病原微生物菌（毒）种保藏 低温保存技术标准

1WS/TXXX—202X病原微生物菌（毒）种保藏低温保存技术标准本文件规定了人间传染的病原微生物菌（毒）种低温保存过程中的基本流程与技术要求，包括保藏基本要求，低温冷藏保存、低温冷冻保存、超低温冷冻保存、深低温冷冻保存、冷冻干燥、转运环境下低温保存流程及相关要求。本文件适用于全国各级人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构，以及涉及病原微生物菌（毒）种保管、使用和疫苗生产等单位。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求GB/T43429人感染病原微生物与样本保藏通用要求WS233病原微生物实验室生物安全通用准则WS315人间传染的病原微生物菌（毒）种保藏机构设置技术标准WS/T病原微生物菌（毒）种保藏质量控制通用标准WS/T病原微生物菌（毒）种保藏建筑技术标准T/CPMA011病原微生物菌（毒）种保藏数据描述通则3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1病原微生物pathogenicmicroorganisms可以侵犯人、动物，引起其感染甚至传染病的微生物。注：包括细菌、病毒、真菌、立克次体等。3.2菌（毒）种microorganismstrain可培养的，人间传染的细菌、病毒、真菌、立克次体等具有保存价值的，经鉴定、分类并给予固定编号的病原微生物。3.3保藏collectionandpreservation保藏机构依法以适当的方式收集、鉴定、编目、储存菌（毒）种或样本，维持其活性和生物学特性，并向合法从事病原微生物相关实验活动的单位提供菌（毒）种或样本的活动。3.4保存storageWS/TXXX—202X2储存菌（毒）种，维持其活性和生物学特性的活动。3.5复苏revival将菌（毒）种代谢活动从停止或趋于停止状态恢复到正常生理活动状态的过程。3.6低温保存low-temperaturepreservation在低温条件下保存菌（毒）种，使其代谢水平降低乃至完全停止生长繁殖，达到半休眠或完全休眠状态的技术方法。注：低温保存条件包括低温冷藏（2～8℃)、低温冷冻（-20～-40℃)、超低温冷冻（-60～-80℃)、深低温冷3.7低温冷藏保存refrigeratedpreservation在2～8℃条件下保存菌（毒）种的方法。3.8低温冷冻保存low-temperaturefrozenpreservation在-20～-40℃条件下保存菌（毒）种的方法。3.9超低温冷冻保存ultra-lowtemperaturefrozenpreservation在-60～-80℃条件下保存菌（毒）种的方法。3.10深低温冷冻保存deepcryogenicfrozenpreservation在-150～-196℃条件下保存菌（毒）种的方法。3.11低温保护剂cryoprotectant保护菌（毒）种，使其在低温保存及复苏过程中维持存活率、遗传稳定性和生物学特性的关键物质。3.12冻干保护剂lyoprotectant保护菌（毒）种，使其在冷冻干燥、保存及复苏过程中维持存活率、遗传稳定性和生物学特性的关键物质。3.13程序降温programmedcooling按照特定程序设计对菌（毒）种进行降温的过程。其中程序设计包括合理的温度梯度、可控的降温速率等。3.14冷冻干燥freezedrying将菌（毒）种悬浮于适宜的冻干保护剂中，经预冻后在高真空状态下以升华方式除去水分，熔封管口或轧盖密封的过程。4保藏基本要求4.1病原微生物菌（毒）种保藏管理、生物安全、保藏机构功能分区及设施设备等应符合《人间传染的病原微生物菌(毒)种保藏机构管理办法》《人间传染的病原微生物目录》以及GB19489、GB50346、GB/T43429、WS233、WS315、WS/T建标等有关要求。4.2保藏的病原微生物菌（毒）种应具有典型生物学特性或遗传学特性的描述，活性和传代信息明确，培养条件、表型和分子特征稳定。