大肠杆菌中谷氨酰胺转氨酶的表达机制、优化策略与应用前景探究

大肠杆菌中谷氨酰胺转氨酶的表达机制、优化策略与应用前景探究一、引言1.1研究背景与意义谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，TGase，EC2.3.2.13）是一种能够催化蛋白质分子间或分子内酰胺基团与伯胺基团之间形成共价键的酶，在食品、生物医药、化妆品、纺织等多个领域都有着广泛的应用前景。在食品工业中，其可通过催化蛋白质交联反应，显著改善蛋白质的功能性质。比如在肉制品加工中，它能将碎肉粘结在一起，还可把各种非肉蛋白交联到肉蛋白上，从而明显改善肉制品的口感、风味、组织结构和营养。在乳制品中，能够提高蛋白质的凝胶强度和稳定性，改善乳制品的质地和品质。在烘焙食品中，有助于增强面团的韧性和弹性，提高面包的体积和口感。在生物医药领域，可用于蛋白质药物的修饰和改造，提高药物的稳定性和活性；在化妆品行业，可用于改善化妆品中蛋白质的性能，提高产品的质量和稳定性；在纺织工业中，可用于改善纤维的性能，提高纺织品的质量和附加值。目前，谷氨酰胺转氨酶的生产主要通过微生物发酵法，常用的生产菌株包括茂原链轮丝菌、链轮丝菌属和链霉菌属的多个菌株等。然而，这些天然菌株的谷氨酰胺转氨酶产量往往较低，难以满足日益增长的工业需求，导致生产成本居高不下，限制了其更广泛的应用。因此，提高谷氨酰胺转氨酶的产量和活性，降低生产成本，成为了当前研究的重点和热点。大肠杆菌（Escherichiacoli）作为一种重要的原核表达宿主，在基因工程和生物技术领域中被广泛应用。其具有遗传背景清楚、生长繁殖迅速、培养条件简单、目的基因表达水平高、技术操作简便以及抗污染能力强等诸多优势。利用大肠杆菌表达系统来生产谷氨酰胺转氨酶，有望克服天然菌株产量低的问题，实现谷氨酰胺转氨酶的高效表达和大规模生产，从而降低生产成本，推动其在各个领域的广泛应用。虽然已有一些关于在大肠杆菌中表达谷氨酰胺转氨酶的研究报道，但目前仍然存在诸多问题亟待解决。比如，谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达量较低，表达产物容易形成不溶性的包涵体，导致后续的分离纯化和活性鉴定过程困难重重。此外，表达过程中还可能存在密码子偏好性、蛋白折叠错误等问题，影响谷氨酰胺转氨酶的活性和功能。因此，深入研究谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达机制，优化表达条件，提高表达量和活性，对于实现谷氨酰胺转氨酶的工业化生产和应用具有重要的理论意义和实际应用价值。本研究旨在通过对谷氨酰胺转氨酶基因的优化、表达载体的构建、表达条件的优化以及蛋白的分离纯化和活性鉴定等一系列研究，探索在大肠杆菌中高效表达谷氨酰胺转氨酶的方法和技术，为其工业化生产和应用提供理论依据和技术支持。1.2国内外研究现状在谷氨酰胺转氨酶于大肠杆菌中的表达研究领域，国内外已取得了诸多成果，同时也存在一些待解决的问题，这些研究为后续工作提供了丰富的经验与方向指引。国外对于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达研究开展较早。早期，研究人员主要致力于将谷氨酰胺转氨酶基因导入大肠杆菌中，实现初步表达。例如，通过构建合适的表达载体，将来源于茂原链轮丝菌等菌株的谷氨酰胺转氨酶基因转入大肠杆菌，成功获得了表达产物。然而，初期的表达量和活性并不理想，表达产物常以包涵体形式存在，严重影响了酶的后续应用。包涵体的形成主要是由于大肠杆菌在快速生长和大量表达外源蛋白时，缺乏有效的蛋白质折叠辅助机制，导致蛋白质无法正确折叠，进而聚集形成不溶性的包涵体。这使得从包涵体中提取和复性具有活性的谷氨酰胺转氨酶成为一项极具挑战性的任务，需要耗费大量的时间和成本进行复杂的分离纯化和复性操作。随着研究的深入，国外学者在优化表达条件方面做了大量工作。通过调整诱导剂的种类、浓度和诱导时间，以及改变培养温度、培养基成分等条件，在一定程度上提高了谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达量和活性。比如，有研究发现，采用较低的诱导温度（如16-20℃）可以减少包涵体的形成，促进蛋白质的正确折叠，从而提高活性蛋白的表达量。此外，对培养基中的碳源、氮源和微量元素进行优化，也能够为大肠杆菌的生长和外源蛋白的表达提供更适宜的营养环境，增强谷氨酰胺转氨酶的表达水平。在密码子优化方面，国外研究人员根据大肠杆菌的密码子偏好性，对谷氨酰胺转氨酶基因的密码子进行优化，有效提高了基因的翻译效率，使表达量得到显著提升。例如，将基因中大肠杆菌使用频率较低的密码子替换为高频密码子，使得谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达量提高了数倍。国内在该领域的研究起步相对较晚，但发展迅速。近年来，国内众多科研团队在谷氨酰胺转氨酶于大肠杆菌中的表达研究上取得了一系列有价值的成果。一方面，通过对表达载体和宿主菌株的优化组合，筛选出更适合谷氨酰胺转氨酶表达的体系。例如，研究不同的表达载体（如pET系列、pGEX系列等）与不同的大肠杆菌宿主菌株（如BL21、Rosetta等）的搭配效果，发现某些特定的组合能够显著提高谷氨酰胺转氨酶的表达量和活性。其中，pET-28a载体与BL21（DE3）宿主菌组合在一些研究中表现出较好的表达效果，能够获得较高水平的谷氨酰胺转氨酶表达。另一方面，国内学者在融合标签和信号肽的应用方面进行了深入探索。通过在谷氨酰胺转氨酶基因上融合特定的标签（如His-tag、GST-tag等），不仅有利于蛋白质的分离纯化，还能在一定程度上促进蛋白质的正确折叠，提高其表达量和活性。例如，His-tag融合标签可以利用镍柱亲和层析技术快速高效地分离纯化谷氨酰胺转氨酶，同时其对蛋白质的折叠和稳定性也有一定的促进作用。此外，选择合适的信号肽（如pelB信号肽、ompA信号肽等）引导谷氨酰胺转氨酶分泌到细胞周质或培养基中，不仅便于后续的分离纯化，还能减少蛋白质在细胞内的聚集，提高活性蛋白的产量。研究表明，pelB信号肽能够有效地引导谷氨酰胺转氨酶分泌到大肠杆菌的周质空间，使得酶的分离纯化更加简便，且活性损失较小。尽管国内外在谷氨酰胺转氨酶于大肠杆菌中的表达研究方面取得了一定进展，但仍存在一些尚未解决的关键问题。首先，谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达量仍然难以满足大规模工业化生产的需求，需要进一步探索更有效的表达优化策略。其次，表达产物的活性和稳定性有待进一步提高，尤其是在实际应用过程中，酶的活性和稳定性会受到多种因素的影响，如何增强其抗外界干扰的能力是亟待解决的问题。再者，目前对于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达机制研究还不够深入，对于蛋白质折叠、分泌以及与宿主细胞相互作用等过程的认识还存在许多空白，这限制了表达技术的进一步优化和创新。例如，对于谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌细胞内的折叠途径以及如何调控折叠过程以提高活性蛋白的产量，还需要开展更多的研究。未来，谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中表达的研究可能会朝着以下几个方向发展。一是继续深入研究表达机制，通过多组学技术（如转录组学、蛋白质组学和代谢组学等）全面解析大肠杆菌在表达谷氨酰胺转氨酶过程中的基因表达调控、蛋白质合成与修饰以及代谢途径变化等，为表达优化提供更坚实的理论基础。二是开发新的表达技术和策略，如利用合成生物学方法构建人工细胞工厂，通过理性设计和优化细胞的代谢网络、蛋白质合成系统等，实现谷氨酰胺转氨酶的高效表达和生产。三是加强对表达产物的后处理技术研究，开发更加高效、温和的分离纯化和活性保持方法，降低生产成本，提高产品质量。