微生物检验技术规程

微生物检验技术规程**一、概述**

微生物检验技术规程是确保微生物检测准确性和可靠性的标准化操作指南。本规程适用于食品、药品、环境、生物制品等领域的微生物检测，旨在规范采样、处理、培养、鉴定等关键环节，统一操作标准，减少人为误差。本规程涵盖样品采集、前处理、培养基制备、接种培养、结果判读等核心内容，并结合实际操作步骤进行详细说明。

**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.选择代表性样品：根据检测目的，从不同批次或区域随机抽取样品，确保样品具有代表性。

2.包装要求：使用无菌采样袋或容器，避免样品污染。食品类样品需使用一次性采样工具（如无菌棉签、剪刀等）。

3.标记信息：样品需标注来源、采集时间、检测项目等，并立即冷藏保存（温度2-8℃）。

（二）样品前处理

1.外观检查：剔除霉变、变质等不合格样品，记录异常现象。

2.粉碎处理：固体样品需均匀粉碎，液体样品需充分混匀。

3.无菌稀释：使用无菌生理盐水或缓冲液进行系列稀释（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³等梯度）。

**三、培养基制备与灭菌**

（一）培养基种类

1.增菌培养基：用于初步富集目标微生物（如TSA、RBCA）。

2.鉴定培养基：用于特定微生物的分离和鉴定（如MAC、SS琼脂）。

3.选择性培养基：加入抑制剂（如MAC中的万古霉素）以筛选特定菌种。

（二）灭菌操作

1.称量：精确称量培养基粉末（如TSA培养基约38g/L）。

2.溶解：加入适量蒸馏水，加热搅拌至完全溶解。

3.分装：将培养基分装至无菌培养皿或试管中，表面覆盖封口膜。

4.灭菌：采用高压蒸汽灭菌（121℃，15分钟），灭菌后置于超净工作台冷却。

**四、接种与培养**

（一）接种方法

1.平板划线法：用于分离纯培养，采用四区划线法（如麦氏划线）。

2.液体接种法：取适量稀释液加入增菌液，混匀后静置30分钟。

3.倾注法：将菌液倒入熔化后的琼脂培养基中，轻轻摇匀。

（二）培养条件

1.温度：常用培养温度为35-37℃，厌氧菌需37℃、厌氧环境。

2.时间：需氧菌培养24-48小时，厌氧菌培养48-72小时。

3.环境要求：需氧培养需放入孵育箱，厌氧培养需使用厌氧袋或手套箱。

**五、结果判读与记录**

（一）形态观察

1.菌落特征：记录菌落大小、颜色、形态（如圆形、丝状）。

2.显微镜检查：革兰染色后观察菌体形态（如球菌、杆菌）。

（二）生化鉴定

1.初步测试：如氧化酶试验、糖发酵试验（如葡萄糖、乳糖）。

2.仪器分析：采用API系统或VITEK-2进行自动鉴定。

（三）数据记录

1.详细记录检测步骤、培养基成分、培养时间等。

2.保存菌种：纯培养物需冷藏保存（如-80℃甘油管）。

**六、质量控制**

（一）阳性对照

每次检测需加入已知阳性对照菌株（如大肠杆菌），确保培养基和操作有效性。

（二）阴性对照

使用无菌生理盐水作为阴性对照，检测是否存在污染。

（三）重复性验证

关键步骤（如稀释、接种）需重复2次，确保结果一致性。

**七、注意事项**

1.操作全程需佩戴无菌手套，避免污染。

2.培养基配制需使用无菌蒸馏水，避免使用tapwater。

3.实验结束后需彻底消毒，废弃物按生物危害物处理。

**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.**选择代表性样品**：

-食品类样品（如肉类、乳制品）：采用五点取样法，从包装表面的中心、四角及边缘各取少量样品，混合后分装。

-环境类样品（如空气、水体）：使用无菌采样器（如撞击式采样器）或滤膜法，确保采样量符合标准（如空气样品≥10L）。

-药品类样品（如片剂、胶囊）：随机抽取10-20份，取其内容物或表面碎屑进行检测。

-样品数量：食品类至少50g，环境类至少100mL，药品类至少20粒。

2.**包装要求**：

-采样袋需使用双层聚乙烯袋，表面消毒（如75%酒精擦拭）后采样。

-采样工具需一次性使用，避免交叉污染（如使用无菌镊子）。

-样品封存：立即用封条密封采样袋，标注“已采样”字样。

3.**标记信息**：

-样品标签需包含：来源（如批次号、生产日期）、采集地点、采集人、采集时间。

-使用防水墨水记录，避免信息模糊。

-冷藏保存：需氧样品置于2-8℃冰箱，厌氧样品使用专用保存液（如碳酸氢钠缓冲液）。

（二）样品前处理

1.**外观检查**：

-检查样品是否霉变、结块或变色，记录异常现象并拍照存档。

-异常样品需单独处理，不得混入合格样品。

2.**粉碎处理**：

-固体样品：使用无菌研磨机进行粉碎（如骨肉类需先去骨），确保样品均匀。

-液体样品：使用涡旋振荡器混匀（如乳制品需振荡5分钟）。

3.**无菌稀释**：

-使用无菌移液器吸取1g/1mL样品，加入9mL无菌生理盐水（如PBS缓冲液），混匀。

