奶牛子宫内膜炎病原菌剖析：化脓隐秘杆菌特性与防控关键研究

奶牛子宫内膜炎病原菌剖析：化脓隐秘杆菌特性与防控关键研究一、引言1.1研究背景奶牛养殖业在全球农业经济中占据重要地位，为人们提供丰富的乳制品资源。然而，奶牛子宫内膜炎作为一种常见且危害严重的疾病，给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失。奶牛子宫内膜炎是指奶牛子宫黏膜发生的炎症，主要由病原微生物感染引起。据相关资料显示，在我国，奶牛子宫内膜炎的发病率呈上升趋势，部分地区发病率甚至高达30%-50%。这种疾病不仅影响奶牛的繁殖性能，导致产后初次发情时间延迟、配种次数增加、受孕率降低，还会引发其他疾病，如乳房炎、真胃变位等，进一步降低奶牛的产奶量和牛奶品质，增加治疗成本，严重时甚至导致奶牛被淘汰，给养殖户带来沉重的经济负担。化脓隐秘杆菌是引起奶牛子宫内膜炎的重要病原菌之一。它是一种革兰氏阳性杆菌，常寄居于牛的泌尿生殖道、呼吸道、胃肠道黏膜和乳房，为条件性致病菌。在特定条件下，如奶牛分娩时消毒不严、产后子宫弛缓、恶露蓄积、胎衣不下、人工授精操作不当等，化脓隐秘杆菌可侵入子宫，引发子宫内膜炎。研究表明，在奶牛子宫内膜炎病例中，化脓隐秘杆菌的检出率较高，可达20%-40%。该菌具有较强的致病性，能产生多种毒力因子，如溶血素、透明质酸酶、蛋白酶等，这些毒力因子可破坏子宫黏膜的完整性，抑制免疫细胞的功能，从而导致炎症的发生和发展。对化脓隐秘杆菌分子特性的研究具有重要意义。一方面，通过深入了解其分子特性，如基因结构、毒力基因的表达调控机制、耐药基因的分布等，可以揭示其致病机制，为开发针对性的防治措施提供理论依据。例如，研究发现化脓隐秘杆菌的溶血素基因（hly）在其致病过程中发挥重要作用，通过抑制该基因的表达或阻断其功能，有望降低该菌的致病性。另一方面，了解化脓隐秘杆菌的分子特性，有助于建立快速、准确的诊断方法，实现对奶牛子宫内膜炎的早期诊断和及时治疗，从而减少疾病的传播和扩散，提高奶牛的繁殖性能和养殖效益。例如，基于16SrRNA基因序列分析建立的PCR诊断方法，具有快速、灵敏、特异性强的特点，能够在短时间内准确检测出化脓隐秘杆菌。1.2研究目的与意义本研究旨在对引起奶牛子宫内膜炎的病原菌进行分离鉴定，明确其种类和分布情况，并深入研究化脓隐秘杆菌的分子特性，为奶牛子宫内膜炎的防治提供科学依据和技术支持。通过对奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定，可以准确了解引起该疾病的病原微生物种类，掌握其在不同地区、不同养殖场的分布规律，为制定针对性的防控措施提供基础数据。同时，研究化脓隐秘杆菌的分子特性，如毒力基因的组成、表达调控机制以及耐药基因的类型和传播方式等，有助于揭示其致病机制，为开发新型诊断方法和治疗药物提供理论依据。从实际应用角度来看，本研究成果对于提高奶牛养殖效益、保障乳制品质量安全具有重要意义。通过有效防控奶牛子宫内膜炎，可以降低奶牛的淘汰率，提高奶牛的繁殖性能和产奶量，减少因疾病治疗带来的经济损失。同时，减少抗生素的不合理使用，降低牛奶中的药物残留，保障消费者的健康。此外，本研究还可以为兽医临床提供科学的诊断和治疗方案，提高兽医的诊疗水平，促进奶牛养殖业的可持续发展。1.3国内外研究现状国内外学者针对奶牛子宫内膜炎病原菌及化脓隐秘杆菌展开了大量研究，在病原菌种类鉴定、致病机制、检测方法以及化脓隐秘杆菌的分子特性等方面取得了一定进展。在病原菌种类鉴定方面，国内外研究表明，引起奶牛子宫内膜炎的病原菌种类繁多，包括细菌、真菌、病毒等。其中，细菌是主要的病原菌，常见的有大肠杆菌、化脓隐秘杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌等。不同地区和养殖场，病原菌的种类和分布存在差异。例如，在我国部分地区，大肠杆菌和化脓隐秘杆菌是奶牛子宫内膜炎的主要病原菌，而在其他地区，金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率较高。