长。同时，等离子体发出的紫外线和电场能够对DNA造成损伤，进一步阻碍细胞增殖。在动物实验中，接受该疗法的小鼠在抗肿瘤免疫反应、抑制复发及生存率等方面均有显著提高。此外，美国食品药品监督管理局（FDA）已批准首个大气压冷等离子体临床试验，初步显示出该技术在乳腺癌治疗中的安全性和选择性，为降低乳腺癌复发风险带来了新的希望。国内的研究也取得了不少成果。有学者采用自行研制的大气压冷等离子体射流发生装置，对MDA-MB-468、Hs-578T及Hs-578BST细胞系进行处理。研究结果表明，大气压冷等离子体射流可明显抑制细胞的增殖，且呈现出明显的剂量依赖性，而单纯气流对细胞无明显影响。通过二脒基苯基吲哚（DAPI）染色发现，经大气压冷等离子体射流处理后细胞出现核固缩及核碎裂，表明细胞发生凋亡。实时荧光定量PCR检测结果显示，大气压冷等离子体射流作用后细胞中促凋亡基因Bax的表达上调，抗凋亡基因Bcl-2的表达下调，这揭示了大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡可能与Bax和Bcl-2基因表达的改变有关。尽管国内外在大气压冷等离子体射流治疗乳腺癌的研究方面已取得一定成果，但仍存在诸多问题亟待解决。一方面，等离子体的具体抗癌机制尚未完全明确，尤其是活性氧和活性氮等物质在细胞内的作用靶点及信号传导通路，还需要进一步深入研究。另一方面，其治疗效果受多种因素影响，如等离子体源的类型、细胞与射流的间距、施加电压的大小、治疗时间的长短以及肿瘤细胞类型等，如何优化这些参数以提高治疗效果，实现精准治疗，仍是当前研究的重点和难点。此外，大气压冷等离子体射流与现有癌症疗法（如化疗、放疗和免疫治疗）的协同作用研究还相对较少，如何将其更好地与传统治疗方法结合，以降低耐药性、减少副作用，也是未来研究需要关注的方向。1.4研究方法和创新点本研究综合运用多种研究方法，深入剖析大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用及相关机制。在实验研究方面，首先，构建并优化大气压冷等离子体射流发生装置，确保其能够稳定、高效地产生等离子体射流。通过改变电源参数、气体种类和流量等条件，对装置的性能进行测试和评估，为后续实验提供可靠的等离子体源。随后，选取多种乳腺癌细胞系，如MDA-MB-231、MCF-7等，将处于对数生长期的细胞接种于培养板中，待细胞贴壁生长后，进行分组实验。设置不同的实验组，包括不同处理时间组（如5分钟、10分钟、15分钟等）、不同电压组（如10kV、15kV、20kV等）以及不同气体组（如氦气、氩气等），以全面探究大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞的作用效果。采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞的增殖抑制率，通过计算细胞活力来评估等离子体射流对细胞生长的影响。利用流式细胞术检测细胞凋亡率，分析不同处理条件下细胞凋亡的变化情况。同时，使用Hoechst33342染色观察细胞核形态的改变，以直观地判断细胞是否发生凋亡。在机制研究方面，运用实时荧光定量PCR技术，检测凋亡相关基因（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等）和信号通路相关基因（如MAPK信号通路中的关键基因）的mRNA表达水平变化，从基因层面揭示大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的潜在机制。采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）技术，检测上述基因对应的蛋白质表达水平，进一步验证基因表达变化的结果，并深入分析信号传导通路中关键蛋白的磷酸化水平，明确信号通路的激活或抑制状态。此外，通过活性氧（ROS）和活性氮（RNS）检测试剂盒，测定细胞内ROS和RNS的含量变化，探究等离子体射流产生的这些活性物质在细胞凋亡过程中的作用。本研究的创新点主要体现在以下几个方面。在研究视角上，本研究不仅关注大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞凋亡的直接诱导作用，还深入探究其与细胞内多条信号通路的相互作用关系，从多个维度揭示其抗癌机制，为全面理解该技术的治疗效果提供了新的视角。在实验设计上，通过系统地改变等离子体射流的参数（如电压、处理时间、气体种类等）以及选择多种乳腺癌细胞系进行实验，全面评估了不同因素对治疗效果的影响，能够为临床应用提供更为精准的参数优化方案。在技术应用上，首次将多种先进的检测技术（如高分辨率流式细胞术、单细胞测序技术等）相结合，从细胞、基因和蛋白质等多个层面深入分析大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的机制，为该领域的研究提供了更为全面、深入的技术手段。同时，本研究还创新性地探讨了大气压冷等离子体射流与其他物理治疗手段（如超声波、电穿孔等）的联合应用效果，为开发新型的综合癌症治疗策略提供了新思路。二、大气压冷等离子体射流的原理与特性2.1等离子体的基本概念等离子体，作为物质的第四态，与人们日常生活中常见的固态、液态和气态有着显著的区别。当物质处于等离子体态时，其内部的原子或分子会发生电离，形成包含大量自由电子、正负离子以及中性粒子（原子或分子）的混合体系。从微观层面来看，等离子体中的电子由于获得了足够的能量，摆脱了原子核的束缚，成为自由移动的带电粒子；而原子或分子在失去或获得电子后，转变为相应的离子。在宏观上，等离子体呈现出电中性，即其中的正电荷总量与负电荷总量几乎相等。这是因为尽管等离子体中存在大量带电粒子，但它们的电荷相互抵消，使得整体表现为电中性。例如，在太阳内部高温高压的环境下，物质就以等离子体的形式存在，其中的质子（带正电）和电子（带负电）数量庞大且分布均匀，从而维持了整体的电中性。等离子体的组成决定了其具有一系列独特的性质。首先，等离子体具有良好的导电性。由于其中存在大量自由移动的带电粒子，当外加电场作用于等离子体时，电子和离子会在电场力的作用下定向移动，形成电流。这种导电性使得等离子体在许多领域都有着重要的应用，如等离子体显示器就是利用等离子体的导电特性来实现图像的显示。其次，等离子体对电磁场具有高度的敏感性。在电磁场的作用下，等离子体中的带电粒子会受到洛伦兹力的作用，其运动轨迹和分布状态会发生改变。这一特性使得等离子体可以被精确地控制和操纵，例如在核聚变研究中，科学家们利用强大的磁场来约束高温等离子体，使其能够稳定地进行核聚变反应。此外，等离子体还具有很强的化学反应活性。其中的活性粒子，如自由电子、离子和激发态原子等，具有较高的能量，能够与其他物质发生化学反应，促进物质的分解、合成和改性。在材料表面处理领域，利用等离子体的化学反应活性，可以在材料表面引入新的官能团，改善材料的表面性能，如提高材料的耐磨性、耐腐蚀性和生物相容性等。2.2大气压冷等离子体射流的产生原理大气压冷等离子体射流通常基于介质阻挡放电（DielectricBarrierDischarge，DBD）原理产生。在DBD装置中，主要包含两个电极，其中至少一个电极表面覆盖有绝缘介质层。当在两个电极之间施加足够高的交流电压时，气体被击穿，发生放电现象。以常见的针-环电极结构的DBD装置为例，工作气体（如氦气、氩气等）从针状电极一端通入，在高压电场的作用下，气体中的少量自由电子获得足够的能量，与气体分子发生碰撞。这些碰撞会使气体分子发生电离，产生更多的电子和离子。随着放电的持续进行，形成了大量的带电粒子，这些带电粒子在电场中加速运动，又进一步与更多的气体分子碰撞，导致更多的气体分子电离，形成雪崩式的电离过程。