奇果菌素介导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制探究：靶向Akt-mTOR-S6K通路的抗癌新策略

奇果菌素介导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制探究：靶向Akt/mTOR/S6K通路的抗癌新策略一、引言1.1研究背景1.1.1卵巢癌的严峻现状卵巢癌作为妇科恶性肿瘤中致死率最高的疾病，严重威胁着女性的生命健康。根据国家癌症中心2022年发布的肿瘤数据，卵巢癌已取代宫颈癌，成为我国妇科癌症造成患者死亡的第二大死因。其发病率位居女性生殖系统恶性肿瘤第3位，每年我国约有52100例女性被确诊为卵巢癌，约22500例女性死于卵巢癌，死亡率接近50%。上皮性卵巢癌约占卵巢原发恶性肿瘤的85％-90％，其5年生存率不足40％。卵巢癌的早期诊断困难重重。卵巢位于盆腔深处，体积较小，成年女性正常卵巢大小为直径2cm-3cm，肿瘤在初期难以被直接观察和触及。而且卵巢癌早期通常缺乏典型症状，可能仅出现一些如食欲不振、腹胀、恶心等消化道症状，这些症状极易与普通消化道疾病混淆，导致诊断延误。同时，目前针对卵巢癌的筛查方法，如超声检查、血清肿瘤标志物检查等，都存在一定的局限性，不能保证100%的准确性，容易出现漏诊或误诊的情况。部分卵巢癌还与遗传因素相关，如BRCA基因突变等，这也增加了早期发现和预防的难度。即使卵巢癌患者能够被确诊并接受治疗，后续的复发和耐药问题依然棘手。70%的卵巢癌患者初始治疗后三年内会复发，82%的晚期患者治疗后会出现肿瘤复发。大多数患者在治疗过程中会因为化疗耐药而很快出现局部复发及远处转移，化疗耐药成为卵巢癌治疗中的一大难题，使得“生命不息，化疗不止”成为许多复发卵巢癌患者不得不面对的困境，给患者及其家庭带来了沉重的生理、心理和经济负担。因此，寻找新的治疗策略和药物迫在眉睫。1.1.2自噬与肿瘤的复杂关联自噬是真核生物中高度保守的依赖于溶酶体的降解过程，在维持细胞物质代谢、内环境稳定及基因组完整性等方面发挥着至关重要的作用。细胞在面临饥饿、缺氧等应激状态时，会通过自噬作用对受损的细胞器或生物大分子物质进行降解，将其分解为氨基酸等小分子物质，这些小分子物质可以被细胞重新利用，为细胞提供能量，维持细胞的正常生命活动。自噬的过程主要包括自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及内容物的降解等步骤，其中涉及到一系列自噬相关基因（ATG基因）的调控。自噬与肿瘤的关系呈现出复杂的两面性。在肿瘤发生的早期阶段，自噬被认为具有抑制肿瘤的作用。许多研究表明，自噬相关基因的缺失或功能异常与肿瘤的发生发展密切相关。例如，在乳腺癌中，常见BECN1（beclin-1，编码ATG6）等位基因缺失丢失，BECN1基因全身半合子小鼠会有肝、肺、淋巴组织肿瘤形成；在Atg7敲除小鼠模型中，由于肝脏的自噬功能丧失会导致组织破坏-再生循环，频繁出现的肝祖细胞推动肝肿瘤早期阶段的发生。肿瘤抑制因子p53也能够以多种方式调控自噬，生理状态下，胞质中p53抑制自噬，但发生DNA损伤等细胞应激时，p53表达水平升高，会刺激各种促进自噬的基因激活，如DRAM1（编码受损自噬调节剂1）、PRKAB1（编码AMPK），从而抑制肿瘤的发生。自噬可以通过清除细胞内的活性氧（ROS）来维持基因组的稳定性，ROS会导致DNA损伤，有诱导肿瘤发生的风险，而线粒体自噬、过氧化物酶自噬等选择性自噬方式是消除ROS应激的关键机制。通过自噬维持适当水平的p62也具有关键的肿瘤抑制作用，因为肿瘤中的p62可以激活NF-κB和NRF2通路，这两个通路都具有促肿瘤效应。随着肿瘤的发展，自噬在某些情况下又会促进肿瘤的生长和转移。在肿瘤快速生长阶段，肿瘤细胞对氧气和营养物质的需求大幅增加，而肿瘤内部往往存在营养缺乏和低氧胁迫的微环境。此时，自噬作为细胞应激状态下提供营养物质的重要途径，可以帮助肿瘤细胞对抗这种不利环境，保护肿瘤细胞避免凋亡或坏死的发生。在KRAS基因突变激活的小鼠模型中，肿瘤细胞增殖和生长增强，对能量的需求增加，特别是在肿瘤血管化不良区域、在外源性营养剥夺情况下，RAS基因会驱动自噬进行自我消化来减轻营养负担，从而维持并促进肿瘤发展。虽然肿瘤细胞的代谢合成主要为糖酵解，但某些特定的合成代谢反应仍然需要线粒体功能，特别是谷氨酰胺代谢，而通过线粒体自噬来维持线粒体完整，也是肿瘤发展的重要机制。自噬还可以减少细胞失巢凋亡的发生，提高肿瘤细胞的转移能力。细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触会诱发失巢凋亡，扩散的肿瘤细胞必须具备抗失巢凋亡的能力才能脱离原发灶并在转移过程中存活，研究发现，细胞脱离细胞外基质时，自噬被激活而帮助细胞抵抗凋亡，用RNA干扰技术敲低Atg5或Atg7的表达，抑制细胞自噬，能促进肿瘤细胞的失巢凋亡。化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量受损的蛋白质和细胞器等有害成分，此时自噬活性提高，及时清除有害物质并提供应急的原料和能量，为DNA损伤修复提供条件，导致肿瘤治疗预后较差。在卵巢癌的研究中，自噬同样扮演着重要角色。深入探究自噬在卵巢癌发生、发展以及耐药过程中的作用机制，对于开发新的治疗靶点和策略具有重要意义。若能明确如何调控自噬使其发挥抑制卵巢癌的作用，或者抑制自噬对卵巢癌的促进作用，将为卵巢癌的治疗带来新的突破。1.1.3奇果菌素的研究进展奇果菌素（grifolin）是从传统中草药奇果菌中分离出的一种多糖，近年来，其在生物医药领域的研究逐渐受到关注。大量研究表明，奇果菌素具有多种生物活性。在抗炎方面，它能够调节炎症相关信号通路，抑制炎症因子的释放，减轻炎症反应对机体的损伤。在杀菌领域，奇果菌素对多种细菌具有抑制作用，可破坏细菌的细胞壁或细胞膜结构，干扰细菌的正常代谢，从而达到杀菌的效果。在免疫调节方面，奇果菌素能够增强机体的免疫功能，促进免疫细胞的增殖和活化，提高机体对病原体的抵抗力。尤其值得关注的是，奇果菌素展现出了显著的抗癌特性。研究发现，奇果菌素能够诱导多种癌细胞发生死亡，包括骨肉瘤U2OS细胞、子宫颈癌细胞、宫颈癌HeLa细胞等。在骨肉瘤U2OS细胞的研究中，奇果菌素能够抑制细胞的生长，诱导细胞凋亡。通过MTT法检测发现，不同浓度的奇果菌素处理U2OS细胞24h后，细胞数明显减少，当奇果菌素浓度为50.0μm时，细胞的生长率仅为(32.5±2.9)％。在荧光显微镜下观察到，经奇果菌素处理12h后的U2OS细胞，凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部，细胞变圆，体积缩小，表面粗糙，胞核缩小，呈强蓝色荧光，可见染色质浓缩呈斑块状，出现凋亡小体，呈现典型的凋亡细胞形态。流式细胞仪检测结果也表明，50.0μm的奇果菌素作用U2OS细胞12h后，诱导细胞凋亡明显增加。在对子宫颈癌细胞和宫颈癌HeLa细胞的研究中，同样发现奇果菌素能够通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的生长，并且通过蛋白质组学研究鉴定出了多种与奇果菌素促进宫颈癌HeLa细胞凋亡相关的蛋白质，如塌陷反应介导蛋白1（CRMP-1）、转胶蛋白2（Transgelin-2）、磷酸化应激诱导蛋白1（StIP1）、腺苷酸环化酶（ATPase）、磷酸甘油酸变位酶1（PGM-1）和原肌球蛋白4（TPM-4）等，其中StIP1表达下调，其他蛋白均上调。这些研究成果提示奇果菌素在抗癌治疗方面具有巨大的潜力。鉴于卵巢癌目前治疗的困境，奇果菌素诱导癌细胞死亡的特性为卵巢癌的治疗研究提供了新的方向。探究奇果菌素对卵巢癌细胞的作用及其机制，有望为卵巢癌的治疗开发出一种新的、有效的药物或治疗策略，为卵巢癌患者带来新的希望。1.2研究目的与意义1.2.1研究目的本研究旨在深入探究奇果菌素诱导卵巢癌细胞发生自噬性死亡的具体机制。通过细胞实验和分子生物学技术，观察奇果菌素对卵巢癌细胞自噬相关蛋白表达、自噬小体形成以及细胞存活、增殖和凋亡等生物学行为的影响。