国外研究也发现，不同国家和地区奶牛子宫内膜炎病原菌的构成有所不同。关于致病机制，研究发现病原菌通过产生多种毒力因子，如毒素、酶类等，破坏子宫黏膜的完整性，引发炎症反应。同时，病原菌还能逃避宿主的免疫防御机制，导致感染持续存在。以化脓隐秘杆菌为例，它能产生溶血素、透明质酸酶等毒力因子，溶血素可破坏红细胞和其他细胞的细胞膜，导致细胞溶解；透明质酸酶则能分解细胞间质中的透明质酸，使细菌更容易扩散。在检测方法上，传统的细菌分离培养和生化鉴定方法仍是目前常用的手段，但该方法耗时较长、操作繁琐。近年来，随着分子生物学技术的发展，PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片等技术逐渐应用于奶牛子宫内膜炎病原菌的检测，这些技术具有快速、灵敏、特异性强等优点。例如，利用PCR技术可以快速检测出化脓隐秘杆菌的特异性基因，实现对该菌的快速诊断。针对化脓隐秘杆菌分子特性的研究，国内外学者在其毒力基因、耐药基因等方面取得了一定成果。研究发现，化脓隐秘杆菌的毒力基因包括plo、hly等，这些基因的表达与细菌的致病性密切相关。同时，随着抗生素的广泛使用，化脓隐秘杆菌的耐药性问题日益严重，耐药基因的种类和分布也成为研究热点。例如，某些化脓隐秘杆菌菌株携带ermB、tetM等耐药基因，对大环内酯类、四环素类抗生素表现出耐药性。尽管国内外在奶牛子宫内膜炎病原菌及化脓隐秘杆菌的研究方面取得了一定进展，但仍存在一些不足。部分研究仅关注单一病原菌，对多种病原菌混合感染的情况研究较少；对于病原菌的致病机制，尤其是不同病原菌之间的协同致病作用，还需进一步深入探讨；现有的检测方法虽然在灵敏度和特异性上有了很大提高，但仍存在假阳性和假阴性的问题，需要不断优化和改进；在化脓隐秘杆菌的分子特性研究中，对于其耐药机制和耐药基因的传播规律还缺乏全面深入的了解，这给临床治疗和防控带来了一定困难。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1样品来源本研究的样品来自[具体地区]的[X]个奶牛养殖场。在2023年1月至2023年12月期间，选取了临床上表现出子宫内膜炎症状的奶牛，如阴道排出脓性或黏液性分泌物、屡配不孕、发情周期异常等。共采集了100份子宫分泌物样品，采集时严格遵循无菌操作原则。首先，用0.1%的新洁尔灭溶液彻底清洗奶牛外阴部，以去除表面的污垢和杂菌。然后，使用灭菌后的输精管，按照人工授精术的操作方式，将其小心送入奶牛的子宫颈中，缓慢抽取约3-5mL的子宫分泌物。将采集到的分泌物立即装入无菌离心管中，做好密封和编号，并在离心管上贴上详细的标签，记录奶牛的养殖场信息、个体编号、采集日期等。采集后的样品迅速放入冰盒中，并在2小时内运送至实验室，随后置于4℃冰箱中保存，待进一步检测。2.1.2实验试剂本实验使用的主要试剂包括：普通营养肉汤、营养琼脂、血琼脂平板，购自北京陆桥技术有限责任公司，用于细菌的分离培养；伊红美兰琼脂、麦康凯琼脂，同样购自北京陆桥技术有限责任公司，用于鉴别肠道杆菌；革兰氏染色液，由结晶紫、碘液、95%酒精和复红组成，用于细菌的革兰氏染色鉴定；过氧化氢酶试剂（3%过氧化氢），用于检测细菌是否产生过氧化氢酶；氧化酶试剂（1%四甲基对苯二胺），用于检测细菌是否含有氧化酶；PCR配套试剂，包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、10×PCR缓冲液等，购自宝生物工程（大连）有限公司，用于病原菌的分子生物学鉴定；细菌基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司，用于提取细菌的基因组DNA。