护康酸对鸡胃肠道形态结构及功能的影响研究

护康酸对鸡胃肠道形态结构及功能的影响研究STUDYONTHEEFFECTOFHUKANGACIDONTHEMORPHOLOGYANDFUNCTIONOFTHEGASTROINTESTINALTRACTINCHICKENS目录摘要……………1关键词…………11前言…………21.1研究背景…………………21.2酸化剂的研究现状………21.3研究的意义…………………52材料与方法……………………52.1材料………………………52.1.1试验药品与试剂…………62.1.2试验器材…………………62.2试验方法…………………62.3指标测定…………………62.3.1嗉囊、胃、小肠和盲肠PH值的测定…………………62.3.2肠道形态结构变化………………72.3.3各肠段的微生物多样性分析……73结果与分析……………………73.1试验结果……………………73.2试验分析……………………74讨论……………75结论……………8参考文献………………………8致谢………………10护康酸对鸡胃肠道形态结构及功能的影响研究摘要：酸化剂的应用不单单局限于作为防腐剂等，其应用于养殖行业可以减少抗生素的使用，加入饮水中可以有效杀灭很多病原微生物如非洲猪瘟病毒等。因此，国内外对于酸化剂的研究也有很多，在前人的基础上，本次课题拟将160只1日龄雏鸡，采用单因子实验设计均匀的分为6个处理组，其中实验组每个处理3个重复，每组10只。分别在饮水中混入0.15％无机酸、0.1％有机酸、和0.05％、0.1％、0.2％的复合有机酸（即护康酸）以及不加酸化剂做空白对照进行试验。分别于14d、21d、42d在禁饲八小时后处理，测量其胃肠道PH值，微生物多样性以及观察其胃肠道的形态结构变化，从而验证其减抗作用。关键词：酸化剂；抗生素；胃肠道；养殖业StudyontheeffectofhukangacidonthemorphologyandfunctionofthegastrointestinaltractinchickensAbstract:Theapplicationofacidifierisnotonlylimitedtoaspreservative,butalsocanreducetheuseofantibioticsinthebreedingindustry.Addingacidifiertodrinkingwatercaneffectivelykillmanypathogenicmicroorganisms,suchasAfricanswinefevervirus.Therefore,therearemanyresearchesonAcidifiersathomeandabroad.Onthebasisofpredecessors,thisprojectplanstodivide1601-day-oldchickensinto6treatmentgroupsevenlybysinglefactorexperimentdesign,including3repetitionsforeachtreatmentgroupand10foreachgroup.Mixedwith0.15%inorganicacid,0.1%organicacid,and0.05%,0.1%,0.2%compoundorganicacid(i.e.hukangacid)andnoacidifierrespectivelyindrinkingwaterforblankcontroltest.ThepHvalueofgastrointestinaltract,microbialdiversityandmorphologicalchangesofgastrointestinaltractweremeasuredat14d,21dand42d,respectively,aftereighthoursofgavageKeywords:Acidifiers;antibiotics;gastrointestinaltract;aquaculture1前言1.1研究背景在当前减抗禁抗的大环境下，我们就必须寻找一种绿色安全的养殖模式来保证养殖行业的稳定健康发展，毕竟对于我们来说，肉类是我们摄取蛋白质以及其它各种生命元素的重要途径，因此，肉用动物的养殖就不得不另觅良途。而酸化剂则作为一种替代抗生素的药品出现，若我们能够通过试验来证明其效果，那就是养殖业的曙光。而长沙绿叶生物有限公司经过潜心研究的护康酸一经推出就广受好评，因此为了得出酸化剂的量化、数据化的效果，以及单一的无机酸、有机酸和复合酸化剂对鸡胃肠道形态结构及功能的影响，所以选用护康酸作为实验的基础在导师指导下展开本次研究。1.2国内外研究现状近年来，随着很多专家对酸化剂的深入研究，发现了酸化剂在养殖业的诸多用途。动物饲料中添加一定量的酸化剂或者是饮水中添加酸化剂，有利于降低动物患病几率减少抗生素的使用、提高动物生产效能等作用，具有很大的开发前景。酸化剂的使用也有很久了，以前常作为防腐剂、消毒剂等的出现在我们的生活中，但作为添加剂应用于动物生产的历史并不悠久，但很多学者的研究都表明了其具有真实可见的作用，如下：提高畜禽生长性能。李俊波等[1]研究发现，断奶仔猪每日饲喂二甲酸钾的添加量为0.9%时，试验仔猪的日增重比日粮中不添加二甲酸钾以及添加1.8%和3.6%组相比分别提高了14.1%(P<0.1)、7.3%(P>0.1)和15.0%(P<0.1)，由数据说明，我们在添加酸化剂时并不是越多越好，而是要根据试验的结果来确定合理的添加范围。闻爱友等[2]在对照组和试验A、B、C组共4个组，在日粮中分别添加0、0.6%、1.2%、1.8%的二甲酸钾。试验结果表明在0-14d，随着二甲酸钾在日粮中添加剂量的增加，仔猪的平均日增重和料重比都逐步改善，且试验B和试验C组均呈显著的提高(P<0.05)，而在15-28d，仔猪的平均日增重和料重比，均以试验B组效果最好且差异显著(P<0.05)。而在15-28d，仔猪的平均日增重和料重比，均以试验B组效果最好且差异显著(P<0.05)。在0-28d，与对照组相比，试验A、B、C组仔猪的平均日增重分别提高了5.14%、9.05%和8.01%，差异均较显著(P<0.05)，这说明在动物养殖的不同阶段所需添加的酸化剂的剂量也不相同，因此为了使酸化剂能够更合理的应用于养殖行业，就急需我们去研究探索酸化剂的使用奥妙。张翠等[3]研究结果表明：添加二甲酸钾可以提高断奶仔猪的日增重，降低料重比，IgA、IgM、IgG水平明显提高。而通过实验数据对比得知，1%为断奶仔猪日粮中二甲酸钾最适添加量。翟振亚等[4]试验结果发现，日粮添加1%二甲酸钾+200g/t凝结芽孢杆菌可显著改善断奶仔猪的生长性能，并且有替代抗生素的潜能。李运虎等[5]研究结果表明，在早期断奶仔猪日粮中添加酸化剂可刺激胃酸和胃蛋白酶分泌，因此，仔猪的食欲以及消化能力都会增强，有利于其提高生长性能。阳巧梅[6]等结果显示:与对照组相比，处理3组显著提高了1-14d、15-28d及1-28d断奶仔猪平均日增重(P<0.05)，处理2组显著降低了1-28d料重比(P<0.05)，处理1组显著提高了1-14d平均日增重(P<0.0仔猪平均日增重(P<0.05)，处理2组显著降低了1-28d料重比(P<0.05)，处理1组显著提高了1-14d平均日增重(P<0.01(甲酸、乙酸、丙酸和C12脂肪酸)和0.2%有机酸2(丁酸、山梨酸和C12脂肪酸)。