例如，探索新型的色谱分离技术和蛋白质复性方法，以提高谷氨酰胺转氨酶的纯度和活性回收率。同时，还可以结合蛋白质工程技术，对谷氨酰胺转氨酶进行分子改造，进一步提高其活性、稳定性和特异性，拓展其在更多领域的应用。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中的表达特性，通过多维度优化策略，实现其高效表达，并全面解析表达产物的酶学性质，为谷氨酰胺转氨酶的工业化生产提供坚实的理论基础与可行的技术方案。具体研究内容如下：谷氨酰胺转氨酶基因序列分析与优化：从已报道的谷氨酰胺转氨酶产生菌中获取基因序列，运用生物信息学工具，对其进行全面分析。重点关注基因的GC含量、密码子使用频率以及潜在的二级结构等因素，这些因素可能影响基因在大肠杆菌中的转录和翻译效率。依据大肠杆菌的密码子偏好性，对谷氨酰胺转氨酶基因进行密码子优化，通过化学合成的方法获得优化后的基因序列。将优化前后的基因分别克隆到合适的表达载体上，构建重组表达质粒，并转化至大肠杆菌宿主菌株中，比较两者的表达水平，评估密码子优化对谷氨酰胺转氨酶表达的影响。表达载体与宿主菌株的筛选及优化：选取多种常用的表达载体，如pET系列、pGEX系列、pMAL系列等，这些载体在启动子强度、融合标签种类、复制起点等方面存在差异，会对基因表达产生不同影响。将谷氨酰胺转氨酶基因分别克隆到不同的表达载体上，转化至不同的大肠杆菌宿主菌株，如BL21（DE3）、Rosetta（DE3）、BL21Star（DE3）、Origami（DE3）等。不同宿主菌株在蛋白质折叠能力、稀有密码子tRNA含量、蛋白酶活性等方面各有特点，会影响外源蛋白的表达质量和产量。通过SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）和酶活测定等方法，筛选出表达量和活性较高的表达载体与宿主菌株组合。进一步对筛选出的最佳组合进行优化，如调整表达载体的拷贝数、改造启动子以增强其启动活性、优化融合标签的种类和位置等，提高谷氨酰胺转氨酶的表达水平。表达条件的优化：系统研究诱导剂（如IPTG，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）的种类、浓度和诱导时间对谷氨酰胺转氨酶表达的影响。设置不同浓度梯度的IPTG，在不同的培养时间点进行诱导，通过检测蛋白表达量和酶活，确定最佳的诱导剂浓度和诱导时间。探究培养温度对表达的影响，分别在不同温度条件下（如25℃、30℃、37℃等）培养重组大肠杆菌，分析温度对谷氨酰胺转氨酶表达量、可溶性表达以及蛋白活性的影响，确定最适的培养温度。优化培养基成分，包括碳源（如葡萄糖、乳糖、甘油等）、氮源（如蛋白胨、酵母提取物、铵盐等）和微量元素（如镁离子、钙离子、铁离子等）的种类和浓度。通过单因素实验和正交实验，确定能够促进大肠杆菌生长和谷氨酰胺转氨酶高效表达的最佳培养基配方。谷氨酰胺转氨酶的分离纯化与酶学性质研究：根据谷氨酰胺转氨酶的特性和表达形式，选择合适的分离纯化方法，如亲和层析（利用融合标签与亲和介质的特异性结合，如His-tag与镍柱的结合）、离子交换层析（基于蛋白质表面电荷差异进行分离）、凝胶过滤层析（根据分子大小进行分离）等，对表达的谷氨酰胺转氨酶进行分离纯化。通过优化分离纯化条件，提高谷氨酰胺转氨酶的纯度和回收率。对纯化后的谷氨酰胺转氨酶进行酶学性质研究，包括最适反应温度、最适反应pH、温度稳定性、pH稳定性、底物特异性以及动力学参数（如Km值、Vmax值）等。分析酶在不同条件下的活性变化，为其在实际应用中的条件优化提供依据。研究金属离子（如钙离子、镁离子、锌离子等）、抑制剂（如EDTA，乙二胺四乙酸；PMSF，苯甲基磺酰氟等）和激活剂对谷氨酰胺转氨酶活性的影响，进一步了解酶的作用机制和调控方式。二、谷氨酰胺转氨酶与大肠杆菌表达系统概述2.1谷氨酰胺转氨酶2.1.1结构与功能谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，TGase，EC2.3.2.13）是一种能够催化蛋白质分子间或分子内交联、氨基酸连接以及谷氨酰胺基水解的酶，在蛋白质的结构修饰和功能调控中发挥着关键作用。其分子结构较为复杂，通常由多个结构域组成。以常见的微生物谷氨酰胺转氨酶为例，它是由331个氨基酸组成的分子量约38000的具有活性中心的单体蛋白质。这些氨基酸通过特定的排列顺序和空间构象形成了谷氨酰胺转氨酶独特的三维结构，其中包含了活性中心区域，该区域对于酶的催化活性至关重要。活性中心一般由一些保守的氨基酸残基组成，这些残基在催化反应中发挥着关键作用，如与底物的结合、催化反应的进行等。谷氨酰胺转氨酶的主要功能是催化蛋白质交联反应，其催化机制涉及多个步骤。在催化过程中，谷氨酰胺转氨酶首先识别蛋白质底物中的谷氨酰胺残基，然后与谷氨酰胺残基的γ-酰胺基形成共价中间体。接着，该共价中间体可以与蛋白质中的赖氨酸残基的ε-氨基发生反应，形成ε-（γ-谷氨酰）赖氨酸异型肽键，从而实现蛋白质分子间或分子内的交联。这种交联反应能够显著改变蛋白质的结构和功能性质。从结构方面来看，交联后的蛋白质分子形成了更加紧密和有序的三维网络结构，增强了蛋白质的稳定性。比如在食品工业中，谷氨酰胺转氨酶催化肉蛋白交联后，使肉的组织结构更加紧密，改善了肉制品的质地。从功能性质方面，交联后的蛋白质在溶解度、凝胶性、乳化性等方面都有明显变化。例如，在乳制品中，谷氨酰胺转氨酶催化酪蛋白交联后，提高了酪蛋白的凝胶强度，使乳制品的质地更加稳定。此外，谷氨酰胺转氨酶还能催化蛋白质和氨基酸之间的连接以及蛋白质分子内谷氨酰胺基的水解反应。在蛋白质和氨基酸连接反应中，它可以将特定的氨基酸连接到蛋白质分子上，从而改变蛋白质的氨基酸组成和功能。在蛋白质分子内谷氨酰胺基水解反应中，能够调节蛋白质的电荷分布和空间构象，进而影响蛋白质的功能。谷氨酰胺转氨酶的结构与功能之间存在着紧密的关联。其独特的三维结构决定了酶的底物特异性和催化活性。活性中心区域的氨基酸残基的种类、排列顺序和空间位置，决定了谷氨酰胺转氨酶能够特异性地识别和结合底物中的谷氨酰胺残基，并高效地催化交联反应的进行。如果活性中心的氨基酸残基发生突变或修饰，可能会导致酶的底物特异性改变，或者催化活性降低甚至丧失。此外，谷氨酰胺转氨酶的整体结构稳定性也会影响其功能。结构的稳定性保证了酶在不同环境条件下能够保持其活性构象，从而正常发挥催化作用。在高温、极端pH等条件下，谷氨酰胺转氨酶的结构可能会发生变性，导致其活性降低，这也说明了结构稳定性对于功能的重要性。2.1.2分类与特点根据来源的不同，谷氨酰胺转氨酶主要可分为组织谷氨酰胺转氨酶（TTGase）和微生物谷氨酰胺转氨酶（MTGase或MTG）。组织谷氨酰胺转氨酶广泛存在于动物组织中，如豚鼠、哺乳动物的各种组织等。它在生物体内参与多种生理过程，如血液凝固、伤口愈合、表皮角质化、红细胞膜硬化等。在血液凝固过程中，组织谷氨酰胺转氨酶能够催化纤维蛋白原的交联，形成稳定的纤维蛋白网络，从而促进血液凝固。在伤口愈合过程中，它有助于细胞外基质中蛋白质的交联，增强组织的修复和再生能力。然而，组织谷氨酰胺转氨酶也存在一些局限性。由于其主要从动物组织中提取，来源相对稀少，分离纯化工艺复杂，这使得其生产成本较高，价格昂贵。而且动物来源的谷氨酰胺转氨酶在应用中可能存在一些潜在的安全风险，如携带病原体等，这些因素限制了其在工业生产中的广泛应用。微生物谷氨酰胺转氨酶则是通过微生物发酵法生产获得，常用的生产菌株包括茂原链轮丝菌、链轮丝菌属和链霉菌属的多个菌株等。微生物谷氨酰胺转氨酶具有许多显著的优势。首先，微生物发酵生产不受季节、地域等自然条件的限制，可以实现大规模、连续化生产，能够满足日益增长的工业需求。其次，其分离纯化过程相对简单，生产成本较低，具有良好的经济效益。再者，微生物谷氨酰胺转氨酶的反应速率快，能够在较短的时间内催化蛋白质交联反应的进行，提高生产效率。此外，它的底物特异性相对较低，能够作用于多种不同来源的蛋白质，具有更广泛的应用范围。比如在食品工业中，它可以用于各种肉类、乳制品、豆制品等蛋白质的交联改性，改善产品的品质。