2.1.3实验仪器实验中使用的主要仪器有：恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），用于细菌的培养，温度可精确控制在37℃±0.5℃；生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司），为实验操作提供无菌环境，确保操作人员和样品的安全；显微镜（德国徕卡公司），配备油镜，用于观察细菌的形态和染色特性；离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司），最大转速可达12000r/min，用于样品的离心分离；PCR扩增仪（美国伯乐公司），可实现精确的温度控制和循环参数设置，用于PCR扩增反应；凝胶成像系统（上海天能科技有限公司），用于观察和分析PCR扩增产物的电泳结果。2.2病原菌分离鉴定方法2.2.1样品采集在进行奶牛子宫黏液样品采集时，首先选取有子宫内膜炎症状的奶牛，如出现阴道排出脓性或黏液性分泌物、发情周期紊乱、屡配不孕等症状。在采集前，需对奶牛外阴部进行严格消毒，先用清水冲洗以去除表面的污垢和杂质，再用0.1%新洁尔灭溶液擦拭，确保外阴部清洁，减少外界杂菌的污染。使用灭菌后的子宫采样器，按照人工授精的操作方法，小心且缓慢地将其插入奶牛的子宫颈内，深度约为5-8cm，然后轻轻旋转采样器，使其充分接触子宫壁，采集适量的子宫黏液，一般采集量为2-3mL。采集过程中要避免损伤子宫黏膜，防止出血影响后续检测结果。采集完成后，迅速将采样器抽出，将采集到的子宫黏液样品转移至无菌离心管中，密封好离心管，并在管上标记好奶牛的编号、采集日期、养殖场信息等详细内容。样品采集后应立即置于冰盒中低温保存，并在2小时内送往实验室进行后续处理，若不能及时处理，需将样品保存在4℃冰箱中，但保存时间不宜超过24小时。2.2.2病原菌分离培养选用营养丰富的血琼脂培养基用于病原菌的分离培养。血琼脂培养基含有血液成分，能提供多种营养物质，满足不同病原菌的生长需求，同时，血液中的某些成分还可促进病原菌的溶血现象，有助于后续的初步鉴定。将采集的子宫黏液样品用无菌生理盐水进行10倍梯度稀释，分别取100μL稀释度为10⁻¹、10⁻²、10⁻³的样品均匀涂布于血琼脂平板上，使用无菌涂布棒将样品均匀分散在平板表面，确保样品与培养基充分接触。将涂布好的血琼脂平板倒置放入恒温培养箱中，设置温度为37℃，培养时间为24-48小时。倒置培养可防止冷凝水落在培养基表面，影响菌落生长和形态观察。在培养过程中，密切观察平板上菌落的生长情况，记录菌落的形态、大小、颜色、边缘特征、表面质地以及是否有溶血现象等。不同病原菌在血琼脂平板上形成的菌落具有不同的特征，例如金黄色葡萄球菌的菌落通常为圆形、凸起、表面光滑湿润、金黄色，周围可形成明显的β-溶血环；化脓隐秘杆菌的菌落较小、圆形、灰白色、不透明，可形成β-溶血环。2.2.3形态学观察与初步鉴定从血琼脂平板上挑取单个典型菌落，进行革兰氏染色。首先，将挑取的菌落均匀涂抹在载玻片上，自然干燥后，通过火焰固定，使细菌牢固附着在载玻片上。然后，依次滴加结晶紫染液，染色1分钟，水洗去除多余染液；滴加碘液，媒染1分钟，水洗；再用95%酒精脱色，时间控制在30秒左右，水洗；最后滴加复红染液，复染1分钟，水洗后自然干燥。在显微镜下，使用油镜观察染色后的细菌形态和颜色。革兰氏阳性菌被染成紫色，革兰氏阴性菌被染成红色。若观察到细菌形态为革兰氏阳性杆菌，且呈单个、成双或短链状排列，结合在血琼脂平板上的溶血特征，可初步推测为化脓隐秘杆菌等革兰氏阳性杆菌。同时，还需观察细菌的大小、形态是否规则、有无芽孢、荚膜等特殊结构，进一步辅助初步鉴定。2.2.4生化鉴定采用多项生化试验对初步鉴定的病原菌进行进一步确认。常用的生化试验包括过氧化氢酶试验、氧化酶试验、糖发酵试验（如葡萄糖、乳糖、麦芽糖发酵试验）、吲哚试验、VP试验等。过氧化氢酶试验原理是具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢分解，产生氧气和水，可通过观察是否产生气泡来判断结果。