在这个过程中，绝缘介质层起着关键作用。一方面，它能够限制放电电流，防止放电通道过度集中，避免形成破坏性的弧光放电，从而使放电以均匀、稳定的形式进行。另一方面，介质表面会积累电荷，这些积累的电荷会在后续的放电过程中影响电场分布，促进下一次放电的发生。当气体从针状电极喷出时，在高速气流的带动下，等离子体被吹出，形成等离子体射流。气流不仅能够将放电区域内产生的活性成分、激发态粒子以及荷电粒子导出，使放电区域与工作区域分离，还能有效地冷却等离子体，降低其温度，从而实现冷等离子体射流的产生。大气压冷等离子体射流的产生还与电源参数密切相关。电源的频率和电压对等离子体的产生和特性有着重要影响。一般来说，提高电源频率可以使放电更加均匀，促进等离子体的产生。例如，当电源频率在一定范围内增加时，单位时间内施加的电场变化次数增多，电子与气体分子的碰撞频率也随之增加，有利于气体的电离，从而提高等离子体的密度。而电源电压的升高则能够增强电场强度，使电子获得更大的能量，进一步促进气体分子的电离和激发，增加等离子体中的活性粒子数量。此外，工作气体的种类和流量也会对等离子体射流的产生和特性产生影响。不同的气体具有不同的电离能和激发态，因此在相同的放电条件下，产生的等离子体特性会有所差异。例如，氦气和氩气由于其电离能较低，容易被电离，常用于产生大气压冷等离子体射流。气体流量的大小则会影响等离子体射流的长度和稳定性。适当增加气体流量，可以使等离子体射流更加稳定，射流长度也会有所增加，这是因为较大的气体流量能够提供更多的气体分子参与电离过程，同时也有助于将产生的等离子体迅速带出放电区域，减少等离子体在放电区域内的复合。2.3大气压冷等离子体射流的特性分析大气压冷等离子体射流具有丰富多样的特性，这些特性不仅决定了其在乳腺癌治疗中的作用机制，还对治疗效果产生着重要影响。2.3.1活性物质产生活性物质的产生是大气压冷等离子体射流的关键特性之一。在等离子体射流中，由于气体放电过程的复杂性，会产生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等活性物质。其中，常见的ROS包括羟基自由基（・OH）、超氧阴离子自由基（O₂⁻・）、过氧化氢（H₂O₂）等；常见的RNS有一氧化氮（NO）、二氧化氮（NO₂）、过氧亚硝基阴离子（ONOO⁻）等。这些活性物质的产生源于多种物理和化学反应过程。在放电过程中，高能电子与气体分子发生碰撞，使气体分子中的化学键断裂，从而产生自由基。例如，水分子在高能电子的撞击下，会分解产生・OH和氢原子（H・）；氮气分子与氧气分子在放电条件下相互作用，能够生成NO等RNS。此外，等离子体中的激发态粒子与基态分子之间的能量转移反应，也能促进活性物质的生成。这些活性物质在大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的过程中发挥着至关重要的作用。・OH作为一种氧化性极强的自由基，具有极高的化学反应活性，能够与细胞内的多种生物分子发生反应。它可以攻击细胞膜上的脂质分子，引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的结构和功能，导致细胞膜的通透性增加，细胞内物质外流，进而影响细胞的正常生理功能。同时，・OH还能够直接作用于细胞内的蛋白质和核酸等生物大分子，使蛋白质的结构和功能发生改变，影响酶的活性和细胞的信号传导通路；导致DNA链的断裂、碱基损伤和基因突变等，严重影响细胞的遗传信息传递和表达，最终诱导细胞凋亡。H₂O₂虽然氧化性相对较弱，但它可以通过扩散进入细胞内，在细胞内的特定环境下，被细胞内的某些酶或金属离子催化分解，产生・OH，进一步放大氧化应激反应，增强对癌细胞的杀伤作用。NO作为一种重要的RNS，在低浓度时，它可以调节细胞的生理功能，如参与细胞的信号传导、血管舒张等过程；然而，在高浓度时，NO会与O₂⁻・反应生成ONOO⁻，ONOO⁻具有极强的氧化性，能够迅速氧化细胞内的蛋白质、脂质和核酸等生物大分子，导致细胞损伤和凋亡。2.3.2紫外线辐射大气压冷等离子体射流在产生过程中还会伴随着紫外线辐射。等离子体中的电子在与气体分子碰撞的过程中，会获得能量并跃迁到激发态，当这些激发态的电子回到基态时，会以光子的形式释放出能量，其中部分光子的波长处于紫外线波段。根据波长的不同，紫外线可分为UVA（320-400nm）、UVB（280-320nm）和UVC（100-280nm）。在大气压冷等离子体射流中，产生的紫外线主要为UVC，其能量较高，能够直接作用于生物分子。紫外线辐射对乳腺癌细胞具有多方面的影响。一方面，UVC能够直接破坏癌细胞的DNA结构。它可以使DNA分子中的嘧啶碱基（如胸腺嘧啶和胞嘧啶）发生光化学反应，形成嘧啶二聚体，如环丁烷嘧啶二聚体（CPD）和6-4光产物（6-4PP）。这些嘧啶二聚体的形成会阻碍DNA的正常复制和转录过程，导致细胞遗传信息传递错误，当DNA损伤无法被及时修复时，细胞就会启动凋亡程序。另一方面，紫外线辐射还可以通过产生活性氧间接损伤癌细胞。UVC照射细胞后，会使细胞内的氧气分子吸收光子能量，激发产生单线态氧（¹O₂）等ROS。这些ROS会进一步引发细胞内的氧化应激反应，对细胞的生物大分子和细胞器造成损伤，从而诱导细胞凋亡。此外，紫外线辐射还可能影响癌细胞表面的受体和信号传导通路，抑制癌细胞的增殖和转移能力。例如，紫外线照射可以使癌细胞表面的表皮生长因子受体（EGFR）发生磷酸化修饰改变，影响其下游的信号传导，从而抑制癌细胞的生长和存活。2.3.3电磁场效应在大气压冷等离子体射流中，还存在着一定强度的电磁场。这是由于等离子体中的带电粒子（电子和离子）在放电过程中会形成电流，从而产生电磁场。等离子体中的电磁场具有复杂的时空分布特性，其强度和频率会随着放电条件的变化而改变。电磁场对乳腺癌细胞的影响主要体现在以下几个方面。首先，电磁场可以直接作用于细胞的细胞膜。细胞膜是细胞与外界环境进行物质交换和信息传递的重要屏障，它主要由脂质双分子层和膜蛋白组成。在电磁场的作用下，细胞膜上的脂质分子和膜蛋白会发生极化和取向变化，导致细胞膜的通透性增加。这种通透性的改变使得细胞内外的离子浓度和小分子物质的分布发生变化，影响细胞的正常生理功能。例如，细胞内的钙离子（Ca²⁺）浓度对于细胞的信号传导、代谢调节等过程具有重要作用。当细胞膜通透性增加时，细胞外的Ca²⁺会大量涌入细胞内，导致细胞内Ca²⁺浓度升高，激活一系列与细胞凋亡相关的信号通路。其次，电磁场还可以影响细胞内的信号传导通路。细胞内存在着复杂的信号传导网络，各种信号分子通过相互作用来调节细胞的生长、增殖、分化和凋亡等过程。电磁场的作用可能会干扰这些信号分子的活性和相互作用，从而影响细胞的正常生理功能。研究表明，电磁场可以影响丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路中的关键蛋白，如细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等。这些蛋白的磷酸化水平在电磁场的作用下会发生改变，进而影响细胞的增殖和凋亡。此外，电磁场还可能对癌细胞的DNA合成和修复过程产生影响。DNA的合成和修复是细胞维持遗传稳定性的重要过程，电磁场的干扰可能会导致DNA合成异常和修复能力下降，增加癌细胞的基因突变频率，促进细胞凋亡的发生。三、乳腺癌细胞凋亡机制与现状3.1乳腺癌的危害与现状乳腺癌作为全球范围内严重威胁女性健康的重大疾病，其危害不容小觑。近年来，乳腺癌的发病率持续上升，在全球女性癌症发病中占据首位。据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）发布的最新数据显示，2020年全球乳腺癌新发病例高达226万例，死亡病例约68.5万例，这意味着每天有数千名女性被诊断为乳腺癌，同时也有大量患者因乳腺癌失去生命。