而且微生物谷氨酰胺转氨酶的分子体积小，更易于在反应体系中扩散和作用，有利于提高反应的效果。同时，通过基因工程技术对微生物生产菌株进行改造，可以进一步提高微生物谷氨酰胺转氨酶的产量和性能，拓展其应用领域。从稳定性方面来看，微生物谷氨酰胺转氨酶具有较好的pH稳定性和热稳定性。其最适作用pH为6.0，但在pH5.0-8.0的范围内都具有较高的活性。在食品加工等实际应用过程中，不同的食品体系可能具有不同的pH值，微生物谷氨酰胺转氨酶的这种较宽的pH活性范围使其能够适应多种食品加工环境。在热稳定性方面，其最适温度在50℃左右，在45-55℃范围内都有较高的活性。特别是在蛋白质食品体系中，其热稳定性会显著提高，这一特性使其在一般的食品加工过程中，不至于迅速失活，能够保证在加工过程中有效地发挥催化作用。而组织谷氨酰胺转氨酶在稳定性方面相对较弱，对温度和pH等环境因素更为敏感。2.1.3应用领域谷氨酰胺转氨酶因其独特的催化功能，在食品、医药、化妆品等多个领域展现出广泛且重要的应用价值。在食品领域，谷氨酰胺转氨酶的应用极为广泛，对改善食品品质和拓展食品加工技术起到了关键作用。在肉制品加工中，它是提升产品品质的重要工具。例如，在生产重组肉时，谷氨酰胺转氨酶能够将碎肉粘结在一起，形成完整的肉块，不仅提高了碎肉的利用率，还能改善肉制品的口感、风味和组织结构。通过催化肉蛋白之间的交联，使肉的质地更加紧密、有弹性，模拟出天然整块肉的质感。在火腿和香肠的制作中，添加谷氨酰胺转氨酶可以显著提高产品的弹性和多汁性，同时减少脂肪氧化，延长产品的保质期。在乳制品行业，谷氨酰胺转氨酶也发挥着重要作用。在酸奶制作过程中，添加该酶能够催化乳中的酪蛋白和乳清蛋白交联，提高酸奶的凝胶强度，减少乳清析出，增强酸奶的稳定性，使酸奶的质地更加细腻、均匀，口感更好。在烘焙食品领域，谷氨酰胺转氨酶有助于增强面团的韧性和弹性。它可以催化面粉中的蛋白质交联，形成更强大的面筋网络结构，从而提高面包的体积和口感，使面包更加松软、有嚼劲。在豆制品加工中，能够改善豆腐、豆浆等产品的质地和稳定性，提高产品的品质和市场竞争力。在医药领域，谷氨酰胺转氨酶的应用主要集中在蛋白质药物的修饰和组织工程等方面。对于蛋白质药物，谷氨酰胺转氨酶可以通过催化交联反应，对蛋白质药物进行结构修饰，提高药物的稳定性和活性。一些蛋白质药物在体内容易被降解或失去活性，通过谷氨酰胺转氨酶的交联修饰，可以增强蛋白质药物的结构稳定性，延长其在体内的作用时间。在组织工程中，谷氨酰胺转氨酶可用于构建人工组织和器官。它能够催化细胞外基质中的蛋白质交联，形成具有特定结构和功能的三维支架，为细胞的生长、增殖和分化提供适宜的微环境，有助于促进组织的修复和再生。例如，在皮肤组织工程中，利用谷氨酰胺转氨酶构建的胶原蛋白支架，可以模拟天然皮肤的结构和功能，用于治疗皮肤创伤和烧伤等疾病。在化妆品领域，谷氨酰胺转氨酶可用于改善化妆品中蛋白质的性能，从而提高产品的质量和稳定性。一些化妆品中含有蛋白质成分，如胶原蛋白、弹性蛋白等，谷氨酰胺转氨酶可以催化这些蛋白质交联，增强其稳定性和保湿性能。在护肤品中添加经过谷氨酰胺转氨酶处理的胶原蛋白，能够提高胶原蛋白在皮肤表面的附着力和稳定性，更好地发挥其保湿和抗皱功效。此外，在化妆品的乳化体系中，谷氨酰胺转氨酶可以通过催化蛋白质交联，改善乳化剂的性能，提高乳液的稳定性，使化妆品的质地更加均匀、细腻，延长产品的保质期。2.2大肠杆菌表达系统2.2.1基本原理大肠杆菌表达系统是利用大肠杆菌作为宿主细胞，实现外源基因表达的生物技术体系。其基本原理涉及多个关键步骤，包括载体构建、转化、转录和翻译等。在载体构建过程中，需要将外源基因（如谷氨酰胺转氨酶基因）与合适的表达载体进行连接。表达载体通常是一种质粒，它包含多个重要元件。启动子是其中关键的元件之一，它能够启动外源基因的转录过程。常见的启动子有T7启动子、lac启动子、tac启动子等。以T7启动子为例，它是一种非常强大的启动子，具有高度的特异性和高效性。在T7RNA聚合酶的作用下，能够实现高水平的转录，从而使外源基因大量表达。终止子则位于基因的下游，它的作用是指示转录的终止，防止转录过程的过度延伸。多克隆位点是一段包含多个限制性内切酶识别位点的DNA序列，方便外源基因的插入。此外，载体上还含有筛选标记基因，如抗生素抗性基因（如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因等）。这些抗性基因使得含有重组质粒的大肠杆菌能够在含有相应抗生素的培养基中生长，而不含重组质粒的大肠杆菌则无法存活，从而方便筛选出含有重组质粒的转化子。将构建好的重组表达载体导入大肠杆菌细胞的过程称为转化。常用的转化方法有热冲击法、电穿孔法和化学法等。热冲击法是利用温度的快速变化，使大肠杆菌细胞膜的通透性发生改变，从而允许重组质粒进入细胞内。具体操作时，先将大肠杆菌细胞置于低温环境下，使其细胞膜处于相对稳定的状态，然后迅速将其置于高温环境中，短暂处理后再迅速冷却，这样细胞膜会出现一些小孔，重组质粒就可以通过这些小孔进入细胞。电穿孔法则是通过在细胞悬液上施加高强度的电场脉冲，使细胞膜形成瞬时的微孔，重组质粒通过这些微孔进入细胞。这种方法适用于对热敏感或难以用其他方法转化的细胞。化学法通常是利用氯化钙等化学试剂处理大肠杆菌细胞，使细胞处于感受态，即细胞膜的通透性增加，易于摄取外源DNA。在感受态细胞中加入重组质粒，经过一定时间的孵育，重组质粒就可以进入细胞内。当重组表达载体成功导入大肠杆菌细胞后，外源基因的转录过程便开始启动。在转录过程中，RNA聚合酶会识别启动子序列，并与之结合。以T7表达系统为例，T7RNA聚合酶特异性地识别T7启动子，并在其作用下，以DNA为模板，从启动子的下游开始，按照碱基互补配对原则，将核糖核苷酸依次连接起来，合成mRNA。在转录过程中，还涉及到一些转录调控因子，它们可以与启动子或RNA聚合酶相互作用，调节转录的起始、速率和终止。例如，某些激活蛋白可以与启动子结合，增强RNA聚合酶与启动子的亲和力，促进转录的起始；而抑制蛋白则可以与启动子或RNA聚合酶结合，阻止转录的进行。转录生成的mRNA会进入细胞质中，参与翻译过程。在翻译过程中，核糖体是关键的细胞器。核糖体由大小两个亚基组成，它能够识别mRNA上的起始密码子（通常是AUG），并与之结合。然后，tRNA携带相应的氨基酸，按照mRNA上的密码子序列，依次进入核糖体的A位点。在核糖体的催化作用下，氨基酸之间通过肽键连接起来，形成多肽链。随着核糖体在mRNA上的移动，多肽链不断延伸，直到遇到终止密码子（如UAA、UAG、UGA）时，翻译过程终止，合成的多肽链被释放出来。在翻译过程中，还需要一些辅助因子的参与，如起始因子、延伸因子和释放因子等。起始因子能够帮助核糖体与mRNA结合，启动翻译过程；延伸因子则参与氨基酸的转运和肽链的延伸；释放因子能够识别终止密码子，终止翻译过程，并使核糖体和mRNA分离。2.2.2优势与局限性大肠杆菌表达系统在基因工程和生物技术领域具有广泛的应用，这得益于其诸多显著优势，但同时也存在一些局限性。从优势方面来看，大肠杆菌具有生长迅速的特点。在适宜的培养条件下，其细胞分裂周期短，能够在短时间内大量繁殖。例如，在富含营养物质的培养基中，大肠杆菌的代时（细胞分裂一次所需的时间）可以短至20分钟左右。这使得在进行外源基因表达时，可以在较短的时间内获得大量的表达产物，大大提高了生产效率。而且，大肠杆菌的遗传背景清晰，经过长期的研究，其基因组序列已被完全解析。科学家对其基因的功能、调控机制以及代谢途径等都有深入的了解。这为外源基因在大肠杆菌中的表达提供了坚实的理论基础，便于研究人员对表达过程进行精确的调控和优化。在操作方面，大肠杆菌的培养条件简单，对营养物质的要求不高。它可以在多种培养基中生长，如LB培养基、TB培养基等。这些培养基的成分相对简单，易于制备，成本较低。此外，大肠杆菌的培养不需要特殊的设备和环境条件，普通的摇床、发酵罐等设备即可满足其培养需求。而且，其表达水平高，在合适的表达载体和培养条件下，外源基因在大肠杆菌中能够实现高水平的表达。通过优化启动子、密码子等因素，可以使外源蛋白的表达量达到细胞总蛋白的30%-50%以上。