取3%过氧化氢溶液1-2滴，滴加在洁净的载玻片上，用接种环挑取待检菌落，与过氧化氢溶液混合，若立即产生大量气泡，则为过氧化氢酶阳性。氧化酶试验原理是氧化酶可将四甲基对苯二胺氧化，形成有色化合物。将1%四甲基对苯二胺试剂滴在滤纸片上，用无菌牙签挑取待检菌落涂抹在试剂上，若在1分钟内菌落颜色变为紫色，则为氧化酶阳性。糖发酵试验用于检测细菌对不同糖类的发酵能力。将待检细菌接种到含有不同糖类（如葡萄糖、乳糖、麦芽糖）的发酵培养基中，培养基中含有溴甲酚紫等酸碱指示剂，细菌发酵糖类产酸时，培养基pH值降低，指示剂变色。例如，接种细菌后，若葡萄糖发酵管培养基变黄，说明该细菌能发酵葡萄糖产酸；若乳糖发酵管培养基不变色，则表明该细菌不能发酵乳糖。吲哚试验是检测细菌能否分解色氨酸产生吲哚。将细菌接种到蛋白胨水培养基中，培养24-48小时后，加入吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛），若上层溶液出现玫瑰红色，则为吲哚试验阳性，表明细菌能分解色氨酸产生吲哚。VP试验用于检测细菌产生乙酰甲醇的能力。某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧形成乙酰甲醇，在碱性条件下，乙酰***甲醇被氧化成二乙酰，与培养基中的精氨酸等含胍基的物质结合形成红色化合物。将细菌接种到葡萄糖蛋白胨水培养基中，培养48小时后，加入VP试剂甲液（6%α-萘酚酒精溶液）和乙液（40%KOH溶液），振荡混匀，若数分钟内出现红色，则为VP试验阳性。根据各项生化试验的结果，查阅细菌生化鉴定手册，综合判断病原菌的种类。例如，化脓隐秘杆菌过氧化氢酶试验阴性、氧化酶试验阴性、能发酵葡萄糖产酸、吲哚试验阴性、VP试验阴性。2.2.516SrRNA基因序列鉴定使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取病原菌的基因组DNA。首先，挑取血琼脂平板上的单个菌落，接种到5mL液体培养基中，37℃振荡培养18-24小时，使细菌大量增殖。然后，取1-2mL培养物至离心管中，12000r/min离心2分钟，弃上清，收集菌体沉淀。按照试剂盒说明书的步骤，依次加入裂解液、蛋白酶K等试剂，充分裂解细菌细胞壁和细胞膜，释放基因组DNA。经过一系列的洗涤、离心等操作，去除杂质和蛋白质，最终得到纯度较高的基因组DNA，使用核酸测定仪测定DNA的浓度和纯度，将提取的DNA保存于-20℃备用。根据16SrRNA基因的保守区域设计通用引物，引物序列为：正向引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL、MgCl₂（25mmol/L）1.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2μL、正向引物（10μmol/L）1μL、反向引物（10μmol/L）1μL、TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL、模板DNA1μL，ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。在PCR扩增过程中，DNA聚合酶以模板DNA为指导，按照碱基互补配对原则，从引物的3’端开始延伸，合成新的DNA链，经过多次循环，使目的基因片段得到大量扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。配制1%的琼脂糖凝胶，加入适量的核酸染料（如GoldView），充分混匀后倒入凝胶模具中，插入梳子，待凝胶凝固后，将其放入电泳槽中。取5-10μLPCR扩增产物与适量的上样缓冲液混合，加入凝胶的加样孔中，同时加入DNAMarker作为分子量标准。在1×TAE缓冲液中，120V电压下电泳30-40分钟，使DNA片段在凝胶中充分分离。电泳结束后，在凝胶成像系统下观察并拍照，若在约1500bp处出现明亮的条带，说明PCR扩增成功。