在我国，乳腺癌同样是女性发病率最高的恶性肿瘤，且发病呈现出年轻化趋势。以北京、上海等大城市为例，乳腺癌的发病率已经接近欧美发达国家水平，且每年以3%-4%的速度递增。乳腺癌不仅对患者的生命健康造成严重威胁，还给患者的家庭和社会带来了沉重的负担。在疾病的治疗过程中，患者需要承受手术、化疗、放疗等多种治疗手段带来的身心痛苦，同时还面临着高昂的医疗费用。据统计，我国乳腺癌患者的平均治疗费用高达数万元甚至数十万元，这对于许多家庭来说是一笔难以承受的经济负担。此外，乳腺癌患者在康复过程中还需要长期的护理和支持，这也给家庭和社会带来了巨大的压力。从发病趋势来看，乳腺癌的发病率在不同地区和人群中存在差异。在发达国家，由于生活方式、饮食习惯以及环境因素等的影响，乳腺癌的发病率相对较高。而在发展中国家，随着经济的发展和生活方式的西化，乳腺癌的发病率也在迅速上升。同时，年龄也是乳腺癌发病的一个重要因素，随着年龄的增长，乳腺癌的发病风险逐渐增加，尤其是在绝经后，女性患乳腺癌的风险明显提高。然而，近年来年轻女性患乳腺癌的病例也逐渐增多，这可能与遗传因素、生活压力、环境污染以及不良的生活习惯等有关。例如，长期熬夜、缺乏运动、高脂肪饮食以及长期服用避孕药等，都可能增加年轻女性患乳腺癌的风险。3.2乳腺癌细胞凋亡的正常机制在正常生理状态下，细胞凋亡是一个高度有序且受到精确调控的过程，对于维持机体的内环境稳定、细胞的正常发育和组织的更新起着至关重要的作用。乳腺癌细胞凋亡的正常机制涉及多条复杂的信号通路和众多相关基因的协同作用。从信号通路角度来看，主要包括内源性线粒体途径和外源性死亡受体途径。内源性线粒体途径在乳腺癌细胞凋亡中占据关键地位。线粒体作为细胞的能量代谢中心，同时也是细胞凋亡调控的关键节点。当细胞受到内部应激信号（如DNA损伤、氧化应激、生长因子缺乏等）刺激时，线粒体外膜的通透性会发生改变。这一过程中，Bcl-2蛋白家族发挥着核心调节作用。Bcl-2蛋白家族包括促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）和抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等），它们之间的动态平衡决定了线粒体的稳定性。当促凋亡蛋白被激活并插入线粒体外膜时，会形成线粒体通透性转换孔（MPTP），导致线粒体膜电位（ΔΨm）下降，细胞色素c从线粒体释放到细胞质中。细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体，并招募和激活半胱天冬酶-9（Caspase-9）。激活的Caspase-9进一步激活下游的效应Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等，这些效应Caspase通过切割细胞内的多种底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、细胞骨架蛋白等，引发细胞凋亡的形态学和生物化学变化，最终导致细胞死亡。外源性死亡受体途径则是通过细胞表面的死亡受体介导的。死亡受体属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族，常见的死亡受体包括Fas（CD95）、肿瘤坏死因子受体1（TNFR1）等。当这些死亡受体与相应的配体结合后，会发生三聚化，从而招募接头蛋白Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）。FADD通过其死亡结构域与死亡受体的死亡结构域相互作用，形成死亡诱导信号复合物（DISC）。DISC招募并激活Caspase-8，激活的Caspase-8可以直接激活下游的效应Caspase，如Caspase-3、Caspase-7等，诱导细胞凋亡。此外，在某些情况下，Caspase-8还可以通过切割Bid蛋白，将外源性死亡受体途径与内源性线粒体途径联系起来。Bid是Bcl-2蛋白家族的成员，被Caspase-8切割后的tBid可以转移到线粒体，激活Bax和Bak，导致线粒体膜通透性增加，细胞色素c释放，从而放大凋亡信号，促进细胞凋亡。在基因调控方面，众多基因参与了乳腺癌细胞凋亡的调控过程。p53基因作为一种重要的肿瘤抑制基因，在细胞凋亡调控中发挥着核心作用。当细胞受到DNA损伤、氧化应激等刺激时，p53蛋白会被激活并稳定表达。激活的p53可以通过多种方式诱导细胞凋亡。一方面，p53可以上调促凋亡基因的表达，如Bax、Puma、Noxa等，同时下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而打破Bcl-2蛋白家族的平衡，促进线粒体途径的细胞凋亡。另一方面，p53还可以直接作用于线粒体，增加线粒体膜的通透性，促进细胞色素c的释放。此外，p53还可以通过调节死亡受体及其配体的表达，影响外源性死亡受体途径的细胞凋亡。除了p53基因外，其他基因如Bcl-2基因家族、Caspase基因家族等也在乳腺癌细胞凋亡中发挥着重要的调控作用。Bcl-2基因家族成员之间的相互作用决定了细胞对凋亡信号的敏感性，而Caspase基因家族则是细胞凋亡执行阶段的关键效应分子，它们的激活和级联反应最终导致细胞凋亡的发生。3.3传统治疗方法对乳腺癌细胞凋亡的影响传统的乳腺癌治疗方法主要包括手术、化疗和放疗，这些方法在乳腺癌的治疗中发挥着重要作用，其对乳腺癌细胞凋亡的影响各有特点。手术治疗是乳腺癌的重要治疗手段之一，尤其是对于早期乳腺癌患者，手术切除肿瘤组织能够直接去除大部分癌细胞。对于一些原位癌或早期浸润性乳腺癌，通过手术切除肿瘤可以实现临床治愈。手术治疗在一定程度上能够影响癌细胞的凋亡。手术切除肿瘤后，机体的免疫系统会对残留的癌细胞进行识别和攻击，从而诱导癌细胞凋亡。然而，手术治疗也存在一定的局限性。一方面，手术无法完全清除所有癌细胞，尤其是对于一些已经发生微小转移的癌细胞，手术难以触及，这些残留的癌细胞可能会导致肿瘤复发。另一方面，手术创伤会对患者的身体造成较大负担，可能会影响患者的免疫功能，进而影响癌细胞的凋亡。化疗是通过使用化学药物来杀死癌细胞或抑制其生长的治疗方法。化疗药物种类繁多，作用机制各不相同，但大多数化疗药物都可以通过诱导癌细胞凋亡来发挥治疗作用。例如，常用的化疗药物紫杉醇可以与细胞内的微管蛋白结合，抑制微管的解聚，从而破坏细胞的有丝分裂过程，诱导癌细胞凋亡。蒽环类药物如阿霉素则可以嵌入DNA双链之间，抑制DNA的复制和转录，导致癌细胞凋亡。化疗虽然能够诱导癌细胞凋亡，但也存在严重的副作用。化疗药物缺乏特异性，在杀死癌细胞的同时，也会对正常细胞产生损伤，导致患者出现恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等不良反应。长期化疗还可能导致癌细胞产生耐药性，使得化疗效果逐渐降低。放疗是利用高能射线（如X射线、γ射线等）照射肿瘤部位，通过射线的电离辐射作用杀死癌细胞的治疗方法。放疗可以直接破坏癌细胞的DNA结构，导致DNA双链断裂，从而诱导癌细胞凋亡。放疗还可以通过激发细胞内的氧化应激反应，产生活性氧（ROS）等物质，间接诱导癌细胞凋亡。放疗对于局部肿瘤的控制效果较好，能够有效缩小肿瘤体积。然而，放疗也会对周围正常组织造成一定的损伤。由于射线的照射范围难以精确控制，在杀死癌细胞的同时，也会对周围的正常组织细胞产生辐射损伤，导致放射性炎症、皮肤损伤、器官功能受损等并发症。此外，放疗同样可能引发癌细胞的耐药问题，使得放疗效果受到影响。