蛋白质纯化系统用户手册

蛋白质纯化系统用户手册一、系统概述蛋白质纯化系统是用于分离制备蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的科学仪器，适用于化学、生物学、林学、材料科学及生物制药等领域，支持中试工艺开发和实验室分析。系统采用模块化设计并整合缓冲液试剂盒，可实现全自动纯化和脱盐流程。主流产品包括伯乐Profinia™、宁波艾纯PPS-HD系列等，配置双柱塞泵，制备流速≥80ml/min（压力≥6MPa），分析流速≥20ml/min（压力≥23MPa）。集成连续波长紫外检测器（190-740nm）、电导检测器（0-500mS/cm），支持多波长同步监测。方形收集器可按时间、滴数或峰值模式自动收集样本，控制软件内置层析方法数据库并自动生成实验报告。兼容凝胶过滤、离子交换、亲和层析等技术，流路采用生物相容性材料，可串联多柱完成复杂分离流程。二、技术参数2.1泵系统采用双柱塞，双泵设计，双流速双压力平台制备平台：流速≥80ml/min时压力≥6MPa分析平台：流速≥20ml/min时压力≥23MPa支持缓冲液线性梯度洗脱功能配备2个高压进样阀，可用于逆流洗脱、双柱并联切换及三柱串联洗脱2.2检测器连续波长紫外检测器：波长范围190-740nm，支持4波长同时检测电导检测器：检测范围0～500mS/cm，满足高离子强度检测需求支持蛋白质、核酸等生物大分子的在线检测与分析2.3收集系统采用X-Y轴控制的方形收集器，确保收集准确性支持按时间、滴数、峰值和时间窗口四种收集方式收集器可独立使用，适用于不同规格收集管2.4控制软件具备完整的层析方法模板数据库，支持简易编程内置专家辅助软件，提供实验设计指导数据自动处理功能，可自动生成实验报告支持方法保存与调用，便于实验条件重现三、系统组件与安装3.1主要组件主机系统（含双柱塞泵、梯度混合器）紫外检测器与电导检测器自动收集器控制电脑与软件层析柱及连接管路进样阀与切换阀组缓冲液瓶与样品瓶3.2安装步骤环境准备：将系统放置在水平实验台上，确保通风良好，远离水源和火源，环境温度保持在15-30℃，相对湿度≤75%。主机安装：将主机放置在实验台合适位置，调整水平脚使主机平稳。连接主机电源线，确保接地良好。检测器连接：将紫外检测器和电导检测器安装在主机指定位置，连接信号线至主机接口，确保连接牢固。收集器安装：将自动收集器放置在主机下方或侧面，连接收集器控制线至主机对应接口。管路连接：按照系统流程图连接缓冲液管路、样品管路和层析柱管路，注意管路走向应避免弯曲和缠绕。电脑连接：使用专用数据线连接主机与控制电脑，安装控制软件并进行驱动配置。系统检查：安装完成后检查各部件连接是否正确，管路是否通畅，电源是否正常。四、操作流程4.1开机与系统自检开机顺序：先打开仪器主电源，再打开电脑电源，待仪器自检完毕（主机控制面板白灯常亮）。软件启动：双击桌面上控制软件图标（如UNICORN），进入操作界面。系统检查：在软件界面检查各模块状态是否正常，包括泵、检测器、收集器等。参数校准：根据实验需要进行流速、压力和检测器校准，确保系统处于最佳工作状态。4.2实验准备4.2.1缓冲液制备根据实验方案配制所需缓冲液，包括平衡缓冲液、洗脱缓冲液等。所有缓冲液需经0.22μm或0.45μm滤膜过滤，去除颗粒物。缓冲液使用前需进行超声脱气10-15分钟，避免气泡进入系统。标记所有缓冲液瓶，注明名称、浓度、pH值和制备日期。如需储存，将缓冲液置于4℃冰箱保存，使用前需恢复至室温并重新脱气。