4.3保藏的病原微生物菌（毒）种应具有明确的特征信息，包括但不限于中文名称、外文名称、分类学地位、来源历史、分离时间和分离地址等。信息描述应符合GB/T43429、T/CPMA011。WS/TXXX—202X34.4应做好病原微生物菌（毒）种低温保藏各环节质量控制工作，建立、成文并实施质量控制程序，具体按照WS/T《病原微生物菌（毒）种保藏质量控制通用标准》执行。5低温（冻干）保护剂选择5.1应遵循适配性、无菌性、安全性和渗透性原则选择适宜的保护剂，建立选择低温（冻干）保护剂的程序和方法。常用低温（冻干）保护剂及其推荐使用情况，见附录A和附录B。5.1.1适配性：根据病原微生物种类（细菌、病毒、真菌等）及种属选择最适保护剂。5.1.2无菌性：保护剂及溶剂应确保无其他微生物污染。5.1.3安全性：对病原微生物无毒或微毒性，不影响其复苏后的生物学特性。5.1.4渗透性：小分子保护剂（如甘油、二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide，DMSO））能渗透入细胞，大分子保护剂（如脱脂牛奶、血清）在细胞外部形成保护层。5.2不同种类的菌（毒）种宜使用不同类型、不同配方及相应浓度的低温（冻干）保护剂。宜优先选择权威保藏机构推荐或经过适用性评价的保护剂及配方，新的配方以存活率/滴度恢复率为金标准来进行筛选和优化。5.2.1渗透性保护剂：如甘油（常用浓度10%-20%，适用于大多数细菌、真菌DMSO（常用浓度5%-10%，适用于细胞系和某些病毒）。5.2.2非渗透性保护剂：如蔗糖、海藻糖、脱脂牛奶、血清白蛋白。适用于冷冻干燥。5.2.3复合保护剂：如“脱脂牛奶-蔗糖-谷氨酸钠”混合液，常用于细菌的冷冻干燥。5.3不同类型的保存方法宜使用不同类型的低温（冻干）保护剂。5.3.1超低温冷冻保存：可选用渗透性或非渗透性保护剂，浓度需根据降温速率优化。5.3.2深低温冷冻保存：通常选用渗透性保护剂（如10%甘油或5%DMSO）或与渗透性保护剂的混合物。5.3.3冷冻干燥：使用复合冻干保护剂，通常包含缓冲盐、防冻剂和聚合物，形成稳定的多孔基质。6低温冷藏保存6.1技术要求6.1.1适用于生长旺盛期的菌种斜面、半固体琼脂穿刺培养物、液体培养物，及不宜冷冻的病原微生物（如某些螺旋体、奈瑟菌等）。6.1.2适用于菌（毒）种的短期保存。可根据需要决定是否选用保护剂。6.1.3使用螺旋盖试管或密封性良好的无菌容器，防止培养基干燥。对于斜面，可封堵无菌棉塞或覆盖无菌矿物油以延长保藏时间。对于有条件的实验室，可使用一次性无菌培养瓶或试管。6.2菌（毒）种准备6.2.1将细菌和真菌菌落接种于含相应培养基的培养容器中，在合适的培养条件培养。6.2.2通过细胞培养、鸡胚培养、动物接种等方法获得病毒培养物。6.3保存6.3.1待生长至对数生长期（细菌或真菌）或适宜滴度（病毒将含培养物的培养容器密封，做好相应标记保存于2～8℃。6.3.2保存时间不宜超过3个月，具体时间视菌（毒）种的种类不同而异。6.3.3定期检查培养基是否干裂、污染，并按时转种，保证质量控制。7低温冷冻保存WS/TXXX—202X47.1技术要求7.1.1适用于多数细菌、部分真菌和病毒。除少数特殊耐冻菌（毒）种外，应选择适合的、针对性低温保护剂，如采用无菌的甘油或脱脂奶粉，或DMSO。7.1.2适用于菌（毒）种的中、短期保存。7.1.3宜使用耐低温无菌冻存管，采用螺旋盖设计或配备硅胶密封圈，避免使用玻璃安瓿瓶。7.2菌（毒）种准备7.2.1将细菌和真菌菌落接种于含相应培养基的培养容器中，在合适的培养条件培养。7.2.2通过细胞培养、鸡胚培养、动物接种等方法获得病毒培养物。7.2.3收获对数生长期（细菌和真菌）或适宜滴度（病毒）培养物，制备悬液并与无菌处理的低温保护剂按一定比例混匀后分装于无菌冻存管内。7.3保存7.3.1分装后的冻存管密封后标记信息，包括菌（毒）种编号、名称、保藏日期、代次等，直接保存于-20～-40℃。