-系列稀释：逐级稀释至10⁻⁷，每梯度取0.1mL进行平板接种。

-记录稀释倍数，计算菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）。

**三、培养基制备与灭菌**

（一）培养基种类

1.**增菌培养基**：

-TSB（胰酪大豆胨）：用于快速富集细菌（如肉汤量1:5，培养时间6-8小时）。

-RBCA（碱性蛋白胨水）：用于检测水中大肠菌群（需加入伊红美蓝指示剂）。

2.**鉴定培养基**：

-MAC（麦康凯琼脂）：用于志贺氏菌属分离（含胆盐、柠檬酸盐、中性红）。

-SS琼脂：用于沙门氏菌属分离（含柠檬酸钠、伊红美蓝）。

3.**选择性培养基**：

-CHROMagar™（显色培养基）：用于快速区分肠杆菌科（如蓝色为克雷伯氏菌）。

-品红亚硫酸钠琼脂（PSA）：用于魏斯氏菌属分离。

（二）灭菌操作

1.**称量**：

-精确称量培养基粉末（如TSA约38g/L，使用电子天平精确至0.1g）。

-记录批号，检查粉末外观是否均匀。

2.**溶解**：

-加入适量蒸馏水（如TSA需800mL），加热搅拌至完全溶解（如60℃水浴10分钟）。

-检查有无不溶物，必要时过滤除杂。

3.**分装**：

-培养皿：每皿倒入15-20mL培养基，冷却后倒置。

-试管：分装至容量管（如100mL试管），表面覆盖封口膜。

4.**灭菌**：

-高压蒸汽灭菌：121℃，15分钟（液体）；121℃，15分钟（固体）。

-预热：灭菌前将培养基置于37℃孵育箱30分钟，确保无冷点。

-冷却：灭菌后自然冷却至45℃，避免剧烈晃动。

**四、接种与培养**

（一）接种方法

1.**平板划线法**：

-麦氏划线：使用接种环，分区划线（如三区划线，每区间隔80℃灼烧灭菌）。

-分区要求：第一区密集划线，后续区域逐渐稀疏，最终获得单菌落。

2.**液体接种法**：

-取0.1mL稀释液，加入9mL增菌液，混匀后静置30分钟（选择性增菌）。

-记录菌液浊度（如麦氏浊度0.5标准）。

3.**倾注法**：

-将菌液倒入50mL熔化琼脂（45℃），轻摇培养皿混匀。

-冷却后倒置，避免气泡产生。

（二）培养条件

1.**温度**：

-常温培养：25-28℃（真菌），35-37℃（细菌）。

-特殊菌株：如结核分枝杆菌需37℃、5%CO₂培养。

2.**时间**：

-细菌：24-48小时（需氧），48-72小时（厌氧）。

-真菌：3-5天（观察产孢）。

3.**环境要求**：

-需氧培养：放入37℃孵育箱，湿度控制在50%-60%。

-厌氧培养：使用厌氧袋（如GasPak™系统）或手套箱，培养时间延长24小时。

**五、结果判读与记录**

（一）形态观察

1.**菌落特征**：

-大小：直径1-3mm（典型）。

-颜色：黄色（金黄色葡萄球菌），透明（铜绿假单胞菌）。

-形态：圆形（葡萄球菌），丝状（霉菌）。

2.**显微镜检查**：

-革兰染色：革兰阳性（紫色），阴性（红色）。

-特征：芽孢（梭状芽孢杆菌），荚膜（肺炎链球菌）。

（二）生化鉴定

1.**初步测试**：

-氧化酶试验：使用氧化酶试纸，阳性变蓝（如假单胞菌属）。

-糖发酵：检测葡萄糖、乳糖（如大肠杆菌阳性）。

2.**仪器分析**：

-API系统：使用革兰阴性菌鉴定条（如API20E）。

-VITEK-2：上机前需用菌悬液调零浊度（NAC标准）。

（三）数据记录

1.**详细记录**：

-培养基名称、菌株编号、接种量、培养时间。

-每个梯度平板的菌落数（CFU/g）。

2.**菌种保存**：

-短期保存：斜面培养基，4℃冰箱（如1周）。

-长期保存：甘油管（如-80℃冻存，可用1-2年）。

**六、质量控制**

（一）阳性对照

-每次检测需加入已知阳性菌株（如大肠杆菌ATCC25922），确保检测链有效性。

-记录阳性对照菌落数（如≥30CFU/皿）。

（二）阴性对照

-使用无菌生理盐水作为阴性对照，检测是否存在污染。

-阴性对照无生长即为合格。

（三）重复性验证

-关键步骤（如稀释、接种）需重复2次，计算变异系数（CV<5%）。

-如结果不符，需重新检测。

**七、注意事项**

1.**操作全程需佩戴无菌手套**：

-每次采样后更换手套，避免交叉污染。

-手套破损需立即更换。

2.**培养基配制需使用无菌蒸馏水**：

-避免使用tapwater，可能导致污染。

-蒸馏水需灭菌（如15分钟紫外线照射）。

3.**实验结束后需彻底消毒**：

-培养皿需高压灭菌（121℃，15分钟）。

-废弃物按生物危害物处理（如高压灭菌后焚烧）。

**一、概述**

微生物检验技术规程是确保微生物检测准确性和可靠性的标准化操作指南。本规程适用于食品、药品、环境、生物制品等领域的微生物检测，旨在规范采样、处理、培养、鉴定等关键环节，统一操作标准，减少人为误差。本规程涵盖样品采集、前处理、培养基制备、接种培养、结果判读等核心内容，并结合实际操作步骤进行详细说明。