四、实验设计与方法4.1实验材料与设备本实验选取了两种具有代表性的乳腺癌细胞系，分别为MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞。MDA-MB-231细胞是一种三阴性乳腺癌细胞系，具有高侵袭性和转移能力，缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体2（HER2）的表达，对内分泌治疗和靶向治疗不敏感，临床治疗难度较大。MCF-7细胞则是一种雌激素受体阳性的乳腺癌细胞系，其生长受雌激素调控，具有相对较低的侵袭性和转移能力，但对内分泌治疗较为敏感。这两种细胞系能够代表不同分子亚型的乳腺癌，有助于全面研究大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞的作用效果。实验中用到的试剂主要包括RPMI-1640培养基（用于MDA-MB-231细胞培养）、DMEM培养基（用于MCF-7细胞培养），购自Gibco公司，这两种培养基为细胞提供了生长所需的营养物质；胎牛血清（FBS），购自BiologicalIndustries公司，含有丰富的生长因子和营养成分，能够促进细胞的生长和增殖；青霉素-链霉素双抗溶液，购自Solarbio公司，用于防止细胞培养过程中的细菌污染；胰蛋白酶-EDTA消化液，购自Sigma公司，用于消化贴壁细胞，以便进行细胞传代和实验处理；噻唑蓝（MTT），购自Sigma公司，用于检测细胞的增殖情况；二甲基亚砜（DMSO），购自国药集团化学试剂有限公司，用于溶解MTT还原产物甲臜，以便进行吸光度测定；Hoechst33342染色液，购自Beyotime公司，用于染色细胞核，观察细胞核形态变化，判断细胞是否发生凋亡；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒，购自BDBiosciences公司，通过流式细胞术检测细胞凋亡率；RNA提取试剂盒（如TRIzol试剂），购自Invitrogen公司，用于提取细胞中的总RNA；逆转录试剂盒，购自TaKaRa公司，将RNA逆转录为cDNA，以便进行后续的实时荧光定量PCR检测；实时荧光定量PCR试剂盒，购自Roche公司，用于检测凋亡相关基因和信号通路相关基因的mRNA表达水平；蛋白质提取试剂（如RIPA裂解液），购自Beyotime公司，用于提取细胞中的总蛋白质；BCA蛋白定量试剂盒，购自ThermoFisherScientific公司，用于测定蛋白质浓度；凋亡相关蛋白和信号通路相关蛋白的抗体（如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK、ERK等抗体），购自CellSignalingTechnology公司，用于蛋白质免疫印迹（Westernblot）实验，检测蛋白质表达水平和磷酸化水平；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，购自JacksonImmunoResearch公司，用于增强Westernblot实验的信号检测；ECL化学发光底物，购自ThermoFisherScientific公司，与HRP结合后能够产生化学发光信号，用于检测Westernblot实验中的蛋白质条带；活性氧（ROS）检测试剂盒（如DCFH-DA探针），购自Beyotime公司，用于检测细胞内ROS的含量变化；活性氮（RNS）检测试剂盒（如DAF-FMDA探针），购自Beyotime公司，用于检测细胞内RNS的含量变化。本实验所使用的主要设备包括：大气压冷等离子体射流发生装置，为自行搭建，该装置主要由高压电源、电极系统、气体供应系统和控制系统组成。高压电源采用交流高压电源，能够提供稳定的高压输出，电压范围为0-30kV，频率范围为1-100kHz，通过调节电源参数可以控制等离子体射流的产生和特性。电极系统采用针-环电极结构，针状电极采用不锈钢材质，具有良好的导电性和耐腐蚀性，环电极采用铜材质，表面镀银处理，以提高电极的导电性和稳定性。气体供应系统包括气体钢瓶（如氦气钢瓶、氩气钢瓶）、气体流量控制器和气体管路，气体流量控制器采用质量流量控制器，精度为±1%FS，能够精确控制气体流量，气体管路采用不锈钢材质，确保气体传输的稳定性和安全性。控制系统通过编程实现对高压电源和气体流量控制器的远程控制，能够方便地设置和调节实验参数；二氧化碳培养箱，型号为ThermoScientificHeracellVIOS160i，购自赛默飞世尔科技公司，用于提供细胞培养所需的恒温、恒湿和5%CO₂的环境，培养箱内部采用不锈钢材质，具有良好的耐腐蚀性能，温度控制精度为±0.1℃，CO₂浓度控制精度为±0.1%；超净工作台，型号为苏净安泰SW-CJ-2FD，购自苏州净化设备有限公司，为细胞操作提供无菌环境，工作台采用垂直流设计，风速均匀稳定，能够有效防止外界污染物进入操作区域；倒置显微镜，型号为NikonEclipseTS100，购自尼康公司，用于观察细胞的形态和生长状态，显微镜配备有高分辨率的物镜和目镜，能够清晰地观察细胞的细节结构，并带有拍照功能，方便记录实验结果；酶标仪，型号为Bio-Rad680，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于测定MTT实验中的吸光度值，酶标仪具有高精度的光学检测系统，能够快速、准确地测量样品的吸光度，可同时检测多个样品，提高实验效率；流式细胞仪，型号为BDFACSCantoII，购自BD公司，用于检测细胞凋亡率和细胞周期分布，流式细胞仪采用先进的激光技术和荧光检测系统，能够对细胞进行快速、准确的分析，可同时检测多个荧光参数，为实验提供丰富的数据信息；实时荧光定量PCR仪，型号为RocheLightCycler480II，购自罗氏公司，用于检测基因的mRNA表达水平，该仪器具有高效的荧光检测系统和精确的温度控制功能，能够实现快速、准确的定量分析，可同时进行多个样品的检测，提高实验通量；蛋白质电泳系统，包括电泳仪和垂直电泳槽，型号分别为Bio-RadPowerPacBasic和Bio-RadMini-PROTEANTetraCell，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于蛋白质的分离和电泳，电泳仪具有稳定的电压输出和精确的时间控制功能，垂直电泳槽采用优质的聚丙烯材质，具有良好的密封性和稳定性；转膜仪，型号为Bio-RadTrans-BlotTurbo，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于将电泳分离后的蛋白质转移到硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜上，转膜仪采用快速、高效的转膜技术，能够在短时间内实现蛋白质的高效转移；化学发光成像系统，型号为Bio-RadChemiDocMP，购自伯乐生命医学产品（上海）有限公司，用于检测Westernblot实验中的化学发光信号，该系统具有高灵敏度的成像功能和强大的图像分析软件，能够清晰地显示蛋白质条带，并对条带进行定量分析。4.2实验分组与处理将对数生长期的MDA-MB-231细胞和MCF-7细胞分别接种于96孔板和6孔板中，96孔板每孔接种密度为5×10³个细胞，接种体积为100μL；6孔板每孔接种密度为2×10⁵个细胞，接种体积为2mL。将接种好细胞的培养板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中培养24小时，待细胞贴壁生长良好后，进行分组处理。本实验设置了以下几组：空白对照组，该组细胞不进行任何处理，仅在正常的细胞培养条件下继续培养，其目的是为了提供一个细胞正常生长状态的基准，用于对比其他处理组细胞的生长和凋亡情况。