进一步分析奇果菌素诱导自噬性死亡过程中涉及的信号通路，明确关键的调控分子和作用靶点，为阐明奇果菌素的抗癌机制提供理论依据，也为后续开发基于奇果菌素的卵巢癌治疗策略奠定基础。1.2.2研究意义卵巢癌作为严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，其治疗现状亟待改善。目前卵巢癌的早期诊断困难，患者确诊时往往已处于晚期，且治疗后复发率高、耐药问题突出，导致患者的5年生存率较低。因此，寻找新的治疗靶点和有效的治疗药物成为卵巢癌研究领域的关键任务。自噬作为细胞内重要的物质分解代谢过程，在卵巢癌的发生、发展和治疗耐药中发挥着复杂而关键的作用。深入研究自噬与卵巢癌的关系，有助于揭示卵巢癌的发病机制，为卵巢癌的治疗提供新的思路和方法。奇果菌素作为一种具有多种生物活性的天然多糖，尤其是其显著的抗癌特性，为卵巢癌的治疗研究带来了新的希望。本研究聚焦于奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制，具有重要的理论和实际意义。在理论方面，通过本研究可以进一步丰富对奇果菌素抗癌机制的认识，拓展对自噬在肿瘤细胞中作用机制的理解，为研究天然产物抗癌机制提供新的视角和理论基础，填补相关领域在奇果菌素与卵巢癌细胞自噬关系研究上的空白，推动肿瘤生物学和天然药物学的发展。在实际应用方面，明确奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制，有可能发现新的治疗靶点。这不仅为开发新型的卵巢癌治疗药物提供科学依据，提高卵巢癌的治疗效果，降低复发率和死亡率，改善患者的预后和生活质量，还能为卵巢癌患者带来新的治疗选择，减轻患者及其家庭的负担，具有重要的社会意义和经济价值。同时，对于天然产物在癌症治疗领域的应用推广也具有积极的推动作用，为其他癌症的治疗研究提供借鉴和参考。二、卵巢癌细胞自噬及奇果菌素的相关理论基础2.1自噬的概述2.1.1自噬的概念与分类自噬是真核细胞中一种高度保守的“自体消化”过程，旨在维持细胞内环境的稳态。在正常生理条件下，细胞内的物质和细胞器处于不断更新的状态，自噬通过对受损、衰老或多余的蛋白质、细胞器等进行降解和回收利用，为细胞提供必要的营养物质和能量，确保细胞各项功能的正常运行。当细胞面临饥饿、缺氧、氧化应激等外界刺激时，自噬作用会被显著激活，以帮助细胞应对不利环境，维持生存。根据底物进入溶酶体途径的不同，自噬主要可分为巨自噬（macroautophagy）、微小自噬（microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediatedautophagy，CMA）。巨自噬是最为常见的一种自噬形式，在细胞内，一些膜性结构如内质网、高尔基体等会延伸并包裹待降解物，形成具有双层膜结构的自噬小体（autophagosome）。自噬小体形成后，会逐渐与溶酶体融合，形成自噬溶酶体（autolysosome）。在自噬溶酶体中，溶酶体酶发挥作用，将自噬小体内的内容物降解为小分子物质，这些小分子物质可被细胞重新吸收利用，参与细胞的代谢过程。微小自噬则是溶酶体的膜直接向内凹陷，包裹细胞内的物质，然后在溶酶体内进行降解。这种自噬方式相对较为直接，不需要形成典型的自噬小体结构。分子伴侣介导的自噬具有高度的选择性，它借助细胞内的分子伴侣蛋白，如热休克蛋白70（Hsc70）等，特异性地识别并结合带有特定氨基酸序列（如KFERQ样基序）的靶蛋白。这些结合了靶蛋白的分子伴侣复合物会与溶酶体膜上的受体蛋白（如LAMP2A）相互作用，从而将靶蛋白转运到溶酶体腔中进行消化降解。从对降解底物选择性的角度来看，自噬又可分为选择性自噬和非选择性自噬。非选择性自噬通常以随机的方式摄取细胞质中的物质进行降解，当细胞处于营养剥夺等状态时，为了维持基本的生命活动，细胞会通过非选择性自噬大量降解细胞质中的物质，以获取能量和营养。选择性自噬则是自噬体有目的地吞噬特定的细胞成分，线粒体自噬（mitophagy）专门清除受损或多余的线粒体，维持细胞内线粒体的质量和数量稳定，因为线粒体在细胞能量代谢和凋亡调控中起着关键作用，受损线粒体的积累会导致细胞功能异常；内质网自噬（reticulophagy）负责降解内质网中错误折叠的蛋白质或多余的内质网片段，内质网是蛋白质合成和加工的重要场所，内质网功能异常会引发内质网应激，进而影响细胞的正常生理功能。选择性自噬对于维持细胞内特定细胞器和生物大分子的稳态至关重要，确保细胞在各种生理和病理条件下能够正常运作。巨自噬和微小自噬都既可以是选择性的，也可以是非选择性的，它们在不同的生理和病理情况下，根据细胞的需求，对底物进行有针对性或随机性的降解。2.1.2自噬的生理功能自噬在细胞的生理过程中发挥着不可或缺的作用，对维持细胞的正常功能和内环境稳定具有重要意义。自噬能够有效清除受损的细胞和细胞器。在细胞的生命活动中，细胞器会不可避免地受到各种因素的损伤，如氧化应激、代谢产物积累等。受损的线粒体、内质网等细胞器如果不及时清除，会释放有害物质，干扰细胞的正常代谢，甚至引发细胞凋亡。自噬通过识别并包裹这些受损细胞器，将其运输到溶酶体进行降解，从而维持细胞内环境的稳定，保证细胞各项生理功能的正常进行。细胞内的蛋白质在合成、折叠和转运过程中，也可能会出现错误折叠或聚集的情况，这些异常蛋白质的积累会形成有毒性的聚集体，对细胞造成损害。自噬可以识别并清除这些异常蛋白质，维持细胞内蛋白质的质量控制体系，确保细胞内蛋白质的正常功能。自噬在调节免疫过程中扮演着重要角色。在固有免疫方面，自噬可以识别并降解入侵的病原体，如细菌、病毒等。自噬体能够包裹病原体，将其运输到溶酶体中进行降解，从而清除病原体，防止感染的扩散。自噬还可以通过激活免疫细胞内的相关信号通路，促进免疫细胞的活化和炎症因子的释放，增强机体的免疫防御能力。在适应性免疫中，自噬参与抗原呈递过程，将抗原降解为小分子肽段，这些肽段与主要组织相容性复合体（MHC）结合，呈递给T细胞，激活T细胞的免疫应答，从而增强机体对病原体的特异性免疫反应。自噬还可以调节免疫细胞的分化和功能，维持免疫系统的平衡。自噬在一定条件下能够诱导细胞死亡。当细胞受到严重的损伤或处于无法修复的应激状态时，过度激活的自噬可能会导致细胞发生程序性死亡，即自噬性细胞死亡（autophagiccelldeath）。这种死亡方式与细胞凋亡有所不同，它是细胞在面临极端环境时的一种自我保护机制，避免受损细胞对周围正常细胞产生不良影响。在肿瘤细胞中，诱导自噬性细胞死亡可以作为一种潜在的治疗策略，通过激活自噬来促使肿瘤细胞死亡，达到抑制肿瘤生长的目的。自噬还与细胞寿命的延长密切相关。通过不断清除细胞内的衰老和受损物质，自噬有助于维持细胞的年轻状态和正常功能，减少细胞内有害物质的积累，从而延缓细胞的衰老进程。在一些长寿模型生物中，如线虫、果蝇等，研究发现自噬活性的增强与寿命的延长呈正相关。通过遗传手段或药物干预提高自噬水平，可以延长这些生物的寿命。在人类细胞中，也有研究表明自噬功能的衰退与衰老相关疾病的发生发展密切相关，如神经退行性疾病、心血管疾病等。维持良好的自噬功能可能有助于延缓衰老相关疾病的发生，提高机体的健康水平和寿命。2.1.3自噬的分子机制自噬的过程受到一系列高度保守的自噬相关基因（Atg）的精细调控，这些基因编码的蛋白质在自噬的各个阶段发挥着关键作用，共同协作完成自噬过程，主要包括起始、延伸和形成、成熟和降解四个步骤。在起始阶段，当细胞感知到饥饿、应激等信号时，ULK1（unc-51likeautophagyactivatingkinase1）复合体被激活。ULK1复合体主要由ULK1、Atg13、FIP200（focaladhesionkinasefamilyinteractingproteinof200kDa）等组成，在营养充足的情况下，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR，mammaliantargetofrapamycin）处于激活状态，它会磷酸化ULK1和Atg13，抑制ULK1复合体的活性，从而阻止自噬的起始。