4.2.2样品预处理样品需进行预处理，去除杂质和颗粒物：细胞裂解液需13000rpm离心10分钟，取上清上清液经0.22μm滤膜过滤对于粘稠样品，可适当稀释以降低粘度样品浓度应控制在μg/mL～mg/mL范围，避免过稀或过浓根据需要添加蛋白酶抑制剂（如PMSF）、还原剂（如DTT）和金属螯合剂（如EDTA）样品处理过程应在冰浴中进行，避免蛋白质变性4.2.3层析柱准备根据纯化目标选择合适的层析柱（如离子交换柱、亲和层析柱、凝胶过滤柱等）检查层析柱保存液，如为乙醇溶液需用平衡缓冲液冲洗至无乙醇残留记录层析柱编号、规格、最大耐受压力和推荐流速等参数按照层析柱说明书进行预处理，确保柱效符合实验要求4.3系统操作步骤4.3.1管路清洗与排气将A1管道入口放入纯水中，B1管道入口放入纯水中在systemcontrol窗口点击工具栏内的manual，选择executemanualinstructions→pump→pumpAwash和pumpBwash选中A1和B1入口，点击execute，进行泵洗，泵洗完成后自动停止检查管路中是否有气泡，如有气泡，重复清洗步骤分别对A、B管路进行单独排气：设置B路起始浓度为100%，流速0.1ml/min，压力限制0.3MPa启动泵，打开泵出口堵头，用专用抽气针管抽气待气泡排尽后关闭泵，安装好堵头4.3.2层析柱安装在manualinstructions里选择pump→systemflow，输入流速1ml/min选择Alarms→alarmprecolumnpressure，设置highalarm（根据层析柱说明书设置耐受压力）待InjectionValve的1号位管道流出溶液后，将管路接入柱子的上端稍微拧紧后将柱下端的堵头卸掉接入管道，连上紫外流动池确保连接紧密，无漏液，同时避免管路弯曲打折4.3.3系统平衡选择检测波长：Monitors→Wavelength→UV1,UV2,UV3（可选择1-4个波长）将A1管道入口放入平衡缓冲液中，B1管道入口放入洗脱缓冲液中设置流速为层析柱推荐流速的50%，开始平衡层析柱观察UV、COND数值变化趋势，待基线平稳（通常需要5倍柱体积缓冲液）紫外调零：选择Monitors→autozeroUV，execute4.3.4样品上样方法一：样品环上样将样品吸进注射器，推掉气泡，从injectionValve的3号口推入推好后不要取下注射器在manualinstructions里选择flowpath→injectionValve→inject，execute样品进入层析柱后，保持注射器连接直至上样完成方法二：泵上样将A2入口放入样品中在manualinstructions里选择flowpath→Ainlet→A2，insertflowpath→injectmark，insert，execute待样品上完后，选择flowpath→Ainlet→A1，使用平衡缓冲液继续清洗柱子4.3.5洗脱过程上样后用平衡缓冲液冲洗至穿透峰回到基线在manualinstructions里选择pump→gradient，设置洗脱参数：TargetB：设置最终洗脱缓冲液浓度（0-100%）Length：设置梯度长度（通常为10-20个柱体积）Flowrate：设置洗脱流速（根据层析柱推荐值）启动梯度洗脱程序，开始收集数据实时监测UV吸收峰和电导变化，必要时调整收集参数4.3.6样品收集固定体积收集选择Fractioncollection→Fractionation选择收集管tubetype，输入每管收集体积execute开始收集结束收集：选择Fractioncollection→Stopfractionation，execute峰收集选择Fractioncollection→PeakfractionationParameters→UVLevel设定峰收集的阈值参数选择Fractioncollection→Peakfractionation，设定每管收集体积execute开始收集结束收集：选择Fractioncollection→Stoppeakfractionation，execute4.4实验结束后处理4.4.1系统清洗将A1和B1入口放入纯水中启动pumpwash功能冲洗A泵和B泵及整个管路（至少3个柱体积）再将A1和B1入口放入20％乙醇中同样操作让乙醇充满整个管路（至少2个柱体积）4.4.2层析柱拆卸与保存给系统一个慢流速（0.5ml/min），设置系统保护压力先拆柱子的下端接头，在滴水的状态下将堵头拧上再拆柱子上端接头，拧上上端堵头将层析柱