7.3.2保存时间不宜超过2年，根据菌（毒）种的种类不同而异。7.3.3此温度下冰晶仍可能缓慢生长，不适合长期保藏珍贵菌（毒）种。7.4复苏7.4.1从低温保藏设备中取出菌（毒）种冻存管，可采用2～8℃或室温等方式解冻。7.4.2开启冻存管，将菌（毒）种移至适宜的培养条件下培养。8超低温冷冻保存8.1技术要求8.1.1菌（毒）种保藏最常用的方法。适用于多数细菌、真菌、病毒等病原微生物。8.1.2低温保护剂准备：应根据菌（毒）种类别选择适合的、有针对性低温保护剂，如采用无菌的甘油或脱脂牛奶，或DMSO。8.2菌（毒）种准备8.2.1使用对数生长期（细菌和真菌）或适宜滴度（病毒）培养物，避免不同的生理状态对微生物存活率的影响。8.2.2接种固体培养基的细菌和真菌，可刮取适量菌苔转移至含有无菌低温保护剂（如含20%甘油的新鲜配制液体培养基）的冻存管内，混匀，制成菌悬液。8.2.3接种液体培养基的细菌和真菌，振荡培养后取菌悬液与低温保护剂按一定比例混匀后，分装于无菌冻存管内，或者用无菌玻璃珠或磁珠吸附菌种悬液，然后将玻璃珠或磁珠置于无菌冻存管内。8.2.4病毒在培养至适宜滴度后，收获培养病毒至无菌冻存管内（需要时，加适宜的低温保护剂）。8.3程序降温8.3.1将含菌（毒）种的冻存管进行程序性梯度降温（每分钟下降1℃)或置入程序降温设备（如“冻存盒”）中，应控制合适的降温速率，实现缓慢降温，避免冰晶损伤。8.3.2待冻存管降至规定温度后转移至储存盒，置于-60～-80℃超低温保藏设备中保存。8.4保存8.4.1冻存管上应清晰标识，包括菌（毒）种编号、名称、保藏日期、代次等。8.4.2保存期间应动态监测设备性能、环境参数等，定期抽样检查活力及杂菌情况。8.4.3可长期保存，根据菌（毒）种的种类不同而异。WS/TXXX—202X58.5复苏8.5.1从低温保藏设备中取出菌（毒）种冻存管，可采用2～8℃或室温等方式解冻。8.5.2开启冻存管，将菌（毒）种移至适宜的培养条件下培养。9深低温冷冻保存9.1技术要求9.1.1保藏效果最好的方法，通常在液氮（气相或液相）或深低温冰箱（-150℃及以下）中保存。适用于多数病原微生物，尤其适用于不宜冷冻干燥的菌（毒）种（如支原体、衣原体、部分病毒）。9.1.2应使用保护剂，保护剂的选择同8.1.2。9.1.3应使用耐深低温冻存管。9.1.4气相与液相保藏：气相液氮保藏（-150℃至-196℃)安全性更高，能避免液相保藏可能造成的交叉污染和管体爆裂风险。需确保温度始终低于-150℃。液相液氮保藏（-196℃)温度最稳定，但存在生物安全风险和液氮持续消耗。9.1.5安全要求：操作需佩戴防冻手套和护目镜，在通风良好的区域进行，防止窒息。冻存管密封性应做好严格检查。9.2菌（毒）种准备9.3程序降温9.3.1将含菌（毒）种的冻存管置于程序降温设备中，以合适的降温速率进行降温，直到温度达到菌（毒）种悬浮液冻结点之下（通常为5～10℃),并维持1～2小时。将冻存管迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-150℃)中保存。9.3.2如果无程序降温设备，则可将含菌（毒）种的冻存管置于（-60～-80℃)冰箱中冷冻2小时后，迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或气相(-150℃)中保存。9.4保存9.4.1冻存管上应清晰标识，包括菌（毒）种编号、名称、保藏日期、代次等。9.4.2保存期间应动态监测设备性能、环境参数等，定期检查活力及污染情况。9.4.3理论上可无限期保藏。9.5复苏7.4.1从低温保藏设备中取出菌（毒）种冻存管，可采用2～8℃、室温、37～40℃水浴等方式解冻。7.4.2开启冻存管，将菌（毒）种移至适宜的培养条件下培养。10冷冻干燥10.1技术要求10.1.1适用于多数病原微生物，但对干燥敏感的微生物（如螺旋体、不产孢子的丝状真菌、藻类、原虫）不适用。10.1.2应采用合适的冻干保护剂，过滤除菌或高压灭菌备用，保护剂的选用见附录B。