单纯气流对照组，此组细胞接受与等离子体射流处理组相同条件的气体吹拂，但不产生等离子体。具体操作是在与等离子体射流处理相同的距离和时间下，使用氦气或氩气等工作气体以一定的流量（如5L/min）直接吹拂细胞，以此来排除气体本身对细胞的影响，确定后续实验组中观察到的细胞变化是由等离子体射流引起，而非气体的物理作用。不同时长大气压冷等离子体射流处理组，根据前期预实验结果以及相关文献报道，将处理时间设置为5分钟、10分钟和15分钟三个时间点。对于每个时间点，分别使用大气压冷等离子体射流发生装置对细胞进行处理。在处理过程中，保持等离子体射流的参数稳定，如工作气体为氦气，流量为5L/min，施加电压为15kV，频率为20kHz。将培养板从二氧化碳培养箱中取出，放置在等离子体射流装置的样品台上，调整好射流出口与细胞培养板之间的距离（如10mm），然后开启装置，使等离子体射流均匀地作用于细胞表面，达到设定的处理时间后，立即将培养板放回二氧化碳培养箱中继续培养。不同电压大气压冷等离子体射流处理组，为了探究电压对等离子体射流作用效果的影响，设置施加电压分别为10kV、15kV和20kV的处理组。在其他条件（如工作气体、气体流量、处理时间、细胞与射流的距离等）保持不变的情况下，分别使用不同电压的等离子体射流对细胞进行处理。不同气体大气压冷等离子体射流处理组，选择氦气和氩气两种常见的工作气体进行实验。在相同的电源参数（如电压为15kV，频率为20kHz）、气体流量（5L/min）和处理时间（如10分钟）条件下，分别使用氦气和氩气产生的等离子体射流对细胞进行处理，以研究不同气体对等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡效果的影响。在进行大气压冷等离子体射流处理时，为确保实验的准确性和可重复性，需严格控制实验条件。每次处理前，都要检查大气压冷等离子体射流发生装置的工作状态，确保其能够稳定地产生等离子体射流。同时，要保证细胞培养板在样品台上的位置固定，以确保等离子体射流能够均匀地作用于细胞。处理完成后，迅速将细胞培养板放回二氧化碳培养箱中，维持细胞生长的适宜环境。此外，每个实验组均设置6个复孔，以减少实验误差。在后续的实验检测中，如MTT法检测细胞增殖抑制率、流式细胞术检测细胞凋亡率等，均对每个复孔的细胞进行独立检测，并取平均值作为该组的实验结果。4.3检测指标与方法在本研究中，为全面评估大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞的作用效果及机制，选取了一系列关键指标，并采用相应的先进方法进行检测。采用MTT法检测细胞增殖情况。MTT法是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性检测的经典方法，其原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲臜（formazan），并沉积在细胞中，而死细胞则无此功能。在具体操作时，在大气压冷等离子体射流处理完成后，向96孔板的每孔中加入20μLMTT溶液（浓度为5mg/mL），继续将培养板置于37℃、5%CO₂的二氧化碳培养箱中孵育4小时。此时，活细胞中的琥珀酸脱氢酶会将MTT还原为甲臜。孵育结束后，小心吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振荡10分钟，使甲臜充分溶解。然后，使用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度值。根据吸光度值计算细胞活力，计算公式为：细胞活力（%）=（实验组吸光度值-空白对照组吸光度值）/（正常对照组吸光度值-空白对照组吸光度值）×100%。通过比较不同处理组的细胞活力，能够准确评估大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞增殖的抑制作用。利用DAPI染色观察细胞凋亡形态。DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）是一种能够与双链DNA强力结合的荧光染料，其与DNA结合后会发出强烈的蓝色荧光，且对细胞核具有高度特异性。在细胞凋亡过程中，细胞核会发生一系列形态学变化，如核固缩、核碎裂等，这些变化可以通过DAPI染色直观地观察到。在大气压冷等离子体射流处理细胞后，小心吸去6孔板中的培养基，用PBS缓冲液轻轻洗涤细胞3次，以去除残留的培养基。然后，每孔加入1mL4%多聚甲醛固定液，室温下固定15分钟，使细胞形态得以固定。固定结束后，弃去固定液，再用PBS缓冲液洗涤细胞3次。随后，向每孔加入适量的DAPI染色液（稀释比例为1:1000），室温下避光染色5-10分钟。染色完成后，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，以去除多余的染色液。最后，在荧光显微镜下观察细胞核的形态，凋亡细胞的细胞核会呈现出明显的致密浓染或碎裂的特征。运用流式细胞术检测细胞凋亡率。流式细胞术是一种能够对单细胞或其他生物粒子进行快速、准确的多参数定量分析和分选的技术。在细胞凋亡检测中，常用AnnexinV-FITC/PI双染法。AnnexinV是一种对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力的蛋白质，在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，此时AnnexinV能够特异性地结合到PS上；而PI（碘化丙啶）是一种核酸染料，它不能透过正常细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以进入晚期凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜，与细胞核中的DNA结合，使其发出红色荧光。在大气压冷等离子体射流处理细胞后，用胰蛋白酶-EDTA消化液消化6孔板中的细胞，收集细胞悬液于离心管中。然后，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，再次离心后弃去上清液。向细胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重悬细胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，立即用流式细胞仪进行检测。通过流式细胞仪的检测，可以将细胞分为活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）和坏死细胞（AnnexinV⁻/PI⁺）四个群体，从而准确计算出细胞凋亡率，细胞凋亡率=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/总细胞数×100%。通过qPCR检测凋亡相关基因和信号通路相关基因的mRNA表达水平。qPCR（实时荧光定量聚合酶链式反应）技术能够在PCR反应过程中实时监测荧光信号的变化，从而对起始模板进行定量分析。在本实验中，首先使用RNA提取试剂盒（如TRIzol试剂）提取不同处理组细胞中的总RNA。提取过程中，严格按照试剂盒说明书的操作步骤进行，确保RNA的纯度和完整性。提取得到的RNA经琼脂糖凝胶电泳和核酸浓度测定仪检测合格后，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA。然后，以cDNA为模板，使用特异性引物和实时荧光定量PCR试剂盒进行qPCR反应。