垂直放置于4℃冰箱保存，注意防止气泡进入层析柱4.4.3关机流程从软件任一窗口File命令栏中点击退出关闭主机电源关闭电脑电源清理实验台面，处理废液填写仪器使用记录五、层析技术应用指南5.1离子交换层析原理：基于蛋白质表面电荷与层析介质上带电基团之间的静电相互作用进行分离缓冲液选择：阳离子交换：通常使用pH低于目标蛋白pI的缓冲液（如磷酸缓冲液pH6.0）阴离子交换：通常使用pH高于目标蛋白pI的缓冲液（如Tris-HCl缓冲液pH8.0）上样条件：样品缓冲液离子强度应低于平衡缓冲液（通常<20mM）洗脱方式：线性梯度：0-100%洗脱缓冲液，10-20个柱体积阶梯梯度：逐步增加盐浓度（如20mM,50mM,100mM,200mM,500mMNaCl）再生条件：使用1-2MNaCl溶液冲洗，然后平衡缓冲液平衡5.2亲和层析原理：利用目标蛋白与固定化配体之间的特异性相互作用进行分离常见类型：金属螯合亲和层析（如Ni-NTA柱，用于His标签蛋白）抗体亲和层析（如ProteinA/G柱，用于抗体纯化）生物素-亲和素亲和层析上样条件：根据亲和配体特性调整缓冲液（如Ni-NTA柱常用PBS缓冲液含5-20mM咪唑）洗脱方式：竞争性洗脱：使用过量游离配体（如咪唑、生物素）改变pH值：如ProteinA柱使用pH2.5-3.0的glycine-HCl缓冲液改变离子强度：高盐溶液破坏静电相互作用再生条件：根据层析柱说明书进行，通常使用0.5-1MNaOH或盐酸胍溶液5.3凝胶过滤层析原理：根据蛋白质分子量大小进行分离，大分子先流出，小分子后流出缓冲液选择：通常使用中性pH的缓冲液（如PBS、Tris-HCl），含适当盐浓度（100-150mMNaCl）上样体积：一般为柱体积的1-5%，最大不超过10%流速设置：根据层析柱说明书推荐，通常较低（0.5-1ml/min）注意事项：样品需离心过滤，无颗粒物避免过载，影响分离效果不需要梯度洗脱，使用单一缓冲液5.4疏水层析原理：基于蛋白质表面疏水性与介质疏水基团之间的相互作用缓冲液选择：高离子强度缓冲液（如含1-2M(NH4)2SO4的磷酸缓冲液）上样条件：样品需在高离子强度条件下，可通过添加硫酸铵或氯化钠实现洗脱方式：线性梯度：降低盐浓度（1.5M至0M(NH4)2SO4）阶梯梯度：逐步降低盐浓度可添加少量有机溶剂（如乙醇、异丙醇）辅助洗脱再生条件：使用含8M尿素或6M盐酸胍的溶液冲洗，然后平衡缓冲液平衡六、系统维护与保养6.1日常维护每日检查：检查管路连接是否紧密，有无漏液检查缓冲液液位，及时补充清洁仪器表面，去除液渍每周维护：用纯水冲洗整个系统，去除残留盐检查泵头密封圈是否磨损，必要时更换清洁紫外检测器流通池每月维护：校准紫外检测器（使用标准溶液）检查所有管路是否有老化、裂纹清洁收集器托盘和管路6.2泵系统维护泵头维护：每使用50次或1个月，检查泵头密封圈如发现漏液或压力不稳，及时更换密封圈长期不用时，泵头需充满20%乙醇保存单向阀维护：每3个月或压力异常时，拆卸单向阀清洗使用超声清洗10分钟（纯水中）安装时注意方向正确密封圈更换步骤：关闭泵电源，拆卸泵头取出旧密封圈，用纯水清洁泵头安装新密封圈，注意位置正确重新安装泵头，检查是否漏液6.3检测器维护紫外检测器维护：每周用纯水冲洗流通池每月校准一次波长精度避免强光直射检测池如检测池污染，可用10%硝酸溶液浸泡30分钟，然后纯水冲洗电导检测器维护：每月校准一次电导值长期不用时，保持检测池湿润避免高浓度盐溶液长时间停留6.4层析柱维护短期保存（1周内）：离子交换柱：保存于含20%乙醇的平衡缓冲液中亲和层析柱：保存于含20%乙醇的PBS中凝胶过滤柱：保存于含0.02%叠氮化钠的缓冲液中疏水层析柱：保存于含20%乙醇的高盐缓冲液中长期保存（1个月以上）：用适当保存液冲洗层析柱（通常为20%乙醇）两端密封，垂直放置于4℃冰箱避免冻结，防止层析介质破裂层析柱再生：离子交换柱：用2-3倍柱体积的1MNaCl冲洗，然后平衡缓冲液平衡亲和层析柱：根据说明书使用再生缓冲液（如0.5MNaOH）疏水层