李兰海等[7]试验结果表明：饲粮中添加酸化剂和牛至油可以替代硫酸黏杆菌素在断奶仔猪饲粮中使用。杨飞来等[8]试验结果表明：添加复合酸1和复合酸2仔猪末重和日增重高于添加柠檬酸组(P<0.05)，料重比低于柠檬酸组(P<0.01)。韩庆功等[9]研究表明：酸化剂组与对照组相比，日增重提高了6.01%(P>0.05)、日耗料量降低了6.72%(P>0.05)，料重比降低了11.40%(P<0.05)，与抗生素组差异不显著；酸化剂组与对照组、抗生素组相比，试验初期对猪瘟疫苗产生的抗体影响差异不显著。苏琴等[10]研究结果发现多种酸化剂均能显著降低试验全期的饲料增重比，提高仔猪断奶后14-28d的平均日增重，缓释酸化剂物pH显著低于对照组和普通酸化剂组(P<0.05)，IgA水平在断奶后期显著高于对照组和普通酸化剂组(P<0.05)。通过以上的种种实验可以得出酸化剂能够显著的降低料重比，提高养殖行业收益，同时相较于以前的含抗饲料能够解决当代社会养殖行业所面临的窘境。(二)维护肠道微生物平衡，降低腹泻率。根据张志静[11]的研究结果，饲粮加入酸化剂能够降低其pH值，而饲料在胃肠道中解离出氢离子从而降低胃肠道的pH值。Burnell等(1998)研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加1%的柠檬酸，能够将饲料、胃、回肠和结肠的pH值都降低0.1-0.7之间。动物胃肠道处于酸性环境下时，会促进乳酸杆菌的生长，而抑制大肠杆菌等有害菌的定植和繁殖。有机酸都是弱酸，这就表明有相当一部分的弱酸仍然呈分子态，这些没有解离的酸分子相较于氢离子更容易穿过细胞膜进入细菌内部，而细胞质则偏碱性，在这种环境下酸会释放质子，就导致细菌细胞内氢离子浓度升高，使pH降低，而pH的降低则会使细菌启动一种特殊的机制(H+-ATPase系)，将细菌内部的H+外排到细菌外部，使pH值恢复到正常，而这一过程需要消耗ATP，这是除了细菌正常消耗之外的耗损，因此细菌的正常代谢活动就会受到影响，导致细菌的生长和繁殖被抑制，细菌消耗能量排出了质子，但是酸阴离子并未排出，从而使得细胞内的酸阴离子的积累，打破细菌内部固有的阴阳离子平衡，使得细菌生长受阻甚至是死亡。而对于乳酸杆菌和双歧杆菌来说，pH值的变化并不会对其生长和繁殖产生影响，一定量的营养，但消耗者减少了，所以对于它们来说更有利于生长与繁殖，可以说是保护了有益菌。而无机酸化剂虽然不能够渗透细菌的细胞壁发挥作用(Gauthier等，2002)，但是其能通过降低细菌生存环境的pH值，使得细菌内外pH值存在较大差异，对于细菌来说为了适应环境的变化，就不得不进行阴阳离子的交换，从而影响了细菌代谢。研究表明，酸化剂能明显降低肠道中的大肠杆菌数量。（Ravindran等，1993)[12]认为以现代技术生产的带保护层的酸化剂更能降低粪便中致病性大肠杆菌的数量，即在酸化剂生产过程中给予它一张能够自己选择在哪里发挥作用的保护膜，因此其作用将发挥的更为彻底。张婧婧等[13](2017)的研究表明，哺乳母猪饲粮中添加0.1%微囊型酸制剂(乳酸、富马酸、苹果酸等有机酸)能显著降低粪便中大肠杆菌数量，改善粪便中乳酸杆菌与大肠杆菌的比例。动物饮用酸化剂后，通过降低胃肠道pH值，可以有效地抑(杀)有害菌的生长，从而促进益生菌的生长，从而有效地调节动物胃肠道菌群平衡，保护胃肠道健康，降低腹泻率[14]。（三）增强免疫力部分酸类对于动物机体抗应激能力以及免疫力的提升有较大帮助。延胡索酸参与并释放ATP的时间较葡萄糖途径更少，这使得动物体受到应激时对能量的需求可以得到很好的供应，从而表现出更好的防御能力[15]。