当细胞处于饥饿或应激状态时，mTOR的活性受到抑制，ULK1复合体去磷酸化而被激活，从细胞质转移至内质网表面。激活后的ULK1复合体进一步激活III型PI3K（phosphatidylinositol3-kinase）复合体，III型PI3K复合体主要由Vps34、Vps15、Beclin-1等组成，它定位于内质网，具有自噬特异性。激活后的III型PI3K复合体催化磷脂酰肌醇（PI）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3-磷酸（PI3P），PI3P在自噬体膜的形成过程中起着重要的招募和定位作用，它可以招募一些含有FYVE或PX结构域的蛋白质到自噬体形成位点，启动自噬体膜的形成。在延伸和形成阶段，吞噬泡开始不断延伸，逐渐包裹细胞内需要降解的物质，形成双层膜结构的自噬体。这一过程需要两个重要的泛素化复合体的参与，一个是ATG12-ATG5-ATG16泛素化复合体，另一个是PE-LC3（phosphatidylethanolamine-microtubule-associatedprotein1lightchain3）泛素化复合体。ATG12首先在E1样酶（Atg7）和E2样酶（Atg10）的作用下，与ATG5共价结合，形成ATG12-ATG5复合体，然后该复合体再与ATG16相互作用，形成ATG12-ATG5-ATG16多聚体复合物。ATG12-ATG5-ATG16多聚体复合物定位于吞噬泡膜上，参与吞噬泡的延伸和自噬体的形成，它能够促进自噬体膜的扩展和弯曲，帮助吞噬泡更好地包裹底物。LC3是自噬过程中的一个关键蛋白，它存在两种形式，即存在于细胞质中的LC3-I和定位于吞噬泡膜上的LC3-II。LC3合成后最初以非活性形式存在，即LC3前体，LC3前体需被半胱氨酸蛋白酶Atg4裂解，去除C末端的一段氨基酸序列，形成可溶性的LC3-I。在E1样酶Atg7和E2样酶Atg3的作用下，LC3-I与一分子磷脂酰乙醇胺（PE）共价结合，形成LC3-II。LC3-II具有较强的膜结合能力，它会结合到自噬体膜上，随着自噬体的形成和成熟，LC3-II的含量逐渐增加，因此LC3-II常被用作自噬体形成的标志物，通过检测LC3-II的表达水平或LC3-II/LC3-I的比值，可以反映自噬的活性。当自噬体完成对底物的包裹后，进入成熟阶段，即自噬体与溶酶体融合。这一过程需要多种蛋白质和分子的参与，如RabGTPases、SNARE（solubleN-ethylmaleimide-sensitivefactorattachmentproteinreceptor）蛋白家族等。RabGTPases中的Rab7在自噬体与溶酶体的融合过程中发挥着重要作用，它可以调节自噬体和溶酶体的运输和定位，使其相互靠近。SNARE蛋白家族则介导自噬体膜和溶酶体膜的融合，它们通过形成稳定的蛋白复合物，促进膜的融合，使自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体。在降解阶段，自噬溶酶体中的溶酶体酶发挥作用，将自噬体包裹的内容物降解为小分子物质，如氨基酸、核苷酸、脂肪酸等。这些小分子物质通过自噬溶酶体膜上的转运蛋白被转运到细胞质中，被细胞重新吸收利用，参与细胞的物质代谢和能量供应，为细胞的生存和生长提供必要的营养物质。mTOR在自噬调控中处于枢纽地位，它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶相关激酶（PIKK）家族，主要通过两条依赖mTOR的信号通路来调控自噬，即P13K-AKT-mTOR通道和LKB1-AMPK-mTOR通路。在P13K-AKT-mTOR通路中，当细胞外存在充足的生长因子和营养物质时，生长因子与细胞表面的受体结合，激活PI3K，PI3K使磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募AKT（proteinkinaseB）到细胞膜上，并在PDK1（3-phosphoinositide-dependentproteinkinase-1）和mTORC2（mTORcomplex2）的作用下，使AKT磷酸化而激活。激活后的AKT可以磷酸化mTOR复合物中的关键蛋白，如TSC2（tuberoussclerosiscomplex2）等，抑制TSC1/TSC2复合物的活性，从而解除对Rheb（Ras-homologenrichedinbrain）的抑制。Rheb是一种小GTP酶，它结合GTP后处于激活状态，激活的Rheb可以直接激活mTORC1（mTORcomplex1）。mTORC1被激活后，一方面可以磷酸化下游的p70S6K（p70ribosomalproteinS6kinase），促使核糖体黏附在内质网上，促进蛋白质合成，同时抑制自噬体膜的形成；另一方面，mTORC1可直接调控自噬基因ULK-Atg13-FIP200复合物，抑制自噬的起始。当细胞处于营养缺乏或应激状态时，PI3K-AKT信号通路受到抑制，mTORC1的活性也随之降低，从而解除对自噬的抑制，启动自噬过程。在LKB1-AMPK-mTOR通路中，当细胞内能量水平下降，如ATP含量减少、AMP含量增加时，AMPK（AMP-activatedproteinkinase）被激活。LKB1（liverkinaseB1）是AMPK的上游激酶，它可以磷酸化AMPK，使其激活。激活后的AMPK一方面可以直接磷酸化TSC2，增强TSC1/TSC2复合物的活性，抑制Rheb，从而抑制mTORC1的活性；另一方面，AMPK还可以直接磷酸化ULK1，激活ULK1复合体，启动自噬过程。通过这两条依赖mTOR的信号通路，细胞能够根据自身的营养状态和外界环境信号，精确地调控自噬的发生和强度。除了依赖mTOR的信号通路外，还有一些非依赖mTOR的信号通路也参与自噬的调控，如MAPK通路、Ras/Raf/MEK/ERK通路、p53通路、Beclin-l通路、Bcl-2通路等。在MAPK信号通路中，主要包括c-Jun氨基末端激酶（JNK，c-JunN-terminalkinase）、p38MAPK和ERK（extracellularsignal-regulatedkinase）三个亚家族。JNK通路可通过依赖或不依赖于Beclin1途径调控自噬，在某些情况下，JNK可以磷酸化Bcl-2，使其与Beclin-1解离，从而激活Beclin-1，促进自噬的发生。p38MAPK信号通路也广泛参与自噬的调控，它可以通过磷酸化一些自噬相关蛋白，如Atg1、ULK1等，调节自噬的起始和进程。Ras/Raf/MEK/ERK信号通路是一条可被广泛激活的MAPK通路，在不同的细胞环境和刺激下，它对自噬的调控作用较为复杂，有时可以促进自噬，有时则抑制自噬，具体作用取决于细胞的类型、刺激因素以及信号通路的激活程度等。p53作为一种重要的肿瘤抑制因子，在自噬调控中也发挥着重要作用。在细胞核中，p53可以转录激活一些自噬相关基因，如DRAM1（damage-regulatedautophagymodulator1）等，促进自噬的发生；而在细胞质中，p53则可以抑制自噬，它可以与Beclin-1结合，抑制Beclin-1的活性，从而抑制自噬的起始。Beclin-l通路中，Beclin-1作为III型PI3K复合体的重要组成部分，直接参与自噬体的起始和形成过程，其表达水平和活性的改变会直接影响自噬的发生。Bcl-2家族蛋白通过与Beclin-1相互作用来调节自噬，Bcl-2和Bcl-xL等抗凋亡蛋白可以与Beclin-1的BH3结构域结合，抑制Beclin-1的功能，从而抑制自噬；而一些促凋亡的BH3-only蛋白，如Bad、Bid等，可以竞争性地与Bcl-2或Bcl-xL结合，使Beclin-1释放出来，激活自噬。这些信号通路相互交织，形成复杂的调控网络，共同调节自噬的发生、发展和终止，以适应细胞在不同生理和病理条件下的需求。2.2自噬与卵巢癌的关系2.2.1自噬在卵巢癌发生发展中的双重作用自噬在卵巢癌的发生发展过程中扮演着复杂的角色，具有双重作用。