析柱：用含8M尿素的缓冲液冲洗，然后平衡缓冲液平衡七、安全注意事项7.1操作安全个人防护：操作时必须佩戴实验服、手套和护目镜处理有毒或腐蚀性试剂时，需佩戴防毒面具避免直接接触缓冲液和样品电气安全：确保仪器接地良好避免湿手操作电源开关仪器运行时，禁止打开电源箱或电子元件盖板化学品安全：所有缓冲液和试剂需正确标记，注明名称、浓度、日期有毒有害试剂需单独存放，符合安全规范废弃试剂需分类处理，不可随意倾倒7.2系统安全压力安全：严格按照层析柱说明书设置压力限制系统运行时，禁止拆卸管路和接头如出现超压报警，立即停止系统运行，检查原因流速控制：启动泵时，应缓慢增加流速，避免压力突变更换层析柱时，需降低流速至推荐值的50%禁止超过层析柱最大耐受流速运行样品安全：生物样品需进行适当处理，防止交叉污染感染性样品需在生物安全柜内操作样品处理后，立即清洁工作台面7.3紧急情况处理漏液处理：立即停止系统运行，关闭电源用吸水纸吸干漏液，避免液体扩散检查漏液位置，重新连接或更换部件系统故障：如出现异常声音或异味，立即关闭电源记录故障现象，联系技术支持不要擅自拆卸维修仪器核心部件化学灼伤：立即用大量清水冲洗受影响部位如试剂进入眼睛，立即用水冲洗15分钟，并就医记录所用化学试剂，便于医生处理八、常见问题troubleshooting8.1压力异常压力过高：可能原因：管路堵塞、层析柱堵塞、流速设置过高解决方法：检查管路是否弯曲打折检查层析柱是否堵塞，必要时反冲或更换降低流速，检查压力是否恢复正常压力过低或无压力：可能原因：管路连接松动、泵头有气泡、密封圈磨损解决方法：检查所有连接，确保密封良好对泵进行排气操作检查泵头密封圈，必要时更换8.2基线问题基线漂移：可能原因：系统未平衡好、温度变化、缓冲液混合不均解决方法：延长平衡时间，确保系统稳定保持实验环境温度恒定充分混合缓冲液，确保均一基线噪音过大：可能原因：检测器污染、管路有气泡、电源干扰解决方法：清洁检测器流通池排除管路气泡检查电源接地，避免电磁干扰8.3峰形异常峰拖尾：可能原因：样品过载、柱效下降、pH不合适解决方法：减少上样量再生或更换层析柱调整缓冲液pH值峰分裂：可能原因：样品溶液与流动相不匹配、柱头塌陷解决方法：调整样品缓冲液组成更换层析柱或进行柱头修复峰展宽：可能原因：流速不当、柱效下降、系统体积过大解决方法：调整流速至最佳值再生或更换层析柱减少连接管路长度，优化系统8.4回收率低可能原因：目标蛋白未结合或结合不牢固洗脱条件不当蛋白在纯化过程中变性沉淀收集不完全解决方法：调整上样条件（pH、离子强度）优化洗脱缓冲液组成和梯度添加适当添加剂（如还原剂、稳定剂）检查收集器工作状态，确保收集完全8.5样品污染可能原因：缓冲液污染系统清洗不彻底层析柱残留操作环境不洁净解决方法：使用新鲜制备的缓冲液，过滤除菌加强系统清洗，必要时进行消毒处理彻底再生层析柱，去除残留样品在洁净工作台操作，减少污染风险九、软件操作指南9.1软件界面介绍主界面：包含菜单栏、工具栏、系统状态显示区、实时监测区和方法编辑区菜单栏：文件、编辑、视图、运行、方法、报告、工具、帮助工具栏：常用功能快捷键，如新建方法、运行、暂停、停止、保存等系统状态显示区：显示各模块工作状态，如泵、检测器、收集器等实时监测区：显示UV、电导等实时检测曲线方法编辑区：用于编辑和显示层析方法参数9.2方法建立与编辑新建方法：点击工具栏"新建方法"按钮选择层析类型（离子交换、亲和、凝胶过滤等）选择层析柱类型和规格系统自动生成方法模板参数设置：流速设置：根据层析柱推荐值设置梯度设置：选择梯度类型（线性、阶梯），设置起始和终点浓度，梯度时间检测参数：选择检测波长、灵敏度收集参数：选择收集方式（时间、体积、峰值），设置收集参数方法保存与调用：点击"保存"按钮，输入方法名称和描述调用方法：从方法库中选择已保存方法，点击"加载"9.3数据采集与处理数据采集：运行方法前，设置数据保存路径和文件名点击"运行"按钮，开始数据采集实时显示UV吸收曲线、电导曲线等实验过程中可添加事件标记数据分析：实验结束后，自动生成色谱