T-CIQA 113-2025 L-苹果酸 （发酵法）

ICS67.220.20CCSX60T/CIQA113-2025L-苹果酸（发酵法）本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国出入境检验检疫协会进出口食品标准化技术委员会（CIQA/TC10）提出并归口。。本文件起草单位：南京师范大学、天津科技大学、昊禾生物科技（常州）有限公司。本文件主要起草人：徐晴、薛锋、刘浩本文件知识产权归中国出入境检验检疫协会所有。任何单位或个人未经许可，不得以营利为目的，印制、出版、翻译、转发或复制全文或部分文字。1T/CIQA113-2025L-苹果酸（发酵法）本文件给出了L-苹果酸化学名称、分子式、结构式和相对分子质量，规定了发酵法L-苹果酸的技术要求、检验方法等。本文件适用于利用以糖质原料、微生物一步发酵法生产的L-苹果酸。2规范性引用文件GB1886.40-2015食品安全国家标准食品添加剂L-苹果酸GB5009.3-2016食品安全国家标准食品中水分的测定GB5009.12-2023食品安全国家标准食品中铅的测定GB5009.74-2014食品安全国家标准食品添加剂中重金属限量试验法GB5009.75-2014食品安全国家标准食品添加剂中铅的测定GB5009.76-2014食品安全国家标准食品添加剂中砷的测定方法GB/T601-2016化学试剂标准滴定溶液的制备GB/T602-2002化学试剂杂质测定用标准溶液的制备GB/T603-2023化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备GB/T613-2007化学试剂比旋光本领（比旋光度）测定通用方法GB/T6040-2019GB/T6682-2008GB/T9741-2008GB/T9729-2007红外光谱分析方法通则分析实验室用水规格和试验方法化学试剂灼烧残渣测定通用方法化学试剂氯化物测定通用方法ASTMD6866-20StandardTestMethodsforDeterminingtheBiobasedContentofSolid,Liquid,andGaseousSamplesUsingRadiocarbonAnalysis3化学名称、分子式、结构式和相对分子质量3.1化学名称L-羟基丁二酸3.2分子式C4H6O53.3结构式3.4相对分子质量134.09（按2022年国际相对原子质量）2T/CIQA113-20254技术要求4.1感官要求感官要求应符合表1的规定。表1感官要求4.2理化指标理化指标应符合表2的规定。表2理化指标L-苹果酸(C4H6O5)含量(w)/%≥水分，w/%-1.6～-2.6灼烧残渣(w)/%富马酸(w)/%丁二酸(w)/%马来酸(w)/%重金属(以Pb计)/(mg/kg)砷(以As计)/(mg/kg)22T/CIQA113-20253规范性检验方法试验方法规定的一些试验过程可能导致危险情况。操作者应采取适当的安全和保护措施。A.2一般规定本标准所用试剂和水在没有注明其他要求时，均指分析纯试剂和GB/T6682-2008规定的三级水。检验中所用标准滴定溶液、杂质测定用标准溶液、制剂及制品，在没有注明其他要求时，均按GB/T601-2016、GB/T602-2002和GB/T603-2023的规定制备。试验中所用溶液在未注明用何种溶剂配制时，均指水溶液。A.3鉴别试验A.3.1试剂和材料A.3.1.1氨水溶液：2体积氨水与3体积纯水混溶。A.3.1.2对氨基苯磺酸溶液：10g/L。A.3.1.3亚硝酸钠溶液：200g/L。A.3.1.4氢氧化钠溶液：40g/L。A.3.2仪器和设备A.3.2.1红外光谱仪A.3.2.2水浴锅A.3.2.3旋光测定仪A.3.3鉴别方法A.3.3.1苹果酸氨盐呈色试验称取0.5g试样，精确至0.01g，置于50mL试管中，加入10mL水溶解。用氨水溶液中和至中性，加入1mL对氨基苯磺酸溶液，在沸水浴中加热5min。加入5mL亚硝酸钠溶液，再置于水浴加热3min后，加入5mL氢氧化钠溶液，试验溶液应立即呈红色。A.3.3.2旋光特性试验试验方法同A.5，试样水溶液应呈左旋特性。A.4L-苹果酸(C4H6O5)、丁二酸、富马酸、马来酸含量的测定A.4.1原理用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过色谱柱使试样溶液中各组分分离，用紫外吸收检测器检测，用外标法定量，计算试样中L-苹果酸、丁二酸、富马酸、马来酸的含量。A.4.2试剂和材料A.4.2.1氢氧化钠溶液：20g/L4T/CIQA113-2025A.4.2.20.1%磷酸-甲醇：量取1mL±0.02mL磷酸（优级纯试剂）于1000mL容量瓶中，加入100mL甲醇（HPLC级试剂可根据柱效调整加入量加水稀释至刻度，再经0.45μm滤膜过滤。A.4.2.3L-苹果酸标准品：纯度≥99.0%；A.4.2.4丁二酸标准品：纯度≥99.0%；A.4.2.5富马酸标准品：纯度≥99.0%；A.4.2.6马来酸标准品：纯度≥99.0%；A.4.3仪器和设备A.4.3.1高效液相色谱仪，配紫外检测器。A.4.3.2分析天平：感量0.1mg。A.4.3.3离心机。A.4.4参考色谱条件推荐的色谱柱及典型操作条件见表A.1，富马酸和马来酸含量测定典型高效液相色谱图参见附录B图B.1，各组分的相对保留时间（见附录表B1，L-苹果酸：3.9min，马来酸：4.2min，丁二酸：5.6min，富马酸：6.4min）。其他能达到同等分离程度的色谱柱和色谱操作条件均可使用。表A.1色谱柱和典型色谱操作条件40℃,控制精度±1℃流动速度/(mL/min)A.4.5分析步骤A.4.5.1标准溶液的制备A.4.5.1.1L-苹果酸标准溶液的制备L-苹果酸标准中间液配制：称取500mgL-苹果酸标准品，精确至0.1mg，溶于适量水（必要时加入少量氢氧化钠溶液转移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀释至刻度，临用前配置。