生物学实验操作规范及常见名词解释

生物学实验操作规范及常见名词解释生物学实验是探索生命规律、验证科学假说的核心手段，其操作规范的严格执行与专业术语的准确理解，是保障实验结果可靠性、重复性及人员安全的关键。本文从实验操作全流程规范与核心专业名词解析两方面，为生物学研究者提供实用参考。一、生物学实验操作规范（一）实验前准备阶段实验开展前的准备工作需从试剂耗材、仪器设备、个人防护、实验设计四个维度严格把控：1.试剂与耗材核查需确认试剂的有效期、纯度及储存条件是否合规。例如，分子实验中RNA酶污染会导致RNA降解，需使用DEPC处理的耗材并在无RNA酶环境操作；细胞培养用胎牛血清需观察是否出现沉淀或浑浊，避免使用变质血清影响细胞生长。耗材需检查灭菌状态（如移液枪头、细胞培养板的灭菌标识），一次性耗材严禁重复使用。2.仪器设备校准与调试关键仪器需提前校准：移液器需通过称重法验证移液体积准确性（如吸取10μL水，称重后换算体积是否偏差≤1%）；离心机需确认转速稳定性，避免离心力不均导致样本分层异常；PCR仪需校准温度准确性，防止扩增效率受温度偏差影响。调试后需记录仪器状态，异常设备需及时报修。3.个人防护与环境准备实验人员需根据实验风险选择防护装备：处理致病微生物（如BSL-2级菌株）时需佩戴N95口罩、护目镜及一次性防护服；细胞培养需戴无菌手套并定期消毒超净台（75%乙醇擦拭台面，紫外照射30分钟）。实验环境需提前清洁，超净台需开启风机运行15分钟以上，确保气流稳定。4.实验设计与预实验需明确实验目的、变量控制及对照设置：如药物处理细胞实验需设置空白对照（不加药物）、溶剂对照（含药物溶剂）；动物实验需遵循“3R”原则（替代、减少、优化），并通过预实验确定样本量与处理浓度。实验方案需提前撰写，包含操作步骤、预期结果及应急预案（如细胞污染后的处理流程）。（二）实验操作阶段实验过程需遵循无菌操作、精准操作、样本保护、即时记录四大原则：1.无菌操作规范细胞培养、微生物接种等实验需在超净台内进行，操作时保持“酒精灯火焰区”无菌环境：接种环需灼烧至红热后冷却（避免烫死菌体），瓶口需在火焰上旋转灭菌；细胞培养液需避免反复开盖，吸管头不可接触非无菌区域。若不慎污染（如培养基出现浑浊），需立即标记并高压灭菌处理，严禁继续实验。2.操作精准性控制移液器使用需“慢吸快放”：吸取液体时缓慢松开按钮，避免气泡产生；排液时贴壁并等待1-2秒，确保液体完全排出。微量操作（如PCR加样）需使用带滤芯枪头，防止气溶胶污染导致样本交叉污染。离心操作需平衡样本（对称放置离心管），避免离心机失衡损坏。3.样本保护与处理核酸/蛋白样本需全程冰浴（如RNA提取时使用预冷的Trizol），避免酶降解；组织样本需快速液氮冻存或固定（如4%多聚甲醛固定组织，防止自溶）。样本分装需标注“名称、浓度、日期、操作者”，避免混淆。4.实验记录的规范性需使用专用实验本，记录内容包括“日期、实验目的、操作步骤、试剂批号、仪器参数、原始数据（如吸光度值、细胞计数结果）”。记录需即时、准确，严禁事后补记或涂改，数据异常需标注原因（如“样本污染，结果无效”）。（三）实验后处理阶段实验结束后需完成废弃物处理、仪器维护、环境清洁三项工作：1.废弃物分类处理生物危害物（如培养的细胞、带菌培养基）需经121℃、30分钟高压灭菌后丢弃；化学废液（如EB染液、甲醛）需分类收集（酸性、碱性、有机废液分开），粘贴标签后移交专业机构处理；锐器（如针头、刀片）需放入专用锐器盒，严禁随意丢弃。2.仪器设备维护移液器需调回最大量程并定期清洁（如使用酒精棉擦拭枪头圆锥部）；离心机需清空转子并清洁内腔，登记使用时长；超净台需关闭风机前喷洒75%乙醇，开启紫外照射30分钟。贵重仪器需填写使用登记本，记录使用时间、故障情况。3.实验环境清洁工作台面需用消毒液（如0.1%新洁尔灭）擦拭，实验服需及时清洗；细胞培养间需定期监测CO₂浓度、湿度，更换HEPA滤网；实验室垃圾需日产日清，避免滋生微生物。二、生物学常见名词解释（一）细胞生物学类1.原代培养（PrimaryCulture）从动物或植物组织中直接分离细胞后进行的首次体外培养。实验中需注意组织消化时间（如小鼠肝组织用胶原酶消化30分钟），过短细胞分离不充分，过长则损伤细胞活性。原代细胞保留组织特异性，但传代能力有限（通常≤10代）。2.传代培养（Subculture）当原代细胞生长至汇合度80%左右时，通过胰酶消化、离心重悬后接种至新培养瓶的操作。