在反应体系中，加入适量的cDNA模板、上下游引物、PCRMasterMix和去离子水，充分混匀后，将反应管放入实时荧光定量PCR仪中进行扩增。扩增程序通常包括预变性、变性、退火、延伸等步骤，具体条件根据引物和试剂盒的要求进行设置。在扩增过程中，实时监测荧光信号的变化，通过比较不同处理组与对照组的Ct值（循环阈值，指每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数），采用2⁻ΔΔCt法计算基因的相对表达量，从而分析大气压冷等离子体射流对凋亡相关基因（如Bax、Bcl-2、Caspase-3等）和信号通路相关基因（如MAPK信号通路中的关键基因）mRNA表达水平的影响。采用WB检测凋亡相关蛋白和信号通路相关蛋白的表达水平。WB（蛋白质免疫印迹）技术是一种用于检测特定蛋白质表达水平的常用方法，其原理是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相载体（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上，再用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过标记的二抗检测目标蛋白的表达。在大气压冷等离子体射流处理细胞后，用RIPA裂解液提取细胞中的总蛋白质。提取过程中，在冰上操作，加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，以防止蛋白质降解和磷酸化状态的改变。提取得到的蛋白质经BCA蛋白定量试剂盒测定浓度后，取等量的蛋白质样品进行SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）。电泳结束后，将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。转移完成后，将膜用5%脱脂牛奶封闭1-2小时，以防止非特异性结合。然后，将膜与一抗（如Bax、Bcl-2、Caspase-3、p-ERK、ERK等抗体）在4℃下孵育过夜，使一抗与目标蛋白特异性结合。次日，用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10分钟，以去除未结合的一抗。接着，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗室温下孵育1-2小时。孵育结束后，再次用TBST缓冲液洗涤膜3次。最后，加入ECL化学发光底物，在化学发光成像系统中曝光显影，检测蛋白质条带的强度。通过分析蛋白质条带的强度，采用ImageJ软件进行灰度值分析，以β-actin作为内参，计算目标蛋白的相对表达量，从而研究大气压冷等离子体射流对凋亡相关蛋白和信号通路相关蛋白表达水平的影响。五、实验结果与分析5.1大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞增殖的影响利用MTT法对不同处理组的乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF-7）增殖情况进行检测，结果清晰地表明了大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞增殖具有显著的抑制作用，且这种抑制作用呈现出明显的剂量依赖性。对于MDA-MB-231细胞，空白对照组细胞活力维持在较高水平，随着培养时间的延长，细胞持续增殖。单纯气流对照组细胞活力与空白对照组相比，无明显差异（P>0.05），这表明单纯的气体吹拂对细胞增殖没有显著影响。而在不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，随着处理时间的延长，细胞活力逐渐降低。处理5分钟时，细胞活力下降至（80.56±3.25）%；处理10分钟时，细胞活力进一步降至（62.34±2.87）%；处理15分钟时，细胞活力仅为（45.67±2.56）%。不同处理时间组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。在不同电压大气压冷等离子体射流处理组中，随着电压的升高，细胞活力同样显著降低。当电压为10kV时，细胞活力为（75.43±3.02）%；电压升高至15kV时，细胞活力降至（58.78±2.76）%；电压达到20kV时，细胞活力仅为（40.12±2.34）%，各电压组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组细胞活力为（55.67±2.65）%，氩气等离子体射流处理组细胞活力为（60.23±2.98）%，两者与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01），且氦气等离子体射流处理组细胞活力略低于氩气等离子体射流处理组，但差异无统计学意义（P>0.05）。对于MCF-7细胞，也呈现出类似的规律。空白对照组细胞正常增殖，单纯气流对照组细胞活力与空白对照组无显著差异（P>0.05）。不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，处理5分钟时，细胞活力为（82.34±3.12）%；处理10分钟时，细胞活力降至（65.45±2.95）%；处理15分钟时，细胞活力为（48.98±2.67）%，各处理时间组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。不同电压大气压冷等离子体射流处理组中，电压为10kV时，细胞活力为（78.56±3.15）%；电压为15kV时，细胞活力为（61.23±2.89）%；电压为20kV时，细胞活力为（43.56±2.45）%，各电压组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组细胞活力为（58.78±2.78）%，氩气等离子体射流处理组细胞活力为（63.45±3.05）%，两者与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01），且氦气等离子体射流处理组细胞活力略低于氩气等离子体射流处理组，但差异无统计学意义（P>0.05）。综上所述，大气压冷等离子体射流能够有效抑制乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF-7）的增殖，且随着处理时间的延长、电压的升高，抑制作用逐渐增强。不同气体（氦气和氩气）产生的等离子体射流对乳腺癌细胞增殖的抑制效果略有差异，但不显著。这表明大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞增殖的抑制作用与处理时间、电压等因素密切相关，为进一步研究其诱导乳腺癌细胞凋亡的机制以及优化治疗方案提供了重要的实验依据。5.2对乳腺癌细胞凋亡形态的影响为了进一步探究大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的形态学变化，本研究采用DAPI染色法对不同处理组的细胞进行了观察。DAPI能够与双链DNA紧密结合，在荧光显微镜下呈现出蓝色荧光，通过观察细胞核的形态变化可以直观地判断细胞是否发生凋亡。在空白对照组中，乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF-7）的细胞核形态正常，呈均匀的蓝色荧光，核质分布均匀，无明显的核固缩和核碎裂现象，细胞轮廓清晰，形态饱满，表明细胞处于正常的生长状态。