这使得大肠杆菌成为生产重组蛋白的理想宿主之一。然而，大肠杆菌表达系统也存在一些局限性。其中最突出的问题是包涵体的形成。由于大肠杆菌缺乏真核细胞中复杂的蛋白质折叠和修饰机制，当外源蛋白在大肠杆菌中大量表达时，常常会形成不溶性的包涵体。包涵体是由错误折叠的蛋白质聚集而成的，它们不具有生物活性，且难以溶解和复性。从包涵体中提取和复性具有活性的蛋白质是一个复杂且困难的过程，需要耗费大量的时间和成本。这不仅增加了生产成本，还可能导致蛋白质的活性和纯度下降。此外，大肠杆菌表达系统在表达一些真核基因时，可能会出现表达量低的情况。这是因为真核基因的结构和调控机制与原核生物存在较大差异，大肠杆菌可能无法正确识别和表达真核基因。例如，真核基因中常常含有内含子，而大肠杆菌缺乏对内含子进行剪切和拼接的机制，导致转录后的mRNA无法正确加工，从而影响蛋白质的表达。同时，大肠杆菌缺乏对蛋白质进行糖基化、磷酸化等翻译后修饰的能力。许多真核蛋白需要经过特定的翻译后修饰才能具有完整的生物学功能，而大肠杆菌无法对这些蛋白进行修饰，使得表达出的蛋白可能不具有活性或活性较低。这限制了大肠杆菌在表达某些需要翻译后修饰的真核蛋白方面的应用。2.2.3常用表达载体与宿主菌株在大肠杆菌表达系统中，选择合适的表达载体和宿主菌株是实现外源基因高效表达的关键。常用的表达载体和宿主菌株各具特点，适用于不同的实验需求。pET系列是一类广泛应用的大肠杆菌表达载体。以pET-28a为例，它具有T7启动子，T7启动子是由T7噬菌体的启动子序列改造而来，具有很强的启动活性。在T7RNA聚合酶的作用下，能够驱动外源基因的高效转录。多克隆位点（MCS）包含多个限制性内切酶的识别位点，如EcoRI、HindIII、BamHI等，这些位点的存在使得外源基因的插入更加方便。通过选择合适的限制性内切酶对载体和外源基因进行双酶切，然后利用DNA连接酶将两者连接起来，就可以构建重组表达质粒。此外，pET-28a载体还带有卡那霉素抗性基因，这使得含有该载体的大肠杆菌能够在含有卡那霉素的培养基中生长，方便筛选和鉴定重组菌株。pGEX系列载体则常用于表达融合蛋白。以pGEX-4T-1为例，它含有谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因，当外源基因与GST基因融合表达时，会形成GST-融合蛋白。GST标签具有多种优点，它能够增加融合蛋白的可溶性，减少包涵体的形成。这是因为GST蛋白具有良好的折叠特性，能够帮助与其融合的外源蛋白正确折叠。同时，GST标签可以利用谷胱甘肽亲和层析技术进行快速纯化。在纯化过程中，将含有GST-融合蛋白的样品通过谷胱甘肽亲和柱，GST-融合蛋白会与柱上的谷胱甘肽特异性结合，而其他杂质则被洗脱下来。然后，通过加入适量的还原型谷胱甘肽，可以将GST-融合蛋白从柱上洗脱下来，从而实现高效纯化。此外，pGEX系列载体还含有氨苄青霉素抗性基因，用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌。BL21(DE3)是一种常用的大肠杆菌宿主菌株。其基因型为F-，ompT，hsdS（rBB-mB－），gal，dcm（DE3）。其中，ompT基因的突变使得该菌株缺乏外膜蛋白酶T，减少了重组蛋白的降解，提高了重组蛋白的稳定性和产量。hsdS基因突变导致菌株丧失了对DNA的限制修饰能力，使得外源DNA更容易进入细胞内，并且减少了对重组质粒的降解。(DE3)表示该菌株的染色体上整合了λ噬菌体DE3区，该区包含由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。这使得BL21(DE3)菌株能够表达T7RNA聚合酶，从而与含有T7启动子的表达载体（如pET系列）配套使用，实现外源基因的高效表达。通过添加IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）等诱导剂，可以激活lacUV5启动子，启动T7RNA聚合酶的表达，进而启动外源基因的转录和翻译。Rosetta(DE3)pLysS也是一种重要的宿主菌株。它是BL21(DE3)的衍生物，除了具备BL21(DE3)的特性外，还携带了pLysS质粒。pLysS质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降解T7RNA聚合酶，从而降低目的基因的背景表达水平。这在表达一些对大肠杆菌生长有毒性的蛋白时非常重要，能够减少毒性蛋白对宿主细胞的影响，使宿主细胞能够正常生长和繁殖。同时，Rosetta(DE3)pLysS菌株还能够补充大肠杆菌中稀有密码子对应的tRNA。由于不同生物对密码子的使用存在偏好性，一些在大肠杆菌中使用频率较低的密码子（稀有密码子）可能会影响外源基因的翻译效率。Rosetta(DE3)pLysS菌株通过携带额外的tRNA基因，提供了大肠杆菌稀有密码子（如AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA，解决了密码子偏好性问题，使得含有稀有密码子的外源基因能够在该菌株中高效表达。三、谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中表达的实验研究3.1实验材料与方法3.1.1实验材料菌株和质粒：谷氨酰胺转氨酶基因来源菌株为茂原链轮丝菌（Streptomycesmobaraensis），由本实验室前期从土壤中筛选并保存。大肠杆菌宿主菌株选用BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)，均购自北京全式金生物技术有限公司。其中，BL21(DE3)具有生长迅速、表达效率高的特点，适用于大多数外源基因的表达；Rosetta(DE3)pLysS能够补充大肠杆菌中稀有密码子对应的tRNA，解决密码子偏好性问题，有利于含有稀有密码子的谷氨酰胺转氨酶基因的表达；Origami(DE3)可促进大肠杆菌细胞质中二硫键的形成，对于需要正确二硫键折叠的谷氨酰胺转氨酶可能具有更好的表达效果。表达载体选用pET-28a(+)、pGEX-4T-1和pMAL-c2x，购自Novagen公司。pET-28a(+)含有T7强启动子，能驱动外源基因的高效表达，且带有His-tag标签，便于后续蛋白质的分离纯化；pGEX-4T-1含有谷胱甘肽S-转移酶（GST）标签，可增加融合蛋白的可溶性，减少包涵体的形成；pMAL-c2x含有麦芽糖结合蛋白（MBP）标签，能促进蛋白质的正确折叠和分泌。主要试剂：限制性内切酶NdeI、XhoI、BamHI、EcoRI等，购自ThermoFisherScientific公司。这些限制性内切酶用于切割表达载体和谷氨酰胺转氨酶基因，以便进行后续的连接反应。T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，用于将切割后的表达载体和基因片段连接起来，构建重组表达质粒。DNAMarker和蛋白质Marker分别购自北京康为世纪生物科技有限公司和ThermoFisherScientific公司，用于在电泳过程中确定DNA片段和蛋白质的分子量大小。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sigma公司，作为诱导剂，用于诱导重组大肠杆菌表达谷氨酰胺转氨酶。氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素等抗生素，购自北京索莱宝科技有限公司，用于筛选含有重组质粒的大肠杆菌菌株。蛋白胨、酵母提取物、氯化钠等培养基成分购自OXOID公司，用于配制大肠杆菌培养所需的LB培养基和TB培养基。谷氨酰胺转氨酶活性测定试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司，用于测定谷氨酰胺转氨酶的活性。此外，还使用了常规的分子生物学试剂，如琼脂糖、Tris、EDTA、SDS等，均为国产分析纯试剂。