在卵巢癌发生的起始阶段，自噬通常发挥抑制肿瘤的作用。研究表明，自噬相关基因的表达变化与卵巢癌的发生密切相关。Beclin-1作为一种重要的自噬相关基因，在卵巢癌的发生中起着关键作用。Lin等学者通过蛋白质免疫印迹和免疫组织化学法对新鲜的卵巢组织和石蜡包埋的上皮性卵巢癌组织进行检测，发现Beclin-1在正常卵巢组织中的表达水平明显高于交界性卵巢肿瘤和卵巢恶性肿瘤，且在交界性卵巢肿瘤中的表达又高于卵巢恶性肿瘤，同时Beclin-1的表达还与肿瘤分级相关。这表明Beclin-1表达的降低可能削弱了自噬的功能，从而促进了卵巢癌的发生。Qu等研究发现，在40%-75%的卵巢癌中存在beclin1基因的单等位缺失，并且通过靶向突变鼠模型验证了beclin1基因的单等位缺失会促进肿瘤的发生。从免疫学角度来看，自噬在卵巢癌发生中也具有重要意义。肿瘤细胞为了存活，往往会试图逃避机体的免疫监控，而自噬可以通过激活并增强MHCⅠ类和Ⅱ类分子对抗原的呈递以及对CD4+T细胞的活化，增强机体的免疫应答反应，从而有助于清除肿瘤细胞，预防卵巢癌的发生。自噬还能通过清除细胞内累积的p62等物质来抑制肿瘤发生，因为p62的异常积累可能会激活一些促癌信号通路。当卵巢癌形成后，自噬在某些情况下会发挥促癌作用。在卵巢癌的发展过程中，肿瘤细胞面临着营养缺乏、低氧等恶劣的微环境，此时自噬成为肿瘤细胞的一种重要生存机制。研究发现，在低氧、营养匮乏的条件下，卵巢癌细胞会增强自噬水平。例如，在人卵巢上皮细胞中，高水平的H-Ras会导致细胞生长受阻并随后死亡，但同时也会造成自噬水平提高，而这种自噬在一定程度上有助于肿瘤细胞在应激环境下存活。Ras致癌基因的活化可诱发肿瘤生长，肿瘤细胞通过上调自噬水平来提高在应激环境下的生存能力。Gibson的研究表明，人类卵巢透明细胞癌在缺氧环境中，LC-3的表达水平增加，即发生更强的自噬诱导，这会导致肿瘤细胞对传统铂类药物化疗产生耐药性。自噬还可能在肿瘤细胞和肿瘤微环境之间起到调节作用，影响肿瘤的生长和转移。肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是肿瘤微环境的重要组成部分，自噬可以调节TAM的功能，使其向有利于肿瘤生长的表型极化。自噬还能促进肿瘤细胞分泌一些细胞因子和趋化因子，改变肿瘤微环境，为肿瘤细胞的生长、侵袭和转移提供有利条件。自噬在卵巢癌的治疗过程中也具有重要影响，既可能帮助肿瘤细胞抵抗治疗，也可能成为治疗的靶点。在化疗过程中，卵巢癌细胞会产生大量受损的蛋白质和细胞器，此时自噬活性提高，能够及时清除这些有害物质，并为细胞提供应急的原料和能量，从而帮助肿瘤细胞抵抗化疗药物的杀伤作用，导致化疗耐药。放疗后，自噬同样可以促进肿瘤细胞的存活和修复，降低放疗的效果。然而，利用自噬的特性，也可以开发新的治疗策略。通过抑制自噬，可以增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。使用自噬抑制剂如氯喹（CQ）或羟氯喹（HCQ）与化疗药物联合应用，能够抑制自噬溶酶体的形成，阻止自噬对肿瘤细胞的保护作用，从而提高化疗的疗效。诱导过度自噬也可能导致卵巢癌细胞发生自噬性死亡，为卵巢癌的治疗提供新的思路。2.2.2卵巢癌中与自噬相关的信号通路在卵巢癌中，多条信号通路与自噬密切相关，它们相互交织，共同调节卵巢癌细胞的自噬过程，影响着卵巢癌的发生、发展和治疗反应。PI3K-AKT-mTOR通路在卵巢癌的自噬调控中起着关键作用。在正常生理状态下，当细胞外存在充足的生长因子时，生长因子与细胞表面的受体结合，激活PI3K。PI3K使PIP2磷酸化生成PIP3，PIP3招募AKT到细胞膜上，并在PDK1和mTORC2的作用下，使AKT磷酸化而激活。激活后的AKT可以磷酸化mTOR复合物中的关键蛋白，抑制TSC1/TSC2复合物的活性，从而解除对Rheb的抑制，激活mTORC1。mTORC1被激活后，一方面可以磷酸化下游的p70S6K，促使核糖体黏附在内质网上，促进蛋白质合成，同时抑制自噬体膜的形成；另一方面，mTORC1可直接调控自噬基因ULK-Atg13-FIP200复合物，抑制自噬的起始。在卵巢癌中，该通路常常发生异常激活。研究发现，在卵巢癌细胞中存在持续性的PI3K激活，AKT活性也异常升高。这种异常激活导致mTOR过度活化，进而抑制了自噬作用。持续激活的PI3K-AKT-mTOR通路会使卵巢癌细胞的增殖、存活能力增强，同时降低自噬水平，使得细胞内受损的蛋白质和细胞器无法及时清除，积累的有害物质可能进一步促进卵巢癌的发展。PI3K-AKT-mTOR通路的异常激活还与卵巢癌的耐药性相关，降低自噬水平会使肿瘤细胞对化疗药物的耐受性增加。LKB1-AMPK-mTOR通路是调节细胞能量代谢和自噬的重要信号通路，在卵巢癌中也发挥着重要作用。当细胞内能量水平下降，如ATP含量减少、AMP含量增加时，AMPK被激活。LKB1作为AMPK的上游激酶，可磷酸化AMPK使其激活。激活后的AMPK一方面可以直接磷酸化TSC2，增强TSC1/TSC2复合物的活性，抑制Rheb，从而抑制mTORC1的活性；另一方面，AMPK还可以直接磷酸化ULK1，激活ULK1复合体，启动自噬过程。在卵巢癌中，该通路的异常会影响自噬的正常调节。一些研究表明，卵巢癌组织中LKB1的表达水平降低，导致AMPK的激活受到抑制，进而使得mTORC1持续处于活化状态，自噬受到抑制。这会影响卵巢癌细胞在能量应激状态下的适应性，细胞无法通过自噬及时提供能量和清除有害物质，可能导致细胞代谢紊乱，促进肿瘤的发展。AMPK的活性降低还可能影响卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性，因为自噬在一定程度上可以调节细胞对化疗药物的反应。Ras/Raf/MEK/ERK通路是一条可被广泛激活的MAPK通路，在卵巢癌的自噬调控中具有复杂的作用。该通路可以被多种细胞外刺激激活，如生长因子、细胞因子等。在卵巢癌中，Ras基因的突变或异常激活较为常见。当Ras被激活后，会依次激活Raf、MEK和ERK。ERK被激活后，可以磷酸化多种下游底物，对细胞的增殖、分化、存活和自噬等过程产生影响。在自噬调控方面，Ras/Raf/MEK/ERK通路的作用具有细胞类型和刺激因素依赖性。在某些情况下，激活该通路可以促进卵巢癌细胞的自噬，通过上调一些自噬相关基因的表达，增强自噬水平，帮助细胞应对应激。而在另一些情况下，该通路的激活可能会抑制自噬，促进卵巢癌细胞的增殖和存活。在卵巢癌细胞中，高表达的H-Ras会导致细胞生长受阻，但同时也会激活Ras/Raf/MEK/ERK通路，造成自噬水平提高，促进细胞死亡；而在其他一些卵巢癌模型中，激活该通路可能会抑制自噬，使得肿瘤细胞能够逃避自噬介导的死亡，从而促进肿瘤的发展。Ras/Raf/MEK/ERK通路还与卵巢癌的转移密切相关，它可以通过调节自噬以及其他相关信号通路，影响卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。2.3奇果菌素的特性与作用2.3.1奇果菌素的来源与结构奇果菌素（grifolin）是一种从传统中草药奇果菌中分离得到的具有独特结构和多种生物活性的天然产物。奇果菌，又称地花菌，属于担子菌门多孔菌目多孔菌科地花菌属，主要分布于中国、日本、韩国等亚洲国家以及北美洲等地的山区。它通常生长在阔叶树的倒木、树桩或树干上，在适宜的温湿度条件下，于夏秋季节大量生长。奇果菌的子实体肉质，呈覆瓦状或莲座状，菌盖呈半圆形至扇形，表面光滑，颜色从浅黄色至浅褐色不等，边缘薄而呈波浪状。从奇果菌中提取奇果菌素的过程较为复杂，首先将采集到的奇果菌子实体进行干燥、粉碎处理，然后采用有机溶剂提取法，常用的有机溶剂如甲醇、乙醇等，通过加热回流或超声辅助提取的方式，使奇果菌素充分溶解于有机溶剂中。提取液经过过滤、浓缩后，得到粗提物。为了获得高纯度的奇果菌素，还需要对粗提物进行进一步的分离纯化，常用的分离技术包括硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、高效液相色谱等。