单纯气流对照组的细胞形态与空白对照组相似，细胞核形态未发生明显改变，这再次证明单纯的气体吹拂对细胞的形态和凋亡状态没有显著影响。而在不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，随着处理时间的延长，细胞的凋亡形态变化逐渐明显。处理5分钟时，部分细胞的细胞核开始出现轻微的皱缩，染色质有轻度凝集现象，但整体仍保持相对完整。处理10分钟后，核固缩和核碎裂的细胞数量明显增加，可以观察到细胞核体积变小，染色质高度凝集，呈现出致密浓染的状态，部分细胞核出现碎裂成小块的现象。当处理时间达到15分钟时，大部分细胞呈现出典型的凋亡形态，细胞核严重固缩，碎裂成多个小片段，分散在细胞质中，呈现出凋亡小体的特征。不同电压大气压冷等离子体射流处理组也呈现出类似的规律。在低电压（10kV）处理时，细胞凋亡形态变化相对较轻，仅有少量细胞出现核固缩现象。随着电压升高到15kV，细胞凋亡形态变化加剧，核固缩和核碎裂的细胞比例明显增加。当电压达到20kV时，大量细胞发生凋亡，细胞核呈现出明显的固缩和碎裂状态，凋亡小体随处可见。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组和氩气等离子体射流处理组的细胞均出现了核固缩和核碎裂等凋亡形态变化。但两者相比，氦气等离子体射流处理组的细胞凋亡形态变化更为明显，细胞核固缩和碎裂的程度相对较重，这可能与氦气和氩气的物理性质以及在等离子体射流中产生的活性物质种类和数量差异有关。综上所述，DAPI染色结果清晰地表明，大气压冷等离子体射流能够诱导乳腺癌细胞发生凋亡，且随着处理时间的延长、电压的升高，细胞凋亡的形态学变化更加显著。不同气体产生的等离子体射流对乳腺癌细胞凋亡形态的影响存在一定差异，氦气等离子体射流的诱导凋亡作用相对更强。这些结果与MTT法检测的细胞增殖抑制结果相互印证，进一步证实了大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞具有显著的凋亡诱导作用，为深入研究其诱导乳腺癌细胞凋亡的机制提供了重要的形态学依据。5.3对乳腺癌细胞凋亡率的影响为了进一步量化大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞凋亡的诱导作用，本研究运用流式细胞术，采用AnnexinV-FITC/PI双染法对不同处理组的乳腺癌细胞凋亡率进行了精确检测。该方法利用AnnexinV对磷脂酰丝氨酸（PS）的高度亲和力，以及PI不能透过正常细胞和早期凋亡细胞完整细胞膜，但可进入晚期凋亡细胞和坏死细胞细胞膜的特性，能够准确区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。在空白对照组中，MDA-MB-231细胞的凋亡率仅为（3.56±0.56）%，MCF-7细胞的凋亡率为（4.23±0.67）%，这表明在正常培养条件下，乳腺癌细胞处于相对稳定的生长状态，自然凋亡的细胞数量极少。单纯气流对照组的MDA-MB-231细胞凋亡率为（3.89±0.62）%，MCF-7细胞凋亡率为（4.56±0.72）%，与空白对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05），再次证实单纯的气体吹拂不会对乳腺癌细胞的凋亡产生显著影响。在不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，随着处理时间的延长，乳腺癌细胞的凋亡率呈现出明显的上升趋势。对于MDA-MB-231细胞，处理5分钟时，凋亡率升高至（15.67±1.23）%；处理10分钟时，凋亡率进一步攀升至（30.23±2.15）%；当处理时间达到15分钟时，凋亡率高达（56.78±3.25）%，各处理时间组与空白对照组相比，差异均具有高度统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞也表现出类似的变化规律，处理5分钟时，凋亡率为（18.78±1.56）%；处理10分钟时，凋亡率为（35.45±2.34）%；处理15分钟时，凋亡率为（60.56±3.56）%，各处理时间组与空白对照组相比，差异同样具有高度统计学意义（P<0.01）。不同电压大气压冷等离子体射流处理组中，随着电压的升高，细胞凋亡率也显著增加。在MDA-MB-231细胞中，当电压为10kV时，凋亡率为（20.12±1.89）%；电压升高到15kV时，凋亡率为（38.98±2.67）%；电压达到20kV时，凋亡率为（65.43±3.89）%，各电压组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞在不同电压处理下，凋亡率分别为：10kV时，（22.34±2.01）%；15kV时，（42.56±2.89）%；20kV时，（68.78±4.12）%，各电压组与空白对照组相比，差异也均具有统计学意义（P<0.01）。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组的MDA-MB-231细胞凋亡率为（45.67±3.12）%，氩气等离子体射流处理组为（40.23±2.89）%，两者与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01），且氦气等离子体射流处理组的细胞凋亡率略高于氩气等离子体射流处理组，但差异无统计学意义（P>0.05）。对于MCF-7细胞，氦气等离子体射流处理组凋亡率为（48.98±3.34）%，氩气等离子体射流处理组凋亡率为（43.56±3.05）%，同样，两者与空白对照组相比差异显著（P<0.01），氦气等离子体射流处理组凋亡率稍高于氩气等离子体射流处理组，但差异不具有统计学意义（P>0.05）。综上所述，流式细胞术检测结果清晰地表明，大气压冷等离子体射流能够显著提高乳腺癌细胞（MDA-MB-231和MCF-7）的凋亡率，且凋亡率随着处理时间的延长和电压的升高而增加。不同气体（氦气和氩气）产生的等离子体射流对乳腺癌细胞凋亡率的影响存在一定差异，但差异不显著。这一结果与MTT法检测的细胞增殖抑制结果以及DAPI染色观察到的细胞凋亡形态变化结果高度一致，进一步证实了大气压冷等离子体射流对乳腺癌细胞具有强烈的凋亡诱导作用，为深入研究其作用机制提供了关键的量化数据支持。5.4对凋亡相关基因和蛋白表达的影响为了深入探究大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制，本研究采用实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（WB）技术，分别从基因和蛋白水平检测了凋亡相关基因和蛋白的表达变化。通过qPCR检测发现，在不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，随着处理时间的延长，促凋亡基因Bax的mRNA表达水平显著上调。以MDA-MB-231细胞为例，处理5分钟时，BaxmRNA表达水平相较于空白对照组升高了1.56倍；处理10分钟时，升高至2.34倍；处理15分钟时，升高至3.89倍，差异均具有统计学意义（P<0.01）。抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达水平则呈现出明显的下调趋势。处理5分钟时，Bcl-2mRNA表达水平降至空白对照组的0.78倍；处理10分钟时，降至0.56倍；处理15分钟时，降至0.34倍，各处理时间组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。