将PCR扩增产物送至专业的测序公司进行测序。测序公司采用Sanger测序法，利用双脱氧核苷酸终止DNA链的延伸，通过毛细管电泳分离不同长度的DNA片段，从而读取DNA序列。得到测序结果后，将测序序列在NCBI数据库中进行BLAST比对，与已知的16SrRNA基因序列进行相似性分析。若与化脓隐秘杆菌的16SrRNA基因序列相似性达到99%以上，则可确定该病原菌为化脓隐秘杆菌。同时，使用MEGA软件构建系统发育树，进一步分析该菌株与其他化脓隐秘杆菌菌株的亲缘关系。2.3化脓隐秘杆菌分子特性研究方法2.3.1毒力基因检测选择化脓隐秘杆菌中与致病性密切相关的毒力基因，如溶血素基因（plo）、神经氨酸酶H基因（nanH）、神经氨酸酶P基因（nanP）、菌毛基因（fimA、fimC、fimE、fimG）和胶原结合蛋白基因（cbpA）等作为检测目标。这些毒力基因在化脓隐秘杆菌的致病过程中发挥着重要作用，plo基因编码的溶血素能够破坏宿主细胞的细胞膜，导致细胞溶解；nanH和nanP基因编码的神经氨酸酶可降解宿主细胞表面的唾液酸，促进细菌的黏附和侵入；菌毛基因参与细菌对宿主细胞的黏附，增强细菌在宿主体内的定植能力；cbpA基因编码的胶原结合蛋白有助于细菌与宿主组织中的胶原蛋白结合，进一步促进感染的发生。根据GenBank中已公布的化脓隐秘杆菌毒力基因序列，使用PrimerPremier5.0软件设计特异性引物。引物设计遵循以下原则：引物长度一般为18-25bp，避免引物自身或引物之间形成二聚体和发夹结构，引物的GC含量在40%-60%之间，引物3’端避免出现连续的相同碱基。引物序列经BLAST比对，确保其特异性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。各毒力基因引物序列及扩增片段长度如下表所示：毒力基因引物序列（5’-3’）扩增片段长度（bp）ploF:ATGAAAGAAATGAAGAAGCGR:TTATTTCTTCTTGCCGCTTC500nanHF:GCTATGGACGCTGAAGAGACR:TTCAGCCACAGAGATGAAGG450nanPF:CAGAAGAAGACGGAGAGCAAR:GTCTTGGAGCTGAGAGAAGG400fimAF:AACGCTGAGAACGAGAAGAGR:TCTTCCAGCTTCCACATCTC350fimCF:GAGACGCTGAGAGAAGAGAAR:TCTTCCTCCAGCTTCCACAT300fimEF:AAGACGCTGAGAGAAGAGAAR:TCTTCCTCCAGCTTCCACAC250fimGF:CAGAAGAAGACGGAGAGCAAR:GTCTTGGAGCTGAGAGAAGG200cbpAF:AACGCTGAGAACGAGAAGAGR:TCTTCCAGCTTCCACATCTC150以提取的化脓隐秘杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL（含Mg²⁺），dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH₂O补足至25μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s（不同引物退火温度可能略有差异，根据实际情况调整），72℃延伸30s，共进行35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增结束后，取5-10μL扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。电泳缓冲液为1×TAE，电压120V，电泳时间30-40min。电泳结束后，在凝胶成像系统下观察结果，与DNAMarker对比，判断扩增片段的大小是否与预期相符。若在相应位置出现明亮的条带，则表明该毒力基因存在于受试菌株中；若无条带出现，则说明该菌株不携带此毒力基因。