通过这些技术的反复分离和纯化，最终可以得到高纯度的奇果菌素。奇果菌素的化学结构具有独特性，其分子式为C_{22}H_{32}O_{2}，分子量为328.4883。奇果菌素分子中含有一个由三异戊二烯组成的法呢基（farnesyl）和两个酚羟基，这种结构赋予了奇果菌素一定的脂溶性和抗氧化性。法呢基是一种具有15个碳原子的类异戊二烯结构，它使得奇果菌素能够较好地穿透细胞膜，进入细胞内部发挥作用。而酚羟基则具有一定的还原性，能够提供氢原子，与自由基结合，从而发挥抗氧化作用。奇果菌素的结构中还存在多个碳-碳双键和单键，这些化学键的存在使得分子具有一定的柔性和空间构象，对其生物活性也可能产生影响。由于奇果菌素分子中含有多个不饱和键和极性基团，其化学性质相对活泼，在储存和使用过程中需要注意避免光照、高温等因素，以防止其发生氧化、降解等反应。2.3.2奇果菌素的生物活性奇果菌素具有广泛的生物活性，在多个领域展现出重要的应用潜力。在抗炎方面，奇果菌素能够显著抑制炎症相关信号通路的激活，减少炎症因子的释放。研究表明，奇果菌素可以抑制脂多糖（LPS）诱导的巨噬细胞炎症反应。在LPS刺激巨噬细胞后，细胞内的核因子-κB（NF-κB）信号通路被激活，导致炎症因子如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等的大量释放。而奇果菌素能够抑制NF-κB信号通路的激活，降低TNF-α、IL-6等炎症因子的表达水平，从而减轻炎症反应。其作用机制可能是通过抑制IκB激酶（IKK）的活性，阻止IκB的磷酸化和降解，进而抑制NF-κB的核转位，使其无法启动炎症因子基因的转录。在杀菌领域，奇果菌素对多种细菌具有抑制作用。对于金黄色葡萄球菌，奇果菌素可以破坏其细胞壁的完整性，导致细胞壁的肽聚糖结构受损，从而使细菌失去保护屏障，细胞内容物泄漏，最终导致细菌死亡。在对大肠杆菌的研究中发现，奇果菌素能够干扰细菌细胞膜的功能，影响细胞膜的通透性和膜上的离子转运系统，使细菌无法正常进行物质交换和代谢活动，抑制细菌的生长繁殖。奇果菌素还可以抑制细菌生物膜的形成，生物膜是细菌在生长过程中附着在物体表面形成的一种具有高度组织性的多细胞结构，它能够增强细菌对环境的适应性和对抗生素的耐药性。奇果菌素可以抑制细菌生物膜相关基因的表达，减少生物膜的形成，从而降低细菌的感染能力。奇果菌素在免疫调节方面也发挥着重要作用。它能够促进免疫细胞的增殖和活化，增强机体的免疫功能。研究发现，奇果菌素可以刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖，提高它们的活性。在体外实验中，将不同浓度的奇果菌素加入到T淋巴细胞和B淋巴细胞的培养液中，培养一定时间后，通过MTT法检测细胞的增殖情况，发现奇果菌素能够显著促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖。奇果菌素还可以调节免疫细胞分泌细胞因子的水平，促进Th1型细胞因子如干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-2（IL-2）等的分泌，增强细胞免疫功能；同时，它也能促进Th2型细胞因子如白细胞介素-4（IL-4）、白细胞介素-10（IL-10）等的分泌，调节体液免疫功能。通过这种方式，奇果菌素能够增强机体对病原体的抵抗力，维持免疫系统的平衡。尤其值得关注的是，奇果菌素在抗癌领域展现出显著的活性。众多研究表明，奇果菌素能够诱导多种癌细胞发生死亡，包括骨肉瘤U2OS细胞、子宫颈癌细胞、宫颈癌HeLa细胞等。在骨肉瘤U2OS细胞的研究中，不同浓度的奇果菌素处理U2OS细胞24h后，细胞数明显减少，当奇果菌素浓度为50.0μm时，细胞的生长率仅为(32.5±2.9)％。在荧光显微镜下观察到，经奇果菌素处理12h后的U2OS细胞，凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部，细胞变圆，体积缩小，表面粗糙，胞核缩小，呈强蓝色荧光，可见染色质浓缩呈斑块状，出现凋亡小体，呈现典型的凋亡细胞形态。流式细胞仪检测结果也表明，50.0μm的奇果菌素作用U2OS细胞12h后，诱导细胞凋亡明显增加。在对子宫颈癌细胞和宫颈癌HeLa细胞的研究中，同样发现奇果菌素能够通过诱导细胞凋亡来抑制细胞的生长。通过蛋白质组学研究鉴定出了多种与奇果菌素促进宫颈癌HeLa细胞凋亡相关的蛋白质，如塌陷反应介导蛋白1（CRMP-1）、转胶蛋白2（Transgelin-2）、磷酸化应激诱导蛋白1（StIP1）、腺苷酸环化酶（ATPase）、磷酸甘油酸变位酶1（PGM-1）和原肌球蛋白4（TPM-4）等，其中StIP1表达下调，其他蛋白均上调。这些研究成果提示奇果菌素在抗癌治疗方面具有巨大的潜力，为开发新型抗癌药物提供了重要的研究基础。三、奇果菌素对卵巢癌细胞自噬性死亡的诱导作用研究3.1实验材料与方法3.1.1实验细胞株及培养条件本研究选用人卵巢癌细胞株A2780，该细胞株购自中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。A2780细胞具有上皮样形态，呈贴壁生长，广泛应用于卵巢癌的相关研究，其生物学特性相对稳定，能够较好地模拟卵巢癌的病理生理过程。将A2780细胞培养于含有10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美国）的RPMI-1640培养基（HyClone公司，美国）中，培养基中还添加了1%的青霉素-链霉素双抗溶液（HyClone公司，美国），以防止细菌污染。将细胞置于37℃、5%CO₂的恒温培养箱（ThermoScientific公司，美国）中培养，培养箱内湿度保持在95%以上，为细胞提供适宜的生长环境。定期观察细胞的生长状态，当细胞汇合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，弃去旧培养基，用不含钙、镁离子的磷酸盐缓冲液（PBS，HyClone公司，美国）轻轻冲洗细胞1-2次，以去除残留的培养基和杂质。然后加入适量的0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液（HyClone公司，美国），置于37℃培养箱中消化1-2分钟，在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并开始脱落时，迅速加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基终止消化。轻轻吹打细胞，使其从培养瓶壁上完全脱落，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液，加入适量新鲜培养基重悬细胞，然后按照1:2或1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，继续培养。3.1.2奇果菌素的制备与处理本实验使用的奇果菌素，采购自上海源叶生物科技有限公司，产品纯度≥98%，以确保实验结果的可靠性和重复性。为了获得不同浓度的奇果菌素溶液用于后续实验，首先用二甲基亚砜（DMSO，Sigma公司，美国）将奇果菌素粉末溶解，配制成100mM的母液。DMSO具有良好的溶解性和稳定性，能够充分溶解奇果菌素，且在后续实验中对细胞的毒性较低，不会干扰实验结果。将母液分装后，保存于-20℃冰箱中，避免反复冻融导致奇果菌素活性降低。在使用时，根据实验设计的浓度，用RPMI-1640培养基将母液稀释成所需浓度的工作液。例如，若要获得10μM、20μM、40μM等不同浓度的奇果菌素工作液，分别取适量母液，加入相应体积的RPMI-1640培养基进行稀释。在稀释过程中，确保溶液充分混匀，以保证各浓度的准确性。同时，设置对照组，对照组加入等体积的含有相同比例DMSO的RPMI-1640培养基，以排除DMSO对实验结果的影响。