酵母双杂交实验步骤及注意事项

酵母双杂交实验步骤及注意事项酵母双杂交系统作为解析蛋白质相互作用的经典技术，凭借其在活细胞内模拟天然互作环境、无需纯化蛋白的优势，广泛应用于信号通路解析、药物靶点筛选等领域。精准的实验操作与对关键环节的把控，是获得可靠互作数据的核心。本文将从载体构建、酵母转化到结果验证，系统阐述实验流程，并针对常见问题提供实操建议。一、实验前的关键准备（一）载体与菌株选择根据研究目标选择适配的载体系统：诱饵载体（如pGBKT7）需携带DNA结合域（BD，如Gal4-BD）与营养筛选标记（如Trp⁺）；猎物载体（如pGADT7）则融合转录激活域（AD，如Gal4-AD）与另一筛选标记（如Leu⁺）。菌株选择需匹配报告基因类型，如AH109含His3、Ade2、LacZ三重报告基因，适合高严谨性筛选；Y187则更适配LacZ单报告系统。（二）试剂与耗材质控培养基：YPD（酵母完全培养基）、SD系列缺陷培养基（-Trp、-Leu、-His、-Ade等）需新鲜配制，葡萄糖作为碳源时需单独灭菌后添加，避免高温分解。转化辅助试剂：PEG4000（分子量需精准，避免杂质影响）、醋酸锂（LiAc）需用超纯水配制，鲑鱼精DNA（载体DNA）需经煮-冻-煮法处理以去除蛋白，-20℃分装保存。二、实验核心步骤（一）诱饵与猎物载体构建1.目的基因扩增以cDNA为模板（避免基因组DNA的内含子干扰），设计含酶切位点（如EcoRI/BamHI）的引物，确保目的基因与载体读码框完全匹配（可通过SnapGene等软件模拟翻译后序列）。PCR产物经胶回收后，与经相同酶切的载体进行T4连接（16℃过夜或快速连接酶处理）。2.重组质粒验证连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂布含抗生素的LB平板（如Amp⁺）。挑取单克隆进行菌落PCR或酶切验证，阳性克隆送测序（需覆盖连接区域，确认无移码或突变）。提取质粒时，优先选择无内毒素的试剂盒（如EndoFreePlasmidKit），保证DNA纯度（OD₂₆₀/₂₈₀≈1.8~2.0）。（二）酵母感受态制备与转化1.菌株活化从-80℃甘油菌中取50μL接种至5mLYPD液体培养基，30℃、200rpm振荡培养12~16h至对数期（OD₆₀₀≈0.6~0.8，菌液呈轻微浑浊）。取1mL活化菌液转接至50mLYPD，继续培养3~4h至OD₆₀₀≈0.4~0.6（确保细胞活力）。2.醋酸锂法转化离心收集酵母（5000rpm，5min），用10mL无菌水重悬洗涤，再用1mLLiAc/TE（0.1MLiAc，10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH7.5）重悬，制成感受态细胞。取100μL感受态细胞，加入诱饵质粒（1~5μg）、猎物质粒（1~5μg）、鲑鱼精DNA（50μg，变性后）、500μLPEG/LiAc（40%PEG4000，0.1MLiAc，10mMTris-HCl，1mMEDTA），涡旋混匀后30℃静置30min。42℃热激25~30min（温度需精准，避免热死细胞），冰浴2min终止反应。离心（5000rpm，5min）弃上清，用1mLYPD重悬，30℃静置复苏2h（让细胞修复转化损伤）。（三）筛选与互作验证1.初筛共转化子将复苏后的菌液涂布于SD/-Trp/-Leu双缺培养基（筛选同时含BD和AD质粒的酵母），30℃倒置培养2~3天。若菌落生长过密，可梯度稀释后涂布，确保单菌落清晰。2.互作依赖性筛选用灭菌牙签挑取双缺平板上的单菌落，点种（或影印）至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade四缺培养基（或添加AbA、X-α-Gal的选择性平板）。若蛋白存在互作，报告基因（His3、Ade2、LacZ）会被激活：生长验证：四缺平板上菌落生长（阴性对照，如空载体组合应无菌落）；显色验证：X-α-Gal平板上菌落呈蓝色（LacZ酶解底物显色）；抗性验证：AbA（AureobasidinA）平板上菌落生长（Ade2激活后酵母对AbA耐受）。3.假阳性排除对疑似阳性克隆进行反向验证：将诱饵质粒与空AD载体共转化，或猎物质粒与空BD载体共转化，若仍在四缺平板生长，则为假阳性（可能因诱饵自激活或猎物非特异性结合）。此外，可通过β-半乳糖苷酶活性定量（如ONPG法）比较互作强度，活性值需显著高于阴性对照（至少3倍以上）。三、关键注意事项与问题解决（一）读码框与自激活控制读码框验证：载体多克隆位点的读码框需与目的基因严格匹配（如pGBKT7的NdeI位点为ATG起始，需确保目的基因第一个密码子与ATG后序列连续）。可通过“载体-基因”融合序列的翻译预测，避免移码导致的无义蛋白。自激活检测：实验前需将诱饵质粒单独转化酵母，涂布四缺或AbA平板。若菌落生长，说明诱饵蛋白自身可激活报告基因，需通过截短功能域（如删除转录激活域同源序列）、点突变（破坏潜在的转录激活基序）或换用弱启动子载体（如pBridge的MET25启动子）解决。（二）酵母状态与转化效率菌株活力：仅对数期酵母（OD₆₀₀0.4~0.8）可高效转化，若菌液过浓（OD₆₀₀>1.0），需稀释后重新培养。培养基需无杂菌污染（可通过“空白培养基培养”验证，若有菌落则需重新灭菌）。转化条件优化：PEG浓度（40%最佳）、热激时间（25~30min）、载体DNA用量（50μg鲑鱼精DNA可提高转化效率2~3倍）需严格控制。若转化效率低，可尝试“分步转化”：先转诱饵质粒，筛选后再转猎物质粒（适用于毒性蛋白或高拷贝载体）。（三）假阳性与假阴性应对假阳性：多由非特异性结合、转录因子泄漏导致。可通过多报告基因筛选（如同时依赖His、Ade、LacZ）、回复突变验证（突变互作关键位点后互作消失）、生理相关性验证（如已知互作的阳性对照需同时阳性）降低假阳性率。假阴性：可能因蛋白表达量低、翻译后修饰缺失（如哺乳动物蛋白的磷酸化修饰在酵母中无法完成）。可尝试共表达分子伴侣（如Hsp70/Hsp90）促进蛋白折叠，或换用哺乳动物细胞双杂交系统（如基于LexA的系统）。（四）试剂与操作细节质粒纯度：内毒素会抑制酵母转化，需用无内毒素试剂盒提取质粒，或通过“酚-氯仿抽提”进一步纯化。培养基保存：SD培养基需避光保存（避免色氨酸降解），且需现配现用（放置超过1周的培养基可能因营养耗尽影响生长）。无菌操作：所有操作需在超净台内完成，接种针/牙签需灼烧灭菌，避免细菌或真菌污染（污染菌在SD缺陷培养基上一般不生长，可通过“形态观察”区分：酵母菌落圆润、乳白；细菌菌落扁平、透明）。四、实验结果的解读与拓展阳性克隆需结合生物信息学分析（如蛋白结构域预测，确认互作区域合理性）、体外验证（如Pull-down、Co-IP）等技术交叉验证，避免“酵母内互作”与“生理环境互作”的偏差。若需研究弱互作或瞬时互作，可通过酵母单杂交（研究蛋白与DNA互作）、三杂交