**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.选择代表性样品：根据检测目的，从不同批次或区域随机抽取样品，确保样品具有代表性。

2.包装要求：使用无菌采样袋或容器，避免样品污染。食品类样品需使用一次性采样工具（如无菌棉签、剪刀等）。

3.标记信息：样品需标注来源、采集时间、检测项目等，并立即冷藏保存（温度2-8℃）。

（二）样品前处理

1.外观检查：剔除霉变、变质等不合格样品，记录异常现象。

2.粉碎处理：固体样品需均匀粉碎，液体样品需充分混匀。

3.无菌稀释：使用无菌生理盐水或缓冲液进行系列稀释（如10⁻¹、10⁻²、10⁻³等梯度）。

**三、培养基制备与灭菌**

（一）培养基种类

1.增菌培养基：用于初步富集目标微生物（如TSA、RBCA）。

2.鉴定培养基：用于特定微生物的分离和鉴定（如MAC、SS琼脂）。

3.选择性培养基：加入抑制剂（如MAC中的万古霉素）以筛选特定菌种。

（二）灭菌操作

1.称量：精确称量培养基粉末（如TSA培养基约38g/L）。

2.溶解：加入适量蒸馏水，加热搅拌至完全溶解。

3.分装：将培养基分装至无菌培养皿或试管中，表面覆盖封口膜。

4.灭菌：采用高压蒸汽灭菌（121℃，15分钟），灭菌后置于超净工作台冷却。

**四、接种与培养**

（一）接种方法

1.平板划线法：用于分离纯培养，采用四区划线法（如麦氏划线）。

2.液体接种法：取适量稀释液加入增菌液，混匀后静置30分钟。

3.倾注法：将菌液倒入熔化后的琼脂培养基中，轻轻摇匀。

（二）培养条件

1.温度：常用培养温度为35-37℃，厌氧菌需37℃、厌氧环境。

2.时间：需氧菌培养24-48小时，厌氧菌培养48-72小时。

3.环境要求：需氧培养需放入孵育箱，厌氧培养需使用厌氧袋或手套箱。

**五、结果判读与记录**

（一）形态观察

1.菌落特征：记录菌落大小、颜色、形态（如圆形、丝状）。

2.显微镜检查：革兰染色后观察菌体形态（如球菌、杆菌）。

（二）生化鉴定

1.初步测试：如氧化酶试验、糖发酵试验（如葡萄糖、乳糖）。

2.仪器分析：采用API系统或VITEK-2进行自动鉴定。

（三）数据记录

1.详细记录检测步骤、培养基成分、培养时间等。

2.保存菌种：纯培养物需冷藏保存（如-80℃甘油管）。

**六、质量控制**

（一）阳性对照

每次检测需加入已知阳性对照菌株（如大肠杆菌），确保培养基和操作有效性。

（二）阴性对照

使用无菌生理盐水作为阴性对照，检测是否存在污染。

（三）重复性验证

关键步骤（如稀释、接种）需重复2次，确保结果一致性。

**七、注意事项**

1.操作全程需佩戴无菌手套，避免污染。

2.培养基配制需使用无菌蒸馏水，避免使用tapwater。

3.实验结束后需彻底消毒，废弃物按生物危害物处理。

**二、样品采集与处理**

（一）样品采集

1.**选择代表性样品**：

-食品类样品（如肉类、乳制品）：采用五点取样法，从包装表面的中心、四角及边缘各取少量样品，混合后分装。

-环境类样品（如空气、水体）：使用无菌采样器（如撞击式采样器）或滤膜法，确保采样量符合标准（如空气样品≥10L）。

-药品类样品（如片剂、胶囊）：随机抽取10-20份，取其内容物或表面碎屑进行检测。

-样品数量：食品类至少50g，环境类至少100mL，药品类至少20粒。

2.**包装要求**：

-采样袋需使用双层聚乙烯袋，表面消毒（如75%酒精擦拭）后采样。

-采样工具需一次性使用，避免交叉污染（如使用无菌镊子）。