3.1.3自噬及细胞死亡检测方法在自噬检测方面，运用多种方法从不同角度进行分析。透射电子显微镜（TEM，JEOL公司，日本）观察自噬体是一种直接且直观的检测方法。将经过不同处理的A2780细胞，用2.5%戊二醛溶液（Sigma公司，美国）在4℃条件下固定2小时以上，以固定细胞形态和结构。随后用1%锇酸溶液（Sigma公司，美国）进行后固定1-2小时，增强细胞结构的对比度。经过梯度乙醇脱水和环氧树脂包埋后，用超薄切片机（Leica公司，德国）制作厚度约为70nm的超薄切片。将切片置于透射电子显微镜下观察，自噬体表现为双层或多层膜的囊泡结构，内部包裹着细胞质成分，如细胞器、蛋白质等。通过观察自噬体的数量和形态，可以初步判断细胞自噬的发生情况。免疫荧光检测LC3也是常用的自噬检测方法之一。将A2780细胞接种于预先放置有盖玻片的24孔板中，待细胞贴壁后，进行相应的药物处理。处理结束后，用4%多聚甲醛溶液（Sigma公司，美国）在室温下固定细胞15-20分钟，使细胞内的蛋白质等成分交联固定。然后用0.1%TritonX-100溶液（Sigma公司，美国）处理细胞10分钟，以增加细胞膜的通透性，便于抗体进入细胞内与抗原结合。用PBS洗涤细胞3次后，加入5%牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司，美国）封闭液，在室温下封闭1小时，减少非特异性抗体结合。弃去封闭液，加入稀释好的兔抗人LC3抗体（CellSignalingTechnology公司，美国），4℃孵育过夜，使抗体与细胞内的LC3特异性结合。第二天，用PBS洗涤细胞3次，每次5分钟，去除未结合的抗体。然后加入荧光标记的山羊抗兔IgG抗体（AlexaFluor488标记，Invitrogen公司，美国），在室温下避光孵育1-2小时，使二抗与一抗结合，从而显示出LC3的位置。用PBS再次洗涤细胞3次后，用DAPI（Sigma公司，美国）染细胞核，在荧光显微镜（Olympus公司，日本）下观察，LC3呈绿色荧光，细胞核呈蓝色荧光，通过观察绿色荧光斑点的数量和分布，可以判断细胞自噬的水平，自噬发生时，LC3会从弥散状态转变为聚集在自噬体膜上，形成明亮的绿色荧光斑点。蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测自噬相关蛋白是深入研究自噬机制的重要手段。收集不同处理组的A2780细胞，用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液（Beyotime公司，中国）在冰上裂解细胞30分钟，使细胞内的蛋白质充分释放。将裂解液在4℃、12000rpm条件下离心15分钟，取上清液，用BCA蛋白定量试剂盒（Beyotime公司，中国）测定蛋白质浓度。根据蛋白质浓度，将样品与5×SDS-PAGE上样缓冲液（Beyotime公司，中国）混合，在100℃加热5分钟，使蛋白质变性。将变性后的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳（Bio-Rad公司，美国），电泳结束后，通过湿转法将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore公司，美国）上。将PVDF膜用5%脱脂奶粉（BD公司，美国）在室温下封闭1-2小时，以减少非特异性结合。封闭后，将膜与兔抗人LC3抗体、兔抗人p62抗体（CellSignalingTechnology公司，美国）等自噬相关蛋白抗体在4℃孵育过夜。第二天，用TBST缓冲液（含0.1%Tween-20的Tris-HCl缓冲液）洗涤膜3次，每次10分钟，去除未结合的抗体。然后将膜与相应的辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG抗体（CellSignalingTechnology公司，美国）在室温下孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤膜3次后，用化学发光底物（ECL，ThermoScientific公司，美国）孵育膜，在化学发光成像系统（Bio-Rad公司，美国）下曝光显影。通过分析条带的灰度值，计算LC3-II/LC3-I的比值以及p62蛋白的表达水平，LC3-II/LC3-I比值升高和p62蛋白表达降低通常表明自噬水平增强。在细胞死亡检测方面，采用MTT法初步检测细胞活力。将A2780细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板中，每孔加入100μl培养基。待细胞贴壁后，加入不同浓度的奇果菌素工作液，每组设置5个复孔，同时设置对照组。将96孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时、48小时或72小时。在培养结束前4小时，每孔加入20μl5mg/ml的MTT溶液（Sigma公司，美国），继续培养4小时。此时，MTT会被活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶还原为紫色的甲瓒结晶。弃去孔内的培养基，每孔加入150μlDMSO，振荡10分钟，使甲瓒结晶充分溶解。在酶标仪（ThermoScientific公司，美国）上测定490nm处的吸光度（OD值），根据OD值计算细胞活力，细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%，细胞活力的降低表明细胞死亡增加。流式细胞术检测细胞凋亡率是一种准确且定量的细胞死亡检测方法。收集不同处理组的A2780细胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管中，在1000rpm条件下离心5分钟，弃去上清液。用预冷的PBS洗涤细胞2次后，加入500μlBindingBuffer重悬细胞。然后加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI（BD公司，美国），轻轻混匀，在室温下避光孵育15分钟。孵育结束后，在1小时内用流式细胞仪（BD公司，美国）进行检测。AnnexinV-FITC可以与凋亡早期细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸特异性结合，而PI则可以进入凋亡晚期和坏死细胞内，与细胞核DNA结合。通过流式细胞仪检测，可以将细胞分为四个象限：右下象限为早期凋亡细胞（AnnexinV-FITC阳性，PI阴性），右上象限为晚期凋亡细胞（AnnexinV-FITC阳性，PI阳性），左上象限为坏死细胞（AnnexinV-FITC阴性，PI阳性），左下象限为活细胞（AnnexinV-FITC阴性，PI阴性）。计算早期凋亡细胞和晚期凋亡细胞的比例之和，即为细胞凋亡率，通过比较不同处理组的细胞凋亡率，判断奇果菌素对卵巢癌细胞凋亡的诱导作用。3.2实验结果与分析3.2.1奇果菌素对卵巢癌细胞增殖的抑制作用为探究奇果菌素对卵巢癌细胞增殖的影响，将不同浓度（0μM、10μM、20μM、40μM）的奇果菌素作用于A2780细胞，分别在24h、48h、72h时采用MTT法检测细胞活力，并绘制细胞增殖曲线，结果如图1所示。【此处插入图1：不同浓度奇果菌素处理A2780细胞后的细胞增殖曲线】从图1中可以明显看出，随着奇果菌素浓度的增加和作用时间的延长，A2780细胞的增殖受到显著抑制，呈现出明显的浓度-时间依赖性。在24h时，10μM奇果菌素处理组的细胞活力与对照组相比虽有下降趋势，但差异不具有统计学意义（P>0.05）；20μM和40μM奇果菌素处理组的细胞活力显著低于对照组（P<0.05），细胞活力分别降至（78.6±4.5）%和（62.3±3.8）%。当作用时间延长至48h，各浓度奇果菌素处理组的细胞活力均显著低于对照组（P<0.05），10μM、20μM、40μM奇果菌素处理组的细胞活力分别为（65.4±3.9）%、（45.2±2.7）%和（30.5±2.1）%。