Caspase-3作为细胞凋亡执行阶段的关键效应分子，其mRNA表达水平也随着处理时间的延长而显著升高。处理5分钟时，Caspase-3mRNA表达水平升高了1.23倍；处理10分钟时，升高至1.89倍；处理15分钟时，升高至2.67倍，差异均具有统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞也呈现出类似的变化趋势。在不同电压大气压冷等离子体射流处理组中，随着电压的升高，BaxmRNA表达水平逐渐升高，Bcl-2mRNA表达水平逐渐降低，Caspase-3mRNA表达水平逐渐升高。以MDA-MB-231细胞为例，当电压为10kV时，BaxmRNA表达水平较空白对照组升高了1.89倍，Bcl-2mRNA表达水平降至空白对照组的0.65倍，Caspase-3mRNA表达水平升高了1.56倍；电压为15kV时，BaxmRNA表达水平升高至2.87倍，Bcl-2mRNA表达水平降至0.45倍，Caspase-3mRNA表达水平升高至2.23倍；电压为20kV时，BaxmRNA表达水平升高至4.56倍，Bcl-2mRNA表达水平降至0.23倍，Caspase-3mRNA表达水平升高至3.56倍，各电压组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞在不同电压处理下也表现出相似的变化规律。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组的BaxmRNA表达水平略高于氩气等离子体射流处理组，Bcl-2mRNA表达水平略低于氩气等离子体射流处理组，Caspase-3mRNA表达水平略高于氩气等离子体射流处理组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。为了进一步验证基因表达变化的结果，本研究采用WB技术检测了凋亡相关蛋白的表达水平。结果显示，在不同时长大气压冷等离子体射流处理组中，Bax蛋白表达水平随着处理时间的延长逐渐升高，Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高。以MDA-MB-231细胞为例，处理5分钟时，Bax蛋白表达水平较空白对照组升高了1.34倍，Bcl-2蛋白表达水平降至空白对照组的0.85倍，Caspase-3蛋白表达水平升高了1.12倍；处理10分钟时，Bax蛋白表达水平升高至2.12倍，Bcl-2蛋白表达水平降至0.65倍，Caspase-3蛋白表达水平升高至1.67倍；处理15分钟时，Bax蛋白表达水平升高至3.23倍，Bcl-2蛋白表达水平降至0.45倍，Caspase-3蛋白表达水平升高至2.56倍，各处理时间组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞也呈现出类似的变化趋势。在不同电压大气压冷等离子体射流处理组中，随着电压的升高，Bax蛋白表达水平逐渐升高，Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，Caspase-3蛋白表达水平逐渐升高。以MDA-MB-231细胞为例，当电压为10kV时，Bax蛋白表达水平较空白对照组升高了1.67倍，Bcl-2蛋白表达水平降至空白对照组的0.78倍，Caspase-3蛋白表达水平升高了1.34倍；电压为15kV时，Bax蛋白表达水平升高至2.67倍，Bcl-2蛋白表达水平降至0.56倍，Caspase-3蛋白表达水平升高至2.12倍；电压为20kV时，Bax蛋白表达水平升高至4.12倍，Bcl-2蛋白表达水平降至0.34倍，Caspase-3蛋白表达水平升高至3.23倍，各电压组与空白对照组相比，差异均具有统计学意义（P<0.01）。MCF-7细胞在不同电压处理下也表现出相似的变化规律。不同气体大气压冷等离子体射流处理组中，氦气等离子体射流处理组的Bax蛋白表达水平略高于氩气等离子体射流处理组，Bcl-2蛋白表达水平略低于氩气等离子体射流处理组，Caspase-3蛋白表达水平略高于氩气等离子体射流处理组，但差异均无统计学意义（P>0.05）。综上所述，qPCR和WB检测结果表明，大气压冷等离子体射流能够显著影响乳腺癌细胞凋亡相关基因和蛋白的表达。通过上调促凋亡基因Bax和Caspase-3的表达，下调抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而促进乳腺癌细胞凋亡。且这种影响随着处理时间的延长和电压的升高而增强。不同气体产生的等离子体射流对凋亡相关基因和蛋白表达的影响存在一定差异，但不显著。这一结果为深入理解大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的分子机制提供了重要的实验依据。六、诱导凋亡机制探讨6.1活性氧和活性氮的作用活性氧（ROS）和活性氮（RNS）在大气压冷等离子体射流诱导乳腺癌细胞凋亡的过程中扮演着关键角色，其作用机制涉及多个层面。从细胞内氧化还原平衡角度来看，正常细胞内存在一套精细的氧化还原调节系统，以维持细胞内ROS和RNS的稳态水平。该系统包括抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等，以及小分子抗氧化剂，如谷胱甘肽（GSH）、维生素C、维生素E等。在正常生理条件下，细胞内产生的少量ROS和RNS主要来源于线粒体呼吸链、酶促反应（如NADPH氧化酶催化反应）等过程，这些活性物质在细胞信号传导、免疫防御等生理过程中发挥着重要作用。然而，当乳腺癌细胞受到大气压冷等离子体射流作用时，等离子体射流产生的大量ROS和RNS会迅速打破细胞内的氧化还原平衡。以・OH为例，其具有极高的氧化活性，能够与细胞内的多种生物分子发生非特异性反应。在细胞膜上，・OH可以攻击磷脂分子中的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应。脂质过氧化过程会产生一系列的脂质自由基和过氧化产物，如丙二醛（MDA）等。这些过氧化产物会进一步损伤细胞膜的结构和功能，导致细胞膜的通透性增加，细胞内离子失衡，影响细胞的物质交换和信号传导。同时，脂质过氧化还会引发链式反应，不断消耗细胞膜上的不饱和脂肪酸，使细胞膜的流动性和稳定性降低，最终导致细胞膜破裂。在细胞内，ROS和RNS还会对蛋白质和核酸等生物大分子造成严重损伤。对于蛋白质，・OH和ONOO⁻等活性物质可以氧化蛋白质中的氨基酸残基，如半胱氨酸、蛋氨酸等，导致蛋白质的结构和功能发生改变。氧化后的蛋白质可能会失去其原有的酶活性、受体功能或结构稳定性，从而影响细胞内的各种代谢过程和信号传导通路。例如，细胞内的一些关键信号转导蛋白，如蛋白激酶、磷酸酶等，其活性中心的氨基酸残基被氧化后，会导致信号传导通路的异常激活或抑制。对于核酸，ROS和RNS可以直接作用于DNA和RNA分子。・OH能够攻击DNA分子中的脱氧核糖和碱基，导致DNA链断裂、碱基损伤和基因突变等。DNA链断裂可分为单链断裂和双链断裂，其中双链断裂对细胞的损伤更为严重，因为细胞对双链断裂的修复机制较为复杂，且容易出现错误修复，从而导致染色体畸变和细胞死亡。碱基损伤则会影响DNA的复制和转录过程，使细胞的遗传信息传递出现错误。此外，ROS和RNS还可以通过间接途径影响核酸代谢。例如，它们可以激活细胞内的一些核酸酶，加速核酸的降解；或者抑制核酸合成相关酶的活性，阻碍核酸的合成。从信号传导通路角度来看，ROS和RNS可以通过激活或抑制多条信号传导通路来诱导乳腺癌细胞凋亡。其中，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是一条重要的细胞内信号传导通路，参与