10.1.3应使用专为冷冻干燥设计的耐真空安瓿瓶或西林瓶，分装菌（毒）株悬液前，应检查容器是否有裂纹或瑕疵，避免冷冻干燥过程中容器爆炸。10.1.4冻干机和真空泵之间应安装有效的疏水过滤器，防止含有微生物的液体或气溶胶进入真空泵，再通过排气口污染环境，或损坏真空泵。应定期检查并更换过滤器。10.1.5应确保冻干机密封圈清洁、完好，防止真空泄漏。10.2菌（毒）种准备WS/TXXX—202X610.2.1在无菌条件下，将冻干保护剂与菌（毒）种培养物按一定比例混匀，制成悬液。10.2.2取适量体积菌（毒）种悬液分装至灭菌安瓿管或西林瓶中，避免溅污上部管壁，无菌封口。10.2.3液体培养的细菌或真菌，应离心去除培养基，将培养物与冻干保护剂混匀，再分装至灭菌安瓿管或西林瓶中，于1～2小时内分装完毕。10.3预冻应将装有菌（毒）种悬液的安瓿管或西林瓶，以合适的降温速率降温至预冻目标温度，预冻2小时以上。预冻的降温速率可参考8.3。注：对大多数细菌而言，采用-80℃超低温冰箱进行预冻10.4冷冻干燥预冻结束后，应结合不同菌（毒）种生物学特性，选择合适的冷冻干燥程序进行操作。注：通常先后通过主干燥与二次干燥步骤，经升华移除游离水，及解吸移除结合水，获得冷冻10.5熔封或密封干燥后，将安瓿管颈部用强火焰拉细熔封，或西林瓶轧盖密封。10.6真空度或密封性测定熔封或密封后的安瓿管或西林瓶采用适宜方法确定真空度或密封性。10.7保存10.7.1冻存管上应清晰标识，包括菌（毒）种编号、名称、保藏日期、代次等。10.7.2安瓿管或西林瓶应在2～8℃或-20℃及以下温度避光保存。10.7.3保存期间应定期抽检开展质量控制。10.8复苏应严格规定复苏操作步骤与流程（如用砂轮划痕、无菌棉包裹、掰开，加入适宜的液体培养基重悬）。从低温设备中取出并打开安瓿管或西林瓶，加入适量培养基。缓慢旋转安瓿管或西林瓶后，将菌（毒）种移种到新鲜培养基中（上）培养。11转运环境下的低温保存11.1转运包装与标识11.1.1包装主容器应无菌防漏，采用可靠封口方式，辅助容器应防水防漏，且内置吸收材料，外包装应坚固抗损。11.1.2转运过程中应包含生物危害标识、信息标识和放置方向标识等。11.1.3转运过程中应附有菌（毒）种清单、说明文件，并提前完成必要的审批手续。11.2转运方法11.2.1应根据菌（毒）种保藏条件选择适当的转运方法，在整个转运过程维持稳定的低温温区，以避免反复冻融。11.2.2低温冷藏转运（2～8℃),宜使用低温冷藏箱，或配置冰袋、凝胶等制冷剂的保温容器，宜配备温度监测系统，连续运行时温区温度内波动幅度≤±2℃。11.2.3低温冷冻转运（-20～-40℃),宜使用专用冷冻转运箱，具备持续制冷功能与温度监测系统，连续运行时温区温度内波动幅度≤±2℃,在预设温度范围内宜保持均匀、稳定的低温环境。11.2.4超低温冷冻转运（-60～-80℃),宜使用性能可靠的超低温转运设备，如深低温冰箱或干冰储运系统，宜具备温度监测系统。设备应保持工况稳定，连续运行时温区温度内波动幅度≤±4℃。11.2.5深低温冷冻转运（-150～-196℃),宜使用专用的气相/液相氮转运设备，宜具备温度监测系统，应确保样本始终处于预设深低温状态，连续运行时温区温度内波动幅度≤±4℃。11.2.6容器应通过稳定性验证及温度分布均匀性测试。11.2.7低温转运方法低温温区维持时长应大于转运总行程时长（含装卸、中转、临时停留等）。WS/TXXX—202X711.3转运温度监控与记录11.3.2宜具备校准合格的温度监测系统，实时采集、记录并传输转运期间温度数据。11.3.3温度传感器测点宜包含菌（毒）种几何中心及靠近箱壁处，确保单点温度准确性和温区均匀性。11.3.4温度数据宜全程连续监测，采样频率≤5分钟/次，上传频率≤15分钟/次，数据保存期限≥样本保存期限。11.3.5温度监测系统宜具备本地声光报警、短信推送、平台弹窗等多重报警机制，报警延迟≤5分钟。WS/TXXX—202X8（资料性）常用低温保护剂常用低温保护剂见表A.1。表A.1常用低温保护剂保护剂