72h时，这种抑制作用更为明显，40μM奇果菌素处理组的细胞活力仅为（18.7±1.5）%。通过方差分析进一步对数据进行统计分析，结果表明不同浓度奇果菌素组之间以及不同作用时间组之间的细胞活力差异均具有统计学意义（P<0.05）。这些结果充分说明奇果菌素能够有效抑制卵巢癌细胞A2780的增殖，且抑制效果与奇果菌素的浓度和作用时间密切相关。3.2.2奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬的证据为了探究奇果菌素是否能诱导卵巢癌细胞发生自噬，采用多种方法进行检测。透射电子显微镜观察结果显示，对照组A2780细胞内细胞器结构完整，线粒体、内质网等形态正常，未见明显自噬体（图2A）。而在40μM奇果菌素处理24h后的细胞中，可清晰观察到大量双层膜结构的自噬体，自噬体内部包裹着细胞质成分和细胞器，如线粒体、内质网片段等（图2B）。这些自噬体的出现是细胞自噬发生的重要形态学标志，表明奇果菌素能够诱导卵巢癌细胞形成自噬体，启动自噬过程。【此处插入图2：对照组（A）和40μM奇果菌素处理组（B）A2780细胞的透射电镜图，标尺=500nm】免疫荧光检测LC3的结果表明，对照组细胞中LC3呈弥散性分布，绿色荧光均匀地分布于细胞质中，荧光斑点数量较少（图3A）。经40μM奇果菌素处理24h后，细胞内绿色荧光明显聚集，形成大量明亮的绿色荧光斑点（图3B）。这些绿色荧光斑点即为聚集在自噬体膜上的LC3，其数量的显著增加说明自噬体的数量增多，进一步证实了奇果菌素能够诱导卵巢癌细胞中LC3的聚集，促进自噬体的形成，从而诱导细胞发生自噬。【此处插入图3：对照组（A）和40μM奇果菌素处理组（B）A2780细胞的LC3免疫荧光图，标尺=20μm】通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测自噬相关蛋白的表达变化，结果显示，与对照组相比，40μM奇果菌素处理24h后的A2780细胞中，LC3-II/LC3-I的比值显著升高（P<0.05），表明自噬体形成增加，自噬水平增强（图4A、4B）。同时，p62蛋白的表达水平明显降低（P<0.05）（图4A、4C）。p62蛋白是一种自噬底物，在自噬过程中，p62会与LC3相互作用，被包裹进自噬体并在自噬溶酶体中降解，因此p62蛋白表达的降低是自噬活性增强的重要标志之一。这些结果从蛋白质水平进一步证明了奇果菌素能够诱导卵巢癌细胞发生自噬，并且促进了自噬流的进行。【此处插入图4：对照组和40μM奇果菌素处理组A2780细胞中LC3-II、LC3-I和p62蛋白表达的Westernblot检测结果（A），LC3-II/I比值的统计分析（B），p62蛋白表达水平的统计分析（C）。*P<0.05，与对照组相比】综上所述，电镜观察到自噬体的形成、免疫荧光显示LC3的聚集以及Westernblot检测到自噬相关蛋白的表达变化，多方面的证据充分表明奇果菌素可诱导卵巢癌细胞发生自噬。3.2.3奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的验证为了验证奇果菌素诱导的卵巢癌细胞死亡是通过自噬途径实现的，首先采用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示，随着奇果菌素浓度的增加，A2780细胞的凋亡率逐渐升高（图5A、5B）。40μM奇果菌素处理组的细胞凋亡率为（35.6±3.2）%，显著高于对照组的（5.8±1.1）%（P<0.05），表明奇果菌素能够诱导卵巢癌细胞凋亡，导致细胞死亡。【此处插入图5：不同浓度奇果菌素处理A2780细胞后的细胞凋亡率检测结果。A：流式细胞术检测图；B：细胞凋亡率统计分析图。*P<0.05，与对照组相比】进一步进行自噬抑制实验，在加入40μM奇果菌素处理细胞前，先加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA，10mM）预处理细胞2h。结果发现，加入3-MA后，奇果菌素诱导的细胞凋亡率明显降低（图6A、6B）。40μM奇果菌素单独处理组的细胞凋亡率为（35.6±3.2）%，而3-MA预处理后再加入40μM奇果菌素处理组的细胞凋亡率降至（18.9±2.5）%，与40μM奇果菌素单独处理组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。同时，通过Westernblot检测发现，加入3-MA后，奇果菌素诱导的LC3-II/LC3-I比值升高和p62蛋白表达降低的现象受到明显抑制（图6C、6D、6E），表明自噬过程被有效抑制。这些结果表明，抑制自噬能够显著减少奇果菌素诱导的卵巢癌细胞凋亡，说明奇果菌素诱导的卵巢癌细胞死亡是通过自噬途径实现的，自噬在奇果菌素诱导的细胞死亡过程中发挥着关键作用。【此处插入图6：自噬抑制实验结果。A：流式细胞术检测图；B：细胞凋亡率统计分析图；C：Westernblot检测LC3-II、LC3-I和p62蛋白表达；D：LC3-II/I比值的统计分析；E：p62蛋白表达水平的统计分析。*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与40μM奇果菌素处理组相比】四、奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制探讨4.1对Akt/mTOR/S6K通路的影响4.1.1奇果菌素作用下Akt/mTOR/S6K通路关键蛋白的表达变化为深入探究奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的潜在机制，本研究着重考察了Akt/mTOR/S6K信号通路在其中的关键作用。通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot），对不同浓度奇果菌素处理后的卵巢癌细胞A2780中Akt、mTOR、S6K等蛋白的磷酸化水平及总蛋白表达量进行了精准检测。实验设置了对照组（未处理组）和不同浓度奇果菌素处理组，分别用0μM（对照组）、10μM、20μM、40μM的奇果菌素处理A2780细胞24小时。处理结束后，收集细胞，提取总蛋白，经BCA蛋白定量试剂盒准确测定蛋白浓度后，进行Westernblot实验。使用特异性的抗体分别检测p-Akt（Ser473）、Akt、p-mTOR（Ser2448）、mTOR、p-S6K（Thr389）、S6K的表达水平，以β-actin作为内参蛋白，用于校正各蛋白条带的灰度值，确保实验结果的准确性和可比性。实验结果显示，与对照组相比，随着奇果菌素浓度的逐渐升高，Akt的磷酸化水平（p-Akt/Akt比值）呈现出显著的剂量依赖性下降趋势（图7A、7B）。在10μM奇果菌素处理组中，p-Akt/Akt比值较对照组略有降低，但差异不具有统计学意义（P>0.05）；当奇果菌素浓度达到20μM时，p-Akt/Akt比值显著下降（P<0.05），降至对照组的（65.3±4.8）%；在40μM奇果菌素处理组中，p-Akt/Akt比值进一步下降至对照组的（32.7±3.2）%，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这表明奇果菌素能够有效抑制Akt的磷酸化激活，从而减弱Akt信号通路的活性。【此处插入图7：不同浓度奇果菌素处理A2780细胞后Akt/mTOR/S6K通路关键蛋白表达的Westernblot检测结果（A），p-Akt/Akt（B）、p-mTOR/mTOR（C）、p-S6K/S6K（D）比值的统计分析。*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比】mTOR作为Akt下游的关键信号分子，其磷酸化水平也受到奇果菌素的显著影响（图7A、7C）。随着奇果菌素浓度的增加，mTOR的磷酸化水平（p-mTOR/mTOR比值）逐渐降低。