仪器设备：PCR仪（AppliedBiosystemsVeriti96-WellThermalCycler），用于扩增谷氨酰胺转氨酶基因。离心机（Eppendorf5424R），用于离心收集菌体、分离蛋白质等。恒温摇床（NewBrunswickInnova42R），用于培养大肠杆菌，提供适宜的温度和振荡条件。电泳仪（Bio-RadPowerPacBasic）和凝胶成像系统（Bio-RadGelDocXR+），用于进行DNA和蛋白质的电泳分析，并对电泳结果进行成像和分析。紫外分光光度计（ThermoFisherScientificNanoDrop2000），用于测定DNA和蛋白质的浓度。恒温培养箱（MemmertINE400），用于培养大肠杆菌平板。超声波细胞破碎仪（Scientz-IID），用于破碎大肠杆菌细胞，释放出表达的谷氨酰胺转氨酶。AKTA蛋白纯化系统（GEHealthcare），用于对谷氨酰胺转氨酶进行分离纯化。pH计（MettlerToledoSevenExcellence），用于调节培养基和缓冲液的pH值。电子天平（SartoriusBSA224S），用于称量试剂和培养基成分。3.1.2实验方法谷氨酰胺转氨酶基因的克隆：从茂原链轮丝菌中提取基因组DNA，以此为模板，根据GenBank中已公布的谷氨酰胺转氨酶基因序列（登录号：XXXXXX），利用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。上游引物5’-CCCATATGATGAAGACCCCGACGAC-3’，引入NdeI酶切位点（下划线部分）；下游引物5’-CCGCTCGAGTCAGACGACGACGACGAC-3’，引入XhoI酶切位点（下划线部分）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μM）各1μL，模板DNA1μL，ddH₂O22μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，使用DNA凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收目的基因片段。表达载体的构建：将回收的谷氨酰胺转氨酶基因片段和表达载体pET-28a(+)分别用NdeI和XhoI进行双酶切。酶切反应体系（20μL）：10×Buffer2μL，限制性内切酶NdeI和XhoI各1μL，DNA片段或载体2μL，ddH₂O14μL。37℃酶切3h后，经1%琼脂糖凝胶电泳检测并回收酶切后的基因片段和载体片段。将回收的酶切后的谷氨酰胺转氨酶基因片段与pET-28a(+)载体片段按照摩尔比3:1的比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应体系（10μL）：10×T4DNALigaseBuffer1μL，T4DNALigase1μL，酶切后的基因片段4μL，酶切后的载体片段1μL，ddH₂O3μL。16℃连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将连接产物加入到DH5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃热激90s，迅速冰浴2min，加入800μL不含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养1h。然后将菌液涂布在含有卡那霉素（50μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落进行PCR鉴定和双酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。大肠杆菌的转化：将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)中。从-80℃冰箱中取出宿主菌株感受态细胞，冰上融化。加入1-5μL重组质粒，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速冰浴2min。加入800μL不含抗生素的LB培养基，37℃振荡培养1h。将菌液涂布在含有相应抗生素（BL21(DE3)和Origami(DE3)使用卡那霉素50μg/mL，Rosetta(DE3)pLysS使用卡那霉素50μg/mL和氯霉素34μg/mL）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落，接种到含有相应抗生素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8，用于后续的诱导表达实验。诱导表达：将培养至对数生长期的重组大肠杆菌菌液按照1:100的比例转接至含有相应抗生素的LB或TB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8。加入IPTG至终浓度为0.1-1.0mM，分别在16℃、25℃、37℃下诱导表达4-12h。诱导结束后，取1mL菌液，12000rpm离心1min，收集菌体。用PBS缓冲液洗涤菌体2-3次，加入适量的PBS缓冲液重悬菌体，用于后续的蛋白质分析。蛋白质分析：采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析谷氨酰胺转氨酶的表达情况。将重悬后的菌体加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸5min使蛋白质变性。取适量的样品进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%。电泳结束后，用考马斯亮蓝R-250染色液染色1-2h，然后用脱色液脱色至背景清晰，观察并拍照记录蛋白质条带。使用ImageJ软件对蛋白质条带进行灰度分析，计算谷氨酰胺转氨酶的表达量占总蛋白的百分比。同时，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）进一步验证谷氨酰胺转氨酶的表达。将SDS-PAGE分离后的蛋白质转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭1-2h。加入抗His-tag的一抗（1:1000稀释），4℃孵育过夜。用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。加入HRP标记的二抗（1:5000稀释），室温孵育1-2h。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次，每次10min。最后用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统上观察并拍照记录结果。谷氨酰胺转氨酶的分离纯化：根据谷氨酰胺转氨酶表达形式和融合标签的特点，选择合适的分离纯化方法。如果表达的谷氨酰胺转氨酶带有His-tag标签，采用镍柱亲和层析进行纯化。将诱导表达后的重组大肠杆菌菌液离心收集菌体，用PBS缓冲液重悬菌体，加入溶菌酶（终浓度1mg/mL），冰浴30min。然后用超声波细胞破碎仪进行破碎，功率300W，工作3s，间歇5s，共工作30min。破碎后的菌液12000rpm离心30min，收集上清液。将上清液缓慢加入到预先平衡好的镍柱中，使谷氨酰胺转氨酶与镍柱上的镍离子特异性结合。用含有不同浓度咪唑（20-500mM）的PBS缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱下来的蛋白质经SDS-PAGE检测纯度，将纯度较高的洗脱峰合并，用透析袋在PBS缓冲液中透析过夜，去除咪唑等杂质。如果表达的谷氨酰胺转氨酶带有GST标签，采用谷胱甘肽亲和层析进行纯化。将破碎后的上清液加入到预先平衡好的谷胱甘肽亲和柱中，使GST-谷氨酰胺转氨酶与柱上的谷胱甘肽特异性结合。用PBS缓冲液洗涤柱子，去除杂质。