标准系列工作液的配制：分别吸取L-苹果酸标准中间液0.5mL，1.0mL，2.5mL，5mL，10.0mL于20mL容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，得到标准系列工作液的溶液分别为：5.0mg/mL，2.5mg/mL，1.25mg/mL,0.5mg/mL，0.25mg/mL，经0.45μm滤膜过滤后进样，临用前配置。A.4.5.1.2富马酸标准溶液的制备富马酸标准中间液配制：称取50mg富马酸标准品，精确至0.1mg，溶于适量水（必要时加入少量氢氧化钠溶液转移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀释至刻度。标准系列工作液的配制：分别吸取富马酸标准中间液0.5mL，1mL，2.5mL，5mL，10.0mL于100T/CIQA113-2025mL容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，得到标准系列工作液的溶液分别为：0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL,0.01mg/mL，0.005mg/mL，经0.45μm滤膜过滤后进样，临用前配置。A.4.5.1.3丁二酸标准溶液的制备丁二酸标准中间液配制：称取50mg丁二酸标准品，精确至0.1mg，溶于适量水（必要时加入少量氢氧化钠溶液转移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀释至刻度。标准系列工作液的配制：分别吸取丁二酸标准中间液0.2ml,0.5ml,1.0mL，2.5mL，5mL于10毫升容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，得到标准系列工作液的溶液分别为：0.02mg/mL,0.05mg/mL，0.1mg/mL，0.25mg/mL,0.5mg/mL，经0.45μm滤膜过滤后进样，临用前配置。A.4.5.1.4马来酸标准溶液的制备马来酸标准中间液配制：称取50mg马来酸标准品，精确至0.1mg，溶于适量水（必要时加入少量氢氧化钠溶液转移至50mL容量瓶，用磷酸溶液稀释至刻度。标准系列工作液的配制：分别吸取马来酸标准中间液0.5mL，1mL，2.5mL，5mL，10.0mL于100毫升容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，得到标准系列工作液的溶液分别为：0.1mg/mL，0.05mg/mL，0.025mg/mL,0.01mg/mL，0.005mg/mL，经0.45μm滤膜过滤后进样，临用前配置。A.4.5.2试样溶液的制备称取0.2g试样，精确至0.0002g，置于50mL容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，再经超声波脱气处理。A.4.5.3标准曲线绘制在A.4.4参考色谱条件下，分别将L-苹果酸等标准系列工作液注入高效液相色谱仪，进行色谱分析，测定相应的峰面积。以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。A.4.5.4样品测定将样品溶液注入高效液相色谱仪，得到相应的峰面积，根据标准曲线得到待测液中L-苹果酸、富马酸、丁二酸和马来酸的浓度。（必要时，对待测液进行稀释检测）A.4.6结果计算苹果酸、丁二酸、富马酸或马来酸的质量分数wi，按公式(A.1)计算：Ai——由标准曲线得到的样品溶液中各组分的含量，单位是毫克每毫升（mg/mlV——标准溶液定容体积，单位是毫升（mLf——试液的稀释倍数；mi——样品质量，单位为毫克(mg)。A.5比旋光度的测定A.5.1称取4.25g试样，精确至0.1mg，加入20mL水溶解，移至50mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。其余步骤按照GB/T613-2007的规定执行。比旋光度αm(20℃,D)数值以“(º)·dm2·kg-1”表示，按公式(A.2)计算：α——试样溶液在20℃测得的旋光度的数值，单位为度(°);l——旋光管长度的数值，单位为分米（dm）；ρ——溶液中有效组分的质量浓度，单位为克每毫升(g/mL)。A.6ee值的测定A.6.1原理用高效液相色谱法，在选定的工作条件下，通过手性色谱柱使试样苹果酸中D,L构型分开，用紫外吸收检测器检测，用外标法定量，计算试样中L-苹果酸在总苹果酸的含量的占比。A.6.2仪器和设备高效液相色谱，配备紫外检测器A.6.3参考色谱条件A.6.3.1色谱柱CHIRALPAK-AD-H（4.6×250mm;5μm）A.6.3.3检测波长220nmA.6.3.4柱温30℃A.6.3.5流速1.0ml/minA.6.3.6进样量10μlA.6.4分析步骤称取50mg试样，精确至0.1mg，置于50mL容量瓶中，用磷酸溶液稀释至刻度，摇匀，经0.45μm滤膜过滤，再经超声波脱气处理。在A6.3参考色谱条件下进行测定，D-苹果酸的相对保留时间为7.5min，L-苹果酸的相对保留时间为8.5min（见附录表C1分析得到试样中D-苹果酸和L-苹果酸的峰面积，以面积归一化法定量。A6.5结果计算L-苹果酸光学纯度ee值，按公式A.3计算其中[L]和[D]分别表示苹果酸的L和D构型对映体在HPLC图谱中的各自峰面积。试验结果以平行测定结果的算术平均值为准。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于0.1%。A.7灼烧残渣的测定称取2.5g试样，精确至0.1mg。其他按GB/T9741-2008的