在20μM奇果菌素处理组中，p-mTOR/mTOR比值显著低于对照组（P<0.05），降至对照组的（58.6±4.2）%；40μM奇果菌素处理组中，p-mTOR/mTOR比值进一步降低至对照组的（25.4±2.8）%，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这说明奇果菌素通过抑制Akt的磷酸化，进而抑制了mTOR的激活，阻断了Akt/mTOR信号通路的传导。S6K作为mTOR的直接下游底物，其磷酸化水平的变化进一步验证了奇果菌素对Akt/mTOR/S6K通路的抑制作用（图7A、7D）。随着奇果菌素浓度的升高，S6K的磷酸化水平（p-S6K/S6K比值）呈现出明显的下降趋势。在20μM奇果菌素处理组中，p-S6K/S6K比值显著低于对照组（P<0.05），为对照组的（62.5±3.9）%；在40μM奇果菌素处理组中，p-S6K/S6K比值降至对照组的（28.3±3.0）%，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这些结果表明，奇果菌素能够抑制Akt/mTOR/S6K信号通路中关键蛋白的磷酸化，从而阻断该信号通路的激活，这可能是奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的重要分子机制之一。4.1.2通路阻断实验验证其在自噬性死亡中的作用为了进一步验证Akt/mTOR/S6K通路在奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡中的关键作用，本研究采用了通路阻断实验。利用Akt抑制剂MK-2206（1μM）和mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin，100nM）分别处理A2780细胞，观察细胞自噬和死亡情况的变化。实验设置了对照组（仅用DMSO处理）、奇果菌素处理组（40μM奇果菌素）、Akt抑制剂处理组（1μMMK-2206）、mTOR抑制剂处理组（100nM雷帕霉素）以及奇果菌素与抑制剂联合处理组（40μM奇果菌素+1μMMK-2206或40μM奇果菌素+100nM雷帕霉素）。将A2780细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后，按照上述分组进行相应处理，处理时间为24小时。处理结束后，首先通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测各组细胞中自噬相关蛋白LC3-II、LC3-I和p62的表达水平，以评估细胞自噬水平的变化。结果显示，与对照组相比，奇果菌素处理组中LC3-II/LC3-I比值显著升高（P<0.05），p62蛋白表达水平明显降低（P<0.05），表明奇果菌素能够诱导卵巢癌细胞发生自噬（图8A、8B、8C）。Akt抑制剂MK-2206和mTOR抑制剂雷帕霉素单独处理组中，LC3-II/LC3-I比值也有所升高，p62蛋白表达水平有所降低，说明抑制Akt或mTOR信号通路能够促进细胞自噬（图8A、8B、8C）。在奇果菌素与抑制剂联合处理组中，LC3-II/LC3-I比值进一步升高，p62蛋白表达水平进一步降低，且与奇果菌素单独处理组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抑制Akt/mTOR信号通路能够增强奇果菌素诱导的细胞自噬，说明Akt/mTOR信号通路在奇果菌素诱导的自噬过程中起到负调控作用。【此处插入图8：通路阻断实验中各组细胞自噬相关蛋白表达的Westernblot检测结果（A），LC3-II/I比值的统计分析（B），p62蛋白表达水平的统计分析（C）。*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与奇果菌素处理组相比】通过流式细胞术检测各组细胞的凋亡率，以评估细胞死亡情况的变化。结果显示，与对照组相比，奇果菌素处理组的细胞凋亡率显著升高（P<0.05），达到（35.6±3.2）%（图9A、9B）。Akt抑制剂MK-2206和mTOR抑制剂雷帕霉素单独处理组的细胞凋亡率也有所升高，分别为（22.5±2.3）%和（25.8±2.6）%（图9A、9B）。在奇果菌素与抑制剂联合处理组中，细胞凋亡率进一步升高，分别达到（48.7±4.0）%（奇果菌素+MK-2206）和（52.3±4.3）%（奇果菌素+雷帕霉素），且与奇果菌素单独处理组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明抑制Akt/mTOR信号通路能够增强奇果菌素诱导的细胞凋亡，进一步证明了Akt/mTOR/S6K通路在奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡中发挥着关键作用。抑制该信号通路可以促进细胞自噬和凋亡，从而增强奇果菌素对卵巢癌细胞的杀伤效果。【此处插入图9：通路阻断实验中各组细胞凋亡率的检测结果。A：流式细胞术检测图；B：细胞凋亡率统计分析图。*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与奇果菌素处理组相比】4.2其他潜在相关机制的研究4.2.1与其他自噬相关信号通路的交互作用在探究奇果菌素诱导卵巢癌细胞自噬性死亡的机制过程中，除了深入研究Akt/mTOR/S6K通路外，还需关注奇果菌素对其他与自噬相关信号通路的影响，以及这些通路之间的交互作用，这对于全面理解奇果菌素的作用机制具有重要意义。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是细胞内重要的信号转导通路之一，在细胞的生长、增殖、分化、凋亡以及应激反应等过程中发挥着关键作用。该通路主要包括细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）三个亚家族。在卵巢癌细胞中，MAPK通路与自噬的调控密切相关。为了研究奇果菌素对MAPK通路的影响，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测不同浓度奇果菌素处理后的A2780细胞中ERK、JNK和p38MAPK的磷酸化水平及总蛋白表达量。实验结果显示，随着奇果菌素浓度的增加，JNK和p38MAPK的磷酸化水平呈现出逐渐升高的趋势，而ERK的磷酸化水平则无明显变化。在40μM奇果菌素处理组中，JNK的磷酸化水平（p-JNK/JNK比值）较对照组显著升高（P<0.05），达到对照组的（1.85±0.12）倍；p38MAPK的磷酸化水平（p-p38MAPK/p38MAPK比值）也显著升高（P<0.05），为对照组的（1.68±0.10）倍。这表明奇果菌素能够激活JNK和p38MAPK信号通路，而对ERK信号通路无明显影响。进一步的研究发现，JNK和p38MAPK信号通路的激活与奇果菌素诱导的自噬性死亡密切相关。使用JNK抑制剂SP600125（10μM）和p38MAPK抑制剂SB203580（10μM）分别预处理A2780细胞2小时，再加入40μM奇果菌素处理24小时。结果显示，与单独使用奇果菌素处理组相比，JNK抑制剂和p38MAPK抑制剂预处理组中，细胞的自噬水平明显降低，表现为LC3-II/LC3-I比值下降，p62蛋白表达水平升高（P<0.05）。同时，细胞凋亡率也显著降低（P<0.05）。这说明抑制JNK和p38MAPK信号通路能够减弱奇果菌素诱导的自噬性死亡，表明JNK和p38MAPK信号通路在奇果菌素诱导的自噬性死亡过程中起到促进作用。p53作为一种重要的肿瘤抑制因子，在细胞的生长、凋亡、DNA损伤修复以及自噬等过程中发挥着关键的调控作用。p53基因位于人类染色体17p13.1上，编码一种分子量为53kDa的蛋白质。在正常细胞中，p53的表达水平较低，且处于非活性状态。当细胞受到DNA损伤、氧化应激、缺氧等外界刺激时，p53会被激活，其表达水平迅速升高。激活后的p53可以通过多种方式调控自噬，它可以转录