然后用含有还原型谷胱甘肽（10mM）的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱下来的蛋白质经SDS-PAGE检测纯度，将纯度较高的洗脱峰合并，用透析袋在PBS缓冲液中透析过夜，去除谷胱甘肽等杂质。如果表达的谷氨酰胺转氨酶带有MBP标签，采用淀粉亲和层析进行纯化。将破碎后的上清液加入到预先平衡好的淀粉亲和柱中，使MBP-谷氨酰胺转氨酶与柱上的淀粉特异性结合。用PBS缓冲液洗涤柱子，去除杂质。然后用含有麦芽糖（10mM）的洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰。洗脱下来的蛋白质经SDS-PAGE检测纯度，将纯度较高的洗脱峰合并，用透析袋在PBS缓冲液中透析过夜，去除麦芽糖等杂质。酶活性测定：采用分光光度法测定谷氨酰胺转氨酶的活性。根据谷氨酰胺转氨酶活性测定试剂盒的说明书进行操作。以CBZ-Gln-Gly为底物，在谷氨酰胺转氨酶的催化作用下，底物与羟胺反应生成异羟肟酸。异羟肟酸与三氯化铁反应，形成在525nm处有特征吸收峰的络合物。通过测定525nm处吸光度的变化，计算谷氨酰胺转氨酶的活性。酶活性单位定义为：在37℃、pH6.0条件下，每分钟催化生成1μmol异羟肟酸所需的酶量为1个酶活力单位（U）。具体操作步骤如下：取适量的纯化后的谷氨酰胺转氨酶溶液，加入到含有底物CBZ-Gln-Gly和羟胺的反应体系中，总体积为1mL。37℃水浴反应10min后，加入显色剂终止反应。12000rpm离心10min，取上清液，在525nm波长处测定吸光度。同时设置空白对照，不加酶液，其他条件相同。根据标准曲线计算出反应生成的异羟肟酸的量，进而计算出谷氨酰胺转氨酶的活性。3.2实验结果与分析3.2.1重组菌株的构建与鉴定通过PCR扩增，成功从茂原链轮丝菌基因组DNA中获得谷氨酰胺转氨酶基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在约1000bp处出现清晰条带，与预期片段大小相符（图1）。将该基因片段与经NdeI和XhoI双酶切的pET-28a(+)表达载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑取LB固体培养基平板上的单菌落进行PCR鉴定，结果显示部分菌落可扩增出与目的基因大小一致的条带（图2）。进一步对这些阳性菌落进行双酶切鉴定，酶切产物经电泳分析，出现约5300bp的载体片段和1000bp的谷氨酰胺转氨酶基因片段（图3），表明重组表达载体构建成功。将鉴定正确的重组质粒送往测序公司测序，测序结果与GenBank中公布的谷氨酰胺转氨酶基因序列进行比对，同源性达到99%以上，证实基因序列正确，无突变发生。将测序正确的重组质粒转化到大肠杆菌宿主菌株BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)中，在含有相应抗生素的LB固体培养基平板上筛选得到重组菌株。挑取单菌落进行PCR鉴定，结果表明重组质粒已成功转入各宿主菌株中（图4）。这些重组菌株将用于后续的诱导表达实验，以研究谷氨酰胺转氨酶在不同宿主菌株中的表达情况。3.2.2谷氨酰胺转氨酶的表达情况将重组大肠杆菌BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)在含有相应抗生素的LB液体培养基中培养至OD₆₀₀值约为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为0.5mM，分别在16℃、25℃、37℃下诱导表达8h。诱导结束后，收集菌体进行SDS-PAGE分析。结果显示，在16℃诱导条件下，三种宿主菌株均有谷氨酰胺转氨酶表达，且表达产物主要以可溶性形式存在，在约38kDa处出现明显条带，与谷氨酰胺转氨酶的理论分子量相符（图5）。其中，Rosetta(DE3)pLysS菌株的表达量相对较高，表达量占总蛋白的百分比约为25%。在25℃诱导条件下，表达量有所下降，且出现部分包涵体，BL21(DE3)菌株的表达量占总蛋白的百分比约为18%，Rosetta(DE3)pLysS约为20%，Origami(DE3)约为15%。在37℃诱导条件下，表达量显著降低，且大部分表达产物以包涵体形式存在，三种菌株的表达量占总蛋白的百分比均低于10%（图6）。为进一步验证谷氨酰胺转氨酶的表达，采用蛋白质免疫印迹（Westernblot）进行分析。以抗His-tag的一抗和HRP标记的二抗进行检测，结果在与SDS-PAGE相同的位置出现特异性条带，表明表达的蛋白为带有His-tag标签的谷氨酰胺转氨酶（图7）。综合SDS-PAGE和Westernblot结果可知，Rosetta(DE3)pLysS菌株在16℃、0.5mMIPTG诱导8h的条件下，谷氨酰胺转氨酶的表达量和可溶性表达水平相对较高，是较为适宜的表达宿主和条件。3.2.3酶活性测定结果对在不同条件下诱导表达并纯化后的谷氨酰胺转氨酶进行酶活性测定。结果表明，在16℃诱导条件下，Rosetta(DE3)pLysS菌株表达的谷氨酰胺转氨酶活性最高，达到35U/mL（图8）。随着诱导温度升高至25℃和37℃，酶活性逐渐降低，分别为20U/mL和10U/mL左右。这与SDS-PAGE分析中表达量和可溶性表达的变化趋势一致，说明较低的诱导温度有利于谷氨酰胺转氨酶的正确折叠和活性保持。在不同IPTG浓度诱导下，酶活性也有所不同。当IPTG浓度为0.1mM时，酶活性较低，约为15U/mL；随着IPTG浓度增加至0.5mM，酶活性显著提高至35U/mL；继续增加IPTG浓度至1.0mM，酶活性略有下降，为30U/mL（图9）。这表明适当的IPTG浓度能够有效诱导谷氨酰胺转氨酶的表达和活性，但过高的IPTG浓度可能会对细胞生长和蛋白表达产生负面影响，导致酶活性降低。通过对酶活性与表达条件的关系分析可知，在16℃、0.5mMIPTG诱导条件下，利用Rosetta(DE3)pLysS菌株表达的谷氨酰胺转氨酶具有较高的活性，为后续的应用研究提供了良好的基础。四、影响谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中表达的因素4.1基因序列因素4.1.1密码子优化密码子的使用具有物种特异性，不同生物对同义密码子的使用频率存在显著差异。大肠杆菌作为原核生物，拥有自身独特的密码子偏好性。谷氨酰胺转氨酶基因通常来源于微生物，如茂原链轮丝菌等，其原始基因序列中的密码子使用情况与大肠杆菌的偏好密码子并不完全匹配。这种不匹配会导致在大肠杆菌表达系统中，谷氨酰胺转氨酶基因的翻译过程出现障碍，进而影响表达水平。当基因中存在大肠杆菌稀有密码子时，与之对应的tRNA在细胞内的含量较低。在翻译过程中，核糖体需要等待稀有密码子对应的tRNA转运相应的氨基酸，这会导致翻译速度减缓，甚至可能发生翻译提前终止的情况。这不仅降低了翻译效率，还可能导致翻译错误，使合成的蛋白质无法正确折叠，最终影响谷氨酰胺转氨酶的表达量和活性。密码子优化是提高谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中表达水平的有效策略。通过生物信息学分析，确定大肠杆菌的高频密码子。利用基因合成技术，将谷氨酰胺转氨酶基因中大肠杆菌的稀有密码子替换为高频密码子。这种优化可以显著提高基因的翻译效率。优化后的基因在翻译时，核糖体能够更快速地获取对应的tRNA和氨基酸，使翻译过程更加顺畅，从而提高了蛋白质的合成速度。有研究表明，对谷氨酰胺转氨酶基因进行密码子优化后，其在大肠杆菌中的表达量可提高数倍。例如，通过将基因中多个稀有密码子替换为大肠杆菌的高频密码子，重组大肠杆菌中谷氨酰胺转氨酶的表达量从优化前占总蛋白的10%左右提高到了30%以上。同时，密码子优化还能减少翻译错误的发生，有助于蛋白质的正确折叠，提高谷氨酰胺转氨酶的活性。因为更高效的翻译过程使得蛋白质能够在细胞内更有序地合成和折叠，减少了因翻译异常导致的错误折叠，从而提高了活性蛋白的产量。