延胡索酸添加可防止雏鸡因为各种应激所造成的机体免疫空虚，而其镇静功能除了舒缓神经中枢，更能减弱机体热应激造成的损伤。李建平等[16]发现饲料中加入柠檬酸能明显增强断奶仔猪清除自由基以及抗氧化的速度，活性氧自由基是动物体内产生的一种过量则能使动物患病的基团，而清除自由基的速度越快则对动物体的损伤越小，因此添加酸化剂能够减少动物患病几率。李鹏等[17]研究报道，在仔猪的日粮中添加0.1%、0.3%乳酸型复合酸化剂，与未添加酸化剂的对照组相比，血清IgA含量有明显升高;与对照组相比，血清IgM含量无明显提高，但有提高趋势;与对照组相比，仔猪血清IgG含量显著提高。从上面的免疫球蛋白的水平可以看出，添加酸化剂可提高仔猪的体液免疫水平，能有效地预防大部分细菌、病毒等引起的感染性疾病。张德成等[18]在1994年发表的报道中表明，在仔猪的日粮中添加0.5%的柠檬酸，可改善肉仔猪机体内环境，促进红细胞Cab受体的合成，从而提高红细胞免疫功能。1.3研究意义猪饲料中普遍使用抗生素已经较长时间，造成了许多的后果，尤其耐药性超级细菌的出现，引起了人们的恐慌，限用、禁用抗生素在国内外已成共识，但是为了使养殖业发展不受影响，人们的餐桌上不会缺少安全的肉类，使用一些安全无害的替代物来饲养动物有其必要。目前国内外已研制使用一些无残留的绿色生长促进剂，如中草药制剂、酸化剂、酶制剂等作为饲用抗生素的替代品，同时其还能提高自身免疫力及畜禽生产效率，减少疾病的发生，从而也能减少药物抗生素的使用。饲料酸化剂现多以有机酸和无机酸配合使用为主，因为单一的有机酸或者无机酸都有其缺点。常见的有机酸包括柠檬酸、延胡索酸、苹果酸、山梨酸、琥珀酸、乳酸、富马酸以及甲酸、乙酸、丙酸、丁酸等。有机酸能够改善饲料适口性，增加采食量，提高饲料转化率；有些有机酸如柠檬酸、延胡索酸能够直接参与机体代谢，促进营养物质的消化吸收，还能够增强机体免疫机能，缓解应激。其他酸化剂如丙酸和丙酸钙、山梨酸和苯甲酸都是很好的饲料防霉剂，被广泛用于饲料保藏。但有机酸成本较高，对设备、料槽等容易造成腐蚀。无机酸主要是指磷酸和盐酸，酸性强，成本低，其主要作用是降低饲料、胃肠道等的pH值，但其作用过于单一。而有机低成本，酸和无机酸的结合使用能够克服单一酸化剂的缺陷与不足，增强使用效果，降提高养殖经济效益[19]。酸化剂不仅可提升动物的生长性能，更能提高动物的免疫力、减少疾病的发生[20]。Roth等[21]将以有机酸为基础的酸化剂添加在肉鸡饲料中以验证其替代抗生素的效果，而在畜禽饲料中添加无机酸和有机酸以及复合酸化剂有辅助提高动物消化功能、促进动物肠道健康，降低各种应激反应带来的损伤等作用[22]。本试验拟用护康酸这一复合有机酸产品长期饲喂鸡以观测其对鸡的胃肠道形态结构及功能的影响，后续测量的数据包括胃肠道pH值、小肠绒毛长度及隐窝深度、胃肠道微生物的多样性，通过比较各组数据得出酸化剂的使用对鸡胃肠道形态结构及功能的实际影响。2材料与方法2.1试验材料2.1.1试验药品与试剂护康酸即营养性酸盐复合有机酸化剂（生产厂家：长沙绿叶生物有限公司生产批号：20190714）柠檬酸（生产厂家：科德化工有限公司生产批号：20190617），磷酸（生产厂家：振华工业股份有限公司生产批号：20190326）。去离子水、10％的甲醛、液氮。2.1.2试验器材PBS、指行管、震荡混匀器、PHS-3C型酸度计、标本瓶、手术剪、纱布、液氮罐、保温杯、超净工作台、细胞冻存管、电脑及相应软件。2.2试验方法2.2.1试验设计将160只1日龄的雏鸡采用单因子实验设计均匀分为6个处理，其中实验组每个处理3个重复，每个重复10只。