-样品封存：立即用封条密封采样袋，标注“已采样”字样。

3.**标记信息**：

-样品标签需包含：来源（如批次号、生产日期）、采集地点、采集人、采集时间。

-使用防水墨水记录，避免信息模糊。

-冷藏保存：需氧样品置于2-8℃冰箱，厌氧样品使用专用保存液（如碳酸氢钠缓冲液）。

（二）样品前处理

1.**外观检查**：

-检查样品是否霉变、结块或变色，记录异常现象并拍照存档。

-异常样品需单独处理，不得混入合格样品。

2.**粉碎处理**：

-固体样品：使用无菌研磨机进行粉碎（如骨肉类需先去骨），确保样品均匀。

-液体样品：使用涡旋振荡器混匀（如乳制品需振荡5分钟）。

3.**无菌稀释**：

-使用无菌移液器吸取1g/1mL样品，加入9mL无菌生理盐水（如PBS缓冲液），混匀。

-系列稀释：逐级稀释至10⁻⁷，每梯度取0.1mL进行平板接种。

-记录稀释倍数，计算菌落形成单位（CFU/g或CFU/mL）。

**三、培养基制备与灭菌**

（一）培养基种类

1.**增菌培养基**：

-TSB（胰酪大豆胨）：用于快速富集细菌（如肉汤量1:5，培养时间6-8小时）。

-RBCA（碱性蛋白胨水）：用于检测水中大肠菌群（需加入伊红美蓝指示剂）。

2.**鉴定培养基**：

-MAC（麦康凯琼脂）：用于志贺氏菌属分离（含胆盐、柠檬酸盐、中性红）。

-SS琼脂：用于沙门氏菌属分离（含柠檬酸钠、伊红美蓝）。

3.**选择性培养基**：

-CHROMagar™（显色培养基）：用于快速区分肠杆菌科（如蓝色为克雷伯氏菌）。

-品红亚硫酸钠琼脂（PSA）：用于魏斯氏菌属分离。

（二）灭菌操作

1.**称量**：

-精确称量培养基粉末（如TSA约38g/L，使用电子天平精确至0.1g）。

-记录批号，检查粉末外观是否均匀。

2.**溶解**：

-加入适量蒸馏水（如TSA需800mL），加热搅拌至完全溶解（如60℃水浴10分钟）。

-检查有无不溶物，必要时过滤除杂。

3.**分装**：

-培养皿：每皿倒入15-20mL培养基，冷却后倒置。

-试管：分装至容量管（如100mL试管），表面覆盖封口膜。

4.**灭菌**：

-高压蒸汽灭菌：121℃，15分钟（液体）；121℃，15分钟（固体）。

-预热：灭菌前将培养基置于37℃孵育箱30分钟，确保无冷点。

-冷却：灭菌后自然冷却至45℃，避免剧烈晃动。

**四、接种与培养**

（一）接种方法

1.**平板划线法**：

-麦氏划线：使用接种环，分区划线（如三区划线，每区间隔80℃灼烧灭菌）。

-分区要求：第一区密集划线，后续区域逐渐稀疏，最终获得单菌落。

2.**液体接种法**：

-取0.1mL稀释液，加入9mL增菌液，混匀后静置30分钟（选择性增菌）。

-记录菌液浊度（如麦氏浊度0.5标准）。

3.**倾注法**：

-将菌液倒入50mL熔化琼脂（45℃），轻摇培养皿混匀。

-冷却后倒置，避免气泡产生。

（二）培养条件

1.**温度**：

-常温培养：25-28℃（真菌），35-37℃（细菌）。

-特殊菌株：如结核分枝杆菌需37℃、5%CO₂培养。

2.**时间**：

-细菌：24-48小时（需氧），48-72小时（厌氧）。

-真菌：3-5天（观察产孢）。

3.**环境要求**：

-需氧培养：放入37℃孵育箱，湿度控制在50%-60%。

-厌氧培养：使用厌氧袋（如GasPak™系统）或手套箱，培养时间延长24小时。

**五、结果判读与记录**

（一）形态观察

1.**菌落特征**：

-大