图峰识别：自动或手动识别色谱峰积分计算：自动计算峰面积、峰高、保留时间等参数纯度分析：计算目标峰占总峰面积百分比报告生成：点击"生成报告"按钮，选择报告模板报告内容包括：实验条件、色谱图、峰参数、纯度分析等支持导出为PDF、Excel等格式可自定义报告格式和内容9.4系统诊断与维护系统自检：在"工具"菜单中选择"系统自检"系统自动检查各模块工作状态生成自检报告，提示异常模块校准功能：紫外检测器校准：使用标准溶液进行波长和吸光度校准流速校准：使用称重法或体积法校准泵流速压力校准：使用标准压力计校准压力传感器维护提醒：软件自动记录各部件使用次数和时间到达维护周期时，弹出提醒窗口显示维护项目和操作指南十、应用实例10.1重组蛋白纯化（His标签）层析柱选择：Ni-NTA亲和层析柱（5ml）缓冲液配制：平衡缓冲液：PBS缓冲液（pH7.4）含20mM咪唑洗脱缓冲液：PBS缓冲液（pH7.4）含500mM咪唑样品制备：细菌裂解液经13000rpm离心10分钟上清液经0.45μm滤膜过滤加入PMSF（终浓度1mM）和DTT（终浓度5mM）纯化步骤：系统平衡：平衡缓冲液以1ml/min流速平衡层析柱（5个柱体积）上样：样品以1ml/min流速上样洗涤：平衡缓冲液洗至UV基线平稳（3-5个柱体积）洗脱：0-100%洗脱缓冲液线性梯度洗脱（20个柱体积）收集：按UV峰值收集洗脱峰（280nm检测）再生步骤：用500mM咪唑洗脱缓冲液冲洗（3个柱体积）用PBS缓冲液平衡（5个柱体积）用含20%乙醇的PBS缓冲液保存层析柱10.2抗体纯化（ProteinA）层析柱选择：ProteinA亲和层析柱（1ml）缓冲液配制：平衡缓冲液：PBS缓冲液（pH7.4）洗脱缓冲液：0.1Mglycine-HCl（pH2.7）中和缓冲液：1MTris-HCl（pH8.0）样品制备：细胞培养上清经0.22μm滤膜过滤用1MHCl调节pH至7.0-7.4纯化步骤：系统平衡：平衡缓冲液以0.5ml/min流速平衡层析柱（5个柱体积）上样：样品以0.5ml/min流速上样洗涤：平衡缓冲液洗至UV基线平稳（5个柱体积）洗脱：洗脱缓冲液以0.5ml/min流速洗脱收集：按UV峰值收集洗脱峰，每管加入50μl中和缓冲液再生步骤：用0.1Mglycine-HCl（pH2.0）冲洗（3个柱体积）用平衡缓冲液平衡（5个柱体积）用含0.02%叠氮化钠的PBS缓冲液保存10.3蛋白质脱盐层析柱选择：凝胶过滤脱盐柱（如PD-10或HiPrep26/10Desalting）缓冲液配制：平衡缓冲液：目标缓冲液（如PBS、Tris-HCl等）样品制备：浓缩样品至适当体积（PD-10柱通常为2.5ml）离心去除沉淀（13000rpm，5分钟）纯化步骤：系统平衡：平衡缓冲液以5ml/min流速平衡层析柱（3个柱体积）上样：将样品小心加至柱床表面中央洗脱：用平衡缓冲液洗脱，流速5ml/min收集：按固定体积收集（通常每管1ml）注意事项：上样时避免扰动柱床表面样品体积不超过柱床体积的1/3收集液需检测蛋白峰（280nm）和盐峰（电导检测）10.4蛋白质分子量测定层析柱选择：凝胶过滤层析柱（如Superdex20010/300GL）缓冲液配制：流动相：PBS缓冲液（pH7.4）含150mMNaCl标准品与样品制备：标准蛋白混合物：包含已知分子量的蛋白质（如甲状腺球蛋白669kDa，铁蛋白440kDa，醛缩酶158kDa，卵清蛋白44kDa，溶菌酶14.4kDa）样品：纯化的目标蛋白（浓度1-2mg/ml）测定步骤：系统平衡：流动相以0.5ml/min流速平衡层析柱（2个柱体积）标准品上样：注入50μl标准蛋白混合物洗脱：流动相以0.5ml/min流速洗脱，记录各标准蛋白保留时间样品上样：注入50μl样品溶液洗脱：同标准品洗脱条件数据分析：以标准蛋白分子量对数对保留体积作图，得到标准曲线根据样品保留体积，从标准曲线计算分子量比较样品峰与标准品峰，评估样品纯度和均一性十一、附录11.1常用缓冲液配制表缓冲液名称浓度配制方法PBS缓冲液0.01M