空白用基础日粮饲养（10只），基础日粮+无机酸（磷酸）对照组，在饮用水中添加0.13%无机酸，基础日粮+有机酸（柠檬酸）对照组，在饮用水中添加0.1%的柠檬酸。基础日粮+复合有机酸实验组分别在饮用水中添加0.05%的复合有机酸，0.1%的复合有机酸，0.2%的复合有机酸。实验天数为42天，分为两个阶段，1-21d为第一阶段，基础日粮喂育雏料（破碎料），22-42d为第二阶段，喂育成料。（用三个批次的产品作为三组重复的饲喂产品）饮水添加剂量复合有机酸无菌水0.13%磷酸0.1%柠檬酸0.05%0.10%0.20%1L998.7mL1.3g1L999mL1g1L999.5mL0.5g1L999mL1g1L998mL2g2.2.2饲养管理将鸡群饲养中同一鸡舍中，3层阶梯式笼养，分组饲养，每组一笼，每笼10只。1至2周龄红外线灯保温，通风扇换气，网上平养、自由采食、自由饮水，14d后自然光照。按照普通肉鸡的免疫程序进行免疫，7日龄用新支二联浸头，同时禽流感肌肉注射0.3mL/只。（在7d称重时进行）14日龄法氏囊中等毒力苗饮水，21天新城疫Ⅳ系苗饮水二免，28天法氏囊二免。在试验期间观察鸡群的精神状态，及时记录。2.3指标测定2.3.1嗉囊、胃、小肠和盲肠PH值的测定于14d，21d，42d，每个重复随机取两只鸡，采样前禁饲8h，经颈动脉放血屠宰后，立即取出嗉囊，肌胃，腺胃，十二指肠，空肠，回肠，盲肠内容物挤入指行管中，放入-20℃保存，按1∶8(w/v)加入去离子水稀释,250r/min震荡混合5min,用PHS-3C型酸度计(赛多利斯)测定pH值。2.3.2肠道形态结构变化取1cm肠段直接置于含有10%的甲醛，一个实验组的肠段置于一个离心管中，用纱布将同一个组的十二指肠，空肠，回肠，盲肠，结直肠分别包裹起来，做好标记置于同一玻璃仪器中。一天后换液。脱水包埋切片，HE染色后观察其小肠绒毛高度和隐窝深度，用Image-ProPlus6.0软件对每张照片进行分析，选定最长的6根绒毛进行测量，求其平均值，计算绒毛高度和隐窝深度的比值。每个样品重复测三次，取其平均值。2.3.3十二指肠，空肠，回肠，盲肠的微生物多样性分析于雏鸡饲喂21d，42d时，每个组随机取2只鸡，禁饲8h后，经颈动脉放血处死，迅速打开其腹腔，取十二指肠U型段、空肠中段、回肠中段、盲肠整段收集，将所有肠段内容物收集于细胞冻存管中，置于有液氮的保温杯中速冻10min，后移至-80℃冰箱中保存，后续通过16s核糖体测序后对肠道的多样性进行分析。3.结果与分析3.1结果受本次疫情的影响，前期的饲喂工作以及取样等工作已经完成但后续的工作无法去到实验室不能开展，因此本次研究缺乏了相应的数据。3.2分析3.2.1分析各组间胃肠道的PH值，得出各组对鸡胃肠道PH值的影响3.2.2测出各组的小肠绒毛长度以及隐窝深度，对比得出其各自对鸡胃肠道形态结构的影响3.2.3以16S核糖体测序测出各组肠道的微生物的多样性。比较各组肠道的生物多样性。4.讨论在雏鸡饲喂过程中，要严格遵照单因子试验的设计要求，保证每一步都是在有理有据的情况下进行。要保证环境舒适，减少因外界的刺激而导致雏鸡的生长发育受到影响，只有严格的按步骤执行才能够得到理想的试验结果。而由于受本次新冠疫情的影响，还未能回到学校进行后续的试验，所以本次讨论只能根据现有研究预测，对照组的各种数据相较于单一无机酸及单一有机酸来说，应该在PH值上略高，在绒毛长度上略短，隐窝较深，而微生物多样性会更丰富些。而三种处理相对于复合有机酸来说，应该在各种数据上都处于相对的不理想，所以在饮水中添加适量的护康酸应该是有益于调节动物生长性能，能够在一定程度上使得其患病的几率下降，从而达到不或减少使用抗生素的目的，当然，这只是预期的试验结果。5.