需控制传代比例（如1:2~1:4传代），避免细胞密度过低或过高影响生长。3.细胞系（CellLine）原代细胞经传代后形成的细胞群体，部分细胞系可无限传代（如HeLa细胞系），但可能伴随遗传变异。实验中需定期检测细胞系的STR（短串联重复序列），确认未发生交叉污染。4.细胞株（CellStrain）从细胞系中筛选出的具有特定性状（如耐药性、荧光标记）的细胞群体，遗传背景相对稳定，需在培养基中添加特定因子（如抗生素）维持表型。（二）分子生物学类1.PCR（聚合酶链式反应）体外扩增DNA片段的技术，通过“变性（95℃使DNA解旋）、退火（低温使引物结合模板）、延伸（72℃使Taq酶合成新链）”三步循环实现DNA指数级扩增。实验中需注意引物特异性（避免非特异性扩增）、模板质量（无蛋白酶/核酸酶污染）。2.qPCR（实时荧光定量PCR）在PCR过程中通过荧光信号实时监测扩增产物量，用于定量基因表达水平。需设置标准曲线（稀释已知浓度的模板），并通过熔解曲线分析产物特异性（单一峰表示无引物二聚体）。3.RT-PCR（反转录PCR）将RNA反转录为cDNA后进行PCR扩增，用于检测RNA病毒或基因表达。实验需使用RNase抑制剂（如RNasin）防止RNA降解，反转录引物可选择Oligo(dT)（针对mRNA）或随机六聚体（针对总RNA）。4.质粒（Plasmid）细菌中独立于染色体的环状双链DNA，可作为基因载体（如pET系列质粒用于蛋白表达）。质粒提取需去除染色体DNA、RNA及蛋白，常用碱裂解法或试剂盒法，纯度可通过OD260/OD280比值判断（纯质粒比值约1.8）。（三）微生物学类1.菌落（Colony）单个微生物细胞在固体培养基上繁殖形成的肉眼可见群体，可通过菌落形态（大小、颜色、边缘）初步鉴定菌种（如金黄色葡萄球菌菌落为金黄色、圆形、光滑）。2.菌苔（Lawn）大量微生物在培养基表面密集生长形成的连续菌层，常用于噬菌体效价测定（通过噬菌斑计数）或药敏试验（菌苔上的抑菌圈表示药物敏感性）。3.培养基（Medium）人工配制的供微生物/细胞生长的营养基质，分为固体（加琼脂）、液体（不加琼脂）两类。如LB培养基用于大肠杆菌培养，RPMI-1640用于哺乳动物细胞培养，需根据菌种/细胞类型添加血清、抗生素等。4.选择培养基（SelectiveMedium）抑制杂菌生长、促进目标菌繁殖的培养基，如含氨苄青霉素的LB培养基可筛选含氨苄抗性基因的重组菌；麦康凯培养基可抑制革兰氏阳性菌，筛选革兰氏阴性菌。（四）生物安全类1.生物安全等级（BSL）根据病原体的致病性、传播途径划分的实验室防护等级：BSL-1适用于无害微生物（如大肠杆菌K-12），BSL-2适用于中度危害微生物（如金黄色葡萄球菌），BSL-3/4适用于高致病性微生物（如SARS-CoV-2、埃博拉病毒），需在相应等级实验室操作。2.生物危害标志（BiohazardSymbol）用于标识含生物危害物的容器、设备或区域，提醒人员采取防护措施。实验中需在高压灭菌袋、生物安全柜上粘贴该标志。3.气溶胶（Aerosol）悬浮于空气中的微小液滴或颗粒，可能携带微生物或核酸，需通过“避免剧烈振荡、使用带滤芯枪头、在生物安全柜内操作”等方式防止气溶胶污染。（五）实验技术类1.WesternBlot（蛋白质印迹）检测蛋白质表达的技术，流程为“蛋白电泳→转膜→封闭→一抗孵育→二抗孵育→显影”。需注意转膜电流/时间（如恒压200V转30分钟）、封闭液选择（5%脱脂奶或BSA，后者适用于磷酸化蛋白检测）。2.ELISA（酶联免疫吸附试验）定量检测抗原/抗体的方法，分为直接法、间接法、夹心ELISA。实验需控制孵育温度（37℃或4℃过夜）、洗涤次数（每次3-5分钟，洗板机需确保孔内无残留液体），避免非特异性结合。3.流式细胞术（FlowCytometry）分析细胞表型、凋亡、周期的技术，需将细胞制成单细胞悬液，加入荧光抗体或染料（如PI染核），通过激光检测荧光信号。实验前需优化染色浓度，避免自发荧光干扰。4.免疫荧光（Immunofluorescence）定位细胞内蛋白的技术，流程为“细胞固定→通透→封闭→一抗→荧光二抗→封片”。需注意通透剂选择（如0.1%TritonX-100）、封片液含防淬灭剂（延长荧光寿命），拍照时需控制曝光时间，避免过曝。三、总结与建议生物学实验的规范性是科研