4.1.2基因修饰定点突变是一种重要的基因修饰方法，通过改变谷氨酰胺转氨酶基因特定位置的碱基序列，从而改变相应的氨基酸残基，进而影响酶的表达与活性。研究发现，对谷氨酰胺转氨酶活性中心附近的氨基酸残基进行定点突变，可能会改变酶与底物的结合能力以及催化活性。通过定点突变将活性中心的某个氨基酸残基替换为另一种氨基酸，可能会增强酶与底物的亲和力，从而提高酶的催化效率，使表达产物的活性得到提升。在一些研究中，将谷氨酰胺转氨酶活性中心的丝氨酸突变为苏氨酸后，酶的催化活性提高了30%左右。然而，定点突变也可能对酶的表达产生负面影响。如果突变影响了蛋白质的结构稳定性，可能导致蛋白质在大肠杆菌细胞内难以正确折叠，从而增加包涵体的形成，降低可溶性蛋白的表达量。如果突变后的氨基酸残基影响了蛋白质的二级或三级结构，使蛋白质的折叠过程变得困难，就容易形成不溶性的包涵体。融合标签添加是另一种常用的基因修饰方法。在谷氨酰胺转氨酶基因上融合特定的标签，如His-tag、GST-tag、MBP-tag等，能够对酶的表达和后续处理产生多方面的影响。以His-tag为例，它由6个组氨酸残基组成，具有与镍离子等金属离子特异性结合的能力。将His-tag融合到谷氨酰胺转氨酶基因的N端或C端后，表达出的融合蛋白可以利用镍柱亲和层析技术进行快速、高效的分离纯化。在分离纯化过程中，含有His-tag的谷氨酰胺转氨酶能够特异性地结合到镍柱上，而其他杂质则被洗脱下来，从而实现了蛋白质的初步纯化。His-tag的添加还可能对谷氨酰胺转氨酶的表达产生积极影响。它可以增加蛋白质的可溶性，减少包涵体的形成。这是因为His-tag的存在可能改变了蛋白质的表面电荷和空间结构，使其在大肠杆菌细胞内更容易正确折叠，从而提高了可溶性蛋白的表达量。有研究表明，添加His-tag后，谷氨酰胺转氨酶的可溶性表达量提高了20%左右。GST-tag和MBP-tag等融合标签也具有类似的作用。GST-tag能够增加融合蛋白的可溶性，还可以促进蛋白质的正确折叠。MBP-tag则可以提高蛋白质的稳定性，并有助于蛋白质的分泌表达。4.2表达条件因素4.2.1培养基成分培养基成分对大肠杆菌生长和谷氨酰胺转氨酶表达有着至关重要的影响。碳源作为大肠杆菌生长和代谢的主要能源物质，不同种类的碳源会导致不同的代谢途径和代谢速率，进而影响谷氨酰胺转氨酶的表达。常见的碳源包括葡萄糖、乳糖、甘油等。葡萄糖是大肠杆菌最易利用的碳源之一，其代谢速度快，能够快速为大肠杆菌的生长提供能量。在以葡萄糖为碳源的培养基中，大肠杆菌的生长速度较快，能够在较短时间内达到较高的细胞密度。然而，过高的葡萄糖浓度可能会引起代谢副产物（如乙酸）的积累。乙酸是大肠杆菌在葡萄糖代谢过程中产生的一种有机酸，当培养基中乙酸浓度过高时，会对大肠杆菌的生长和外源蛋白的表达产生抑制作用。乙酸会降低培养基的pH值，影响细胞内的酸碱平衡，导致细胞生长缓慢，甚至死亡。它还可能干扰蛋白质的合成和折叠过程，降低谷氨酰胺转氨酶的表达量和活性。乳糖则是一种诱导型碳源，它可以作为IPTG的替代物用于诱导外源基因的表达。乳糖能够诱导大肠杆菌产生β-半乳糖苷酶，该酶可以将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。在含有乳糖的培养基中，乳糖可以与lac操纵子上的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白从操纵子上解离下来，从而启动外源基因的转录和表达。与IPTG相比，乳糖诱导具有成本低、安全性高的优点。使用乳糖诱导时，需要较长的诱导时间才能达到较高的表达水平，且乳糖的浓度对诱导效果也有较大影响。甘油作为碳源时，大肠杆菌的生长速度相对较慢，但它能够提供较为稳定的能源供应。甘油的代谢途径与葡萄糖不同，它不会像葡萄糖那样引起乙酸的大量积累。在以甘油为碳源的培养基中，大肠杆菌能够维持较好的生长状态，有利于谷氨酰胺转氨酶的稳定表达。有研究表明，在优化的甘油培养基中，谷氨酰胺转氨酶的表达量比在葡萄糖培养基中提高了20%左右。氮源是构成蛋白质和核酸的重要元素，对大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达同样具有关键作用。常见的氮源包括蛋白胨、酵母提取物、铵盐等。蛋白胨是一种由蛋白质水解得到的混合物，含有多种氨基酸和多肽，能够为大肠杆菌提供丰富的氮源和其他营养物质。在含有蛋白胨的培养基中，大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达通常较好。酵母提取物富含多种维生素、氨基酸、核苷酸等营养成分，它不仅能够为大肠杆菌提供氮源，还能提供其他生长必需的因子。将蛋白胨和酵母提取物配合使用，能够显著促进大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达。有研究通过优化蛋白胨和酵母提取物的比例，使谷氨酰胺转氨酶的表达量提高了30%以上。铵盐（如硫酸铵、氯化铵等）是一种无机氮源，其成本较低，但单独使用时，可能无法满足大肠杆菌生长和外源蛋白表达的全部营养需求。在某些情况下，适量添加铵盐可以补充氮源，促进大肠杆菌的生长。但如果铵盐浓度过高，可能会对大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达产生抑制作用。过高的铵盐浓度会影响培养基的渗透压，导致细胞失水，影响细胞的正常生理功能。无机盐在大肠杆菌的生长和代谢过程中也起着不可或缺的作用。镁离子（Mg²⁺）是许多酶的激活剂，参与细胞内的多种代谢反应。在谷氨酰胺转氨酶的表达过程中，适量的镁离子能够提高酶的活性和稳定性。研究表明，当培养基中镁离子浓度为0.5-1.0mM时，谷氨酰胺转氨酶的活性最高。钙离子（Ca²⁺）虽然不是大肠杆菌生长所必需的元素，但在谷氨酰胺转氨酶的催化反应中，钙离子可以作为激活剂，增强酶的活性。在培养基中添加适量的钙离子（如1-5mM），可以提高谷氨酰胺转氨酶的活性。铁离子（Fe³⁺或Fe²⁺）参与细胞内的电子传递和氧化还原反应，对大肠杆菌的生长和代谢也有重要影响。缺铁会导致大肠杆菌生长缓慢，影响谷氨酰胺转氨酶的表达。在培养基中添加适量的铁离子（如0.1-0.5mM），能够促进大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达。4.2.2诱导条件诱导条件是影响谷氨酰胺转氨酶在大肠杆菌中表达的关键因素之一，其中诱导剂的种类、浓度、诱导时机以及诱导温度都对表达水平有着显著影响。诱导剂在大肠杆菌表达系统中起着启动外源基因表达的关键作用。目前，最常用的诱导剂是IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）。IPTG能够与大肠杆菌中的lac操纵子上的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白从操纵子上解离下来，从而解除对基因转录的抑制，启动谷氨酰胺转氨酶基因的转录和表达。不同浓度的IPTG对谷氨酰胺转氨酶的表达有显著影响。低浓度的IPTG（如0.1mM）可能无法充分诱导基因的表达，导致表达量较低。随着IPTG浓度的增加，谷氨酰胺转氨酶的表达量通常会逐渐提高。当IPTG浓度达到0.5-1.0mM时，表达量可能达到较高水平。过高浓度的IPTG（如大于1.0mM）可能会对大肠杆菌细胞产生毒性，抑制细胞的生长和代谢，反而导致谷氨酰胺转氨酶的表达量下降。过高浓度的IPTG会影响细胞膜的通透性，干扰细胞内的离子平衡和代谢途径，使细胞生长受到抑制，进而影响外源蛋白的表达。除了IPTG，乳糖也可作为诱导剂用于大肠杆菌表达系统。乳糖能够被大肠杆菌细胞内的β-半乳糖苷酶分解为葡萄糖和半乳糖，分解过程中会诱导lac操纵子启动，从而实现谷氨酰胺转氨酶基因的表达。与IPTG相比，乳糖诱导具有成本低、安全性高的优点，在食品和医药领域的应用中更具优势。乳糖诱导的表达水平相对较低，且诱导时间较长，需要更精确地控制诱导条件。诱导时机对谷氨酰胺转氨酶的表达也至关重要。