结论按照理想来推测，在实际生产过程中运用护康酸于日常饲喂里能够提高动物生产性能。护康酸作为一种复合有机酸，能够降低胃肠道中的pH值，同时由于其是弱酸，能够进入细菌内部，破坏细菌正常的生理代谢，两相结合达到抑（杀）有害菌的效果。而小肠绒毛更长则其吸收饲料中的各种营养物质的效率则越高、吸收的也越彻底，从而饲料利用率就越高，料重比就会降低，养殖效益就会提高。而隐窝深度的减少则会使小肠的分泌功能增强，所以会提高生长效能。饲喂酸化剂的动物其胃肠道的有益菌如乳酸杆菌及双歧杆菌的数量会增加，而大肠杆菌的数量则会减少，因此其患病几率就会小得多，从而能够达到减少抗生素的使用甚至不使用抗生素的目的，这就是本次课题所要证明的最根本的观点。但这一切都没有实验数据为依托，因此并不具有说服力。后续需要将未完成的试验完成得出数据，再分析出结果。参考文献李俊波，杨飞来，袁中彪，等.二甲酸钾对断奶仔猪生产性能和养分消化率的影响[J].中国饲料，2009(2):27-29.闻爱友，胡忠泽，庞训胜，等.母猪日粮添加不同水平叶酸的饲喂效果试验[J].粮食与饲料工业,2002(12):27-28.张翠，王昕陟，齐爱岭.二甲酸钾对断奶仔猪生长性能和免疫指标的影响[J].畜牧与兽医，2011(2):43-46.翟振亚，胡小超，高春起，等.日粮添加二甲酸钾和凝结芽孢杆菌对断奶仔猪生长性能和免疫指标的影响[J].饲料工业，2015(12):8-11.李运虎，李美君，彭兰丽，等.不同酸化剂对断奶仔猪胃肠道pH和消化酶活性的影响[J].饲料博览，2019(2):20-23.阳巧梅，尹秀娟，廖婵娟.日粮添加酸化剂替代抗生素对断奶仔猪生长性能、血清生化指标及肠道形态的影响[J].中国饲料，2018(10):37-41.李兰海，陈丽玲，游金明，等.酸化剂和牛至油替代硫酸黏杆菌素对断奶仔猪生长性能、腹泻率和盲肠微生物数量的影响[J].动物营养学报，2018，30(5):1864-1871.杨飞来，彭鹏，邓敦，等.不同酸化剂对断奶仔猪生长性能影响研究[J].广东饲料，2017(6):21-23.韩庆功，崔艳红，李丹，等.复合酸化剂对断奶仔猪生长性能、抗体水平及粪便微生物的影响[J].饲料工业，2016(6):13-17.苏琴，刘秀婷，肖英平，等.酸化剂对断奶仔猪生产性能及血清生化指标的影响[J].中国畜牧杂志，2014，50(13):71-76.张志静.酸化剂在母猪上应用的研究进展[J].广东饲料，2017，26(06):33-36.KornegayET，LindemannMD，RavindranV.Effectsofdietarylysinelevelsonperformanceandimmuneresponseofweanlingpigshousedattwofloorspaceallowances.[J].Journalofanimalscience，1993，71(3).张婧婧，刘庚寿，李伟，等.不同剂型酸化剂对哺乳母猪生产性能、初乳成分和肠道菌群结构的影响[J].动物营养学报，2017，29(06):2064-2070.刘连军.酸化剂在猪养殖业中的应用进展[J].北方牧业，2017(12):26.连凯霞，蒋国政，李继昌.复合酸化剂对饲料的防霉及酸化作用[J].中国饲料，2013(13):8-10.李建平，单安山，徐奇友.不同类型酸化剂对早期断奶仔猪胃酸分泌、免疫功能和抗氧化机能的影响[J].东北农业大学学报，2009，40(4):69-73.李鹏，齐广海.饲料添加剂的使用安全研究进展[J].饲料工业，2006(18):7-10.张德成，吴润培，陈思义，等.哺乳仔猪胃内酸度的变化对红细胞免疫功能的影响[J].饲料工业，1994(07):28-29.李文刚.减少