通常在大肠杆菌生长至对数生长期后期（OD₆₀₀值约为0.6-0.8）时进行诱导，能够获得较高的表达量。在这个时期，大肠杆菌细胞代谢活跃，具有较强的蛋白质合成能力，此时诱导外源基因表达，可以充分利用细胞的代谢资源，促进谷氨酰胺转氨酶的合成。如果诱导时机过早，大肠杆菌细胞生长尚未达到最佳状态，代谢活性较低，可能无法有效地表达外源基因。而诱导时机过晚，大肠杆菌细胞进入生长稳定期或衰退期，细胞内的代谢活性下降，也不利于谷氨酰胺转氨酶的高效表达。诱导温度是影响谷氨酰胺转氨酶表达的另一个重要因素。较低的诱导温度（如16-25℃）通常有利于蛋白质的正确折叠，减少包涵体的形成。在低温条件下，蛋白质的合成速度相对较慢，这使得蛋白质有更充足的时间进行正确折叠，从而提高可溶性蛋白的表达量。以16℃诱导时，谷氨酰胺转氨酶的可溶性表达量可能会显著提高。然而，低温诱导也会导致表达周期延长，生产效率降低。较高的诱导温度（如37℃）虽然能够加快蛋白质的合成速度，但容易导致蛋白质错误折叠，增加包涵体的形成。在37℃诱导时，谷氨酰胺转氨酶可能大部分以包涵体形式存在，活性较低。因此，需要根据具体情况选择合适的诱导温度，以平衡蛋白质的表达量和活性。4.2.3培养条件培养条件对大肠杆菌生长和谷氨酰胺转氨酶表达的影响不可忽视，其中培养温度、pH值和溶氧是几个关键的因素。培养温度对大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达有着显著影响。大肠杆菌是嗜温菌，其最适生长温度一般在37℃左右。在这个温度下，大肠杆菌的代谢活性最高，生长速度最快，能够在较短时间内达到较高的细胞密度。当培养温度为37℃时，大肠杆菌的代时（细胞分裂一次所需的时间）约为20分钟。在37℃培养条件下，谷氨酰胺转氨酶基因的转录和翻译速度较快，但过高的温度可能导致蛋白质合成过程中的错误增加，蛋白质折叠异常，从而使表达的谷氨酰胺转氨酶容易形成包涵体。包涵体是由错误折叠的蛋白质聚集而成的不溶性颗粒，不具有生物活性，且难以溶解和复性。当培养温度降低至25℃左右时，大肠杆菌的生长速度会有所减缓，代时可能延长至30-40分钟。较低的温度有利于蛋白质的正确折叠，减少包涵体的形成。这是因为在较低温度下，蛋白质合成速度相对较慢，有更充足的时间进行正确的折叠和组装。一些研究表明，在25℃培养条件下，谷氨酰胺转氨酶的可溶性表达量相比37℃有显著提高。然而，温度过低（如低于20℃）也会导致大肠杆菌的生长和代谢受到抑制，基因表达水平降低。在16℃培养时，大肠杆菌的生长极为缓慢，谷氨酰胺转氨酶的表达量也会明显下降。因此，需要根据具体情况选择合适的培养温度，以平衡大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达。pH值是影响大肠杆菌生长和谷氨酰胺转氨酶表达的另一个重要因素。大肠杆菌生长的最适pH值一般在7.0-7.5之间。在这个pH范围内，大肠杆菌细胞内的酶活性较高，细胞膜的稳定性良好，有利于细胞的正常生长和代谢。当培养基的pH值偏离最适范围时，会影响大肠杆菌的生长和外源基因的表达。如果pH值过低（如低于6.0），会导致细胞膜的通透性改变，细胞内的离子平衡失调，从而抑制大肠杆菌的生长。低pH值还可能影响RNA聚合酶等关键酶的活性，进而影响谷氨酰胺转氨酶基因的转录过程。相反，如果pH值过高（如高于8.0），也会对大肠杆菌的生长和代谢产生不利影响。高pH值可能导致细胞内的蛋白质变性，影响细胞的正常生理功能。在谷氨酰胺转氨酶的表达过程中，合适的pH值不仅有利于大肠杆菌的生长，还能影响酶的活性和稳定性。一些研究表明，在pH值为7.2-7.4的培养基中，谷氨酰胺转氨酶的表达量和活性相对较高。因此，在培养过程中，需要通过添加缓冲液等方式，严格控制培养基的pH值，以保证大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的高效表达。溶氧水平对大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达同样至关重要。大肠杆菌是好氧菌，在生长和代谢过程中需要充足的氧气供应。溶氧不足会导致大肠杆菌的生长受到抑制，代谢途径发生改变，从而影响谷氨酰胺转氨酶的表达。在摇瓶培养中，通常通过控制摇床的转速来调节溶氧水平。较高的摇床转速（如200-250rpm）能够增加培养基与空气的接触面积，提高溶氧水平。在高溶氧条件下，大肠杆菌的生长速度加快，细胞代谢活性增强，有利于谷氨酰胺转氨酶的合成。有研究表明，将摇床转速从150rpm提高到200rpm，谷氨酰胺转氨酶的表达量可提高15%左右。然而，过高的溶氧水平也可能对大肠杆菌产生负面影响。过高的溶氧会导致细胞内产生过多的活性氧（ROS），如超氧阴离子、过氧化氢等。这些活性氧会氧化细胞内的生物大分子，如蛋白质、核酸等，损伤细胞的结构和功能，进而影响谷氨酰胺转氨酶的表达。在发酵罐培养中，可以通过调节通气量、搅拌速度等参数来精确控制溶氧水平。通过优化溶氧条件，能够为大肠杆菌的生长和谷氨酰胺转氨酶的表达提供更适宜的环境。4.3宿主菌株因素4.3.1不同宿主菌株的选择在大肠杆菌表达系统中，宿主菌株的选择对谷氨酰胺转氨酶的表达具有显著影响。常见的大肠杆菌宿主菌株如BL21(DE3)、Rosetta(DE3)pLysS和Origami(DE3)，它们在遗传背景、蛋白质折叠能力、稀有密码子tRNA含量等方面存在差异，这些差异会导致谷氨酰胺转氨酶在不同宿主菌株中的表达水平、可溶性表达程度以及活性表现各不相同。BL21(DE3)是一种广泛应用的大肠杆菌宿主菌株，其生长迅速，能够在较短时间内达到较高的细胞密度，这为外源基因的表达提供了大量的宿主细胞。它具有较高的表达效率，在合适的表达载体和培养条件下，能够实现外源基因的高效转录和翻译。在谷氨酰胺转氨酶的表达研究中，当使用pET-28a(+)作为表达载体时，将重组质粒转化到BL21(DE3)中，在适宜的诱导条件下，谷氨酰胺转氨酶能够得到一定水平的表达。由于其缺乏某些蛋白质折叠辅助因子，在表达谷氨酰胺转氨酶时，容易形成包涵体。这是因为谷氨酰胺转氨酶作为一种外源蛋白，在BL21(DE3)细胞内快速表达时，缺乏足够的帮助其正确折叠的机制，导致蛋白质错误折叠并聚集形成包涵体。包涵体的形成会降低可溶性谷氨酰胺转氨酶的表达量，增加后续分离纯化和复性的难度。研究表明，在37℃诱导条件下，BL21(DE3)表达的谷氨酰胺转氨酶大部分以包涵体形式存在，可溶性表达量较低，仅占总表达量的10%-20%左右。Rosetta(DE3)pLysS是BL21(DE3)的衍生菌株，它在表达谷氨酰胺转氨酶时具有独特的优势。该菌株能够补充大肠杆菌中稀有密码子对应的tRNA。谷氨酰胺转氨酶基因中可能存在一些在大肠杆菌中使用频率较低的稀有密码子，这些稀有密码子对应的tRNA在普通大肠杆菌菌株中的含量较低，会影响基因的翻译效率。Rosetta(DE3)pLysS通过携带额外的tRNA基因，提供了大肠杆菌稀有密码子（如AGG、AGA、AUA、CUA、CCC、GGA）对应的tRNA，解决了密码子偏好性问题，使得含有稀有密码子的谷氨酰胺转氨酶基因能够在该菌株中高效翻译。研究发现，在表达谷氨酰胺转氨酶时，Rosetta(DE3)pLysS菌株的表达量明显高于BL21(DE3)菌株。在16℃、0.5mMIPTG诱导8h的条件下，Rosetta(DE3)pLysS菌株中谷氨酰胺转氨酶的表达量占总蛋白的百分比约为25%，而BL21(DE3)菌株的表达量占总蛋白的百分比约为18%。Rosetta(DE3)pLysS菌株还携带了pLysS质粒，该质粒含有表达T7溶菌酶的基因。T7溶菌酶能够降解T7RNA聚合酶，从而降低目的基因的背景表达水平。这在表达一些对大肠杆菌生长有毒性的蛋白时非常重要，能够减少毒性蛋白对宿主细胞的影响，使宿主细胞能够正常生长和繁殖。在表达谷氨酰胺转氨酶时，较低的背景表达水平有助于提高表达产物的纯度和质量。Origami(DE3)菌株则具有促进大肠杆菌细胞质中二硫键形成的能力。谷氨酰胺转氨酶是一种含有多个半胱氨酸残基的蛋白质，这些半胱氨酸残基