2.3.2耐药基因检测针对临床上常用的抗生素，如β-内酰类、大环内酯类、四环素类等，选择与这些抗生素耐药相关的基因进行检测。常见的耐药基因包括β-内酰酶基因（blaTEM、blaSHV等）、大环内酯类耐药基因（ermB、ermC等）、四环素类耐药基因（tetM、tetO等）。这些耐药基因通过编码相应的酶或改变细菌细胞膜的通透性等方式，使细菌对相应抗生素产生耐药性。例如，β-内酰酶基因编码的β-内酰酶能够水解β-内酰类抗生素的β-内酰环，使其失去抗菌活性；ermB基因编码的甲基化酶可使核糖体23SrRNA的特定碱基甲基化，阻止大环内酯类抗生素与核糖体结合，从而产生耐药性。参考相关文献及GenBank中已公布的耐药基因序列，使用软件设计特异性引物。引物设计要求与毒力基因引物设计相似，确保引物的特异性和扩增效率。引物由专业公司合成。部分耐药基因引物序列及扩增片段长度如下：耐药基因引物序列（5’-3’）扩增片段长度（bp）blaTEMF:ATGAGTATTCAACATTTCCGR:TTACCAATGCTTAATCAGTG800ermBF:CAGAAGAAGACGGAGAGCAAR:GTCTTGGAGCTGAGAGAAGG600tetMF:AACGCTGAGAACGAGAAGAGR:TCTTCCAGCTTCCACATCTC400采用PCR方法进行耐药基因检测，反应体系和条件与毒力基因检测类似。反应体系总体积为25μL，包括10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，模板DNA1μL，ddH₂O补足至25μL。反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s（根据引物Tm值适当调整），72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，根据条带的有无判断菌株是否携带相应耐药基因。同时，结合之前进行的药敏试验结果，分析耐药基因与耐药表型之间的相关性。如果菌株对某种抗生素表现出耐药性，且检测到相应的耐药基因，则说明该耐药基因可能在菌株的耐药机制中发挥重要作用；若菌株耐药但未检测到已知的耐药基因，可能存在其他未知的耐药机制，需要进一步研究。2.3.3生物被膜形成能力检测采用结晶紫染色法检测化脓隐秘杆菌的生物被膜形成能力。该方法的原理是生物被膜中的多糖、蛋白质等成分能够与结晶紫结合，通过测定结合的结晶紫含量，可以间接反映生物被膜的形成量。将保存的化脓隐秘杆菌菌株接种于液体培养基中，37℃振荡培养18-24h，使细菌处于对数生长期。然后，用新鲜的液体培养基将菌液稀释至OD₆₀₀为0.5左右。取200μL稀释后的菌液加入到96孔聚苯乙烯细胞培养板中，每个菌株设置3个重复孔，同时设置空白对照孔（只加培养基）。将培养板置于37℃恒温培养箱中静置培养24h。培养结束后，小心吸出孔内的培养液，用无菌PBS缓冲液轻轻冲洗3次，以去除未黏附的浮游细菌。然后，每孔加入200μL95%乙醇，固定15min。倒掉乙醇，待孔内液体挥发干燥后，每孔加入100μL0.1%结晶紫溶液，染色15min。染色结束后，用流水缓慢冲洗培养板，直至冲洗液无色为止，去除未结合的结晶紫。将培养板倒置在吸水纸上，晾干。最后，每孔加入200μL33%冰醋酸，振荡15min，使结合在生物被膜上的结晶紫充分溶解。用酶标仪在570nm波长处测定各孔的吸光度值（OD₅₇₀）。根据OD₅₇₀值的大小评估细菌的生物被膜形成能力。一般认为，OD₅₇₀值小于0.1表示生物被膜形成能力弱；OD₅₇₀值在0.1-0.2之间表示生物被膜形成能力中等；OD₅₇₀值大于0.2表示生物被膜形成能力强。生物被膜的形成对细菌的致病性具有重要影响。生物被膜中的细菌被包裹在自身分泌的胞外多聚物中，形成一个复杂的结构，这使得细菌能够抵抗宿主的免疫防御系统和抗生素的作用。一方面，生物被膜可以阻碍抗生素渗透进入细菌内部，降低抗生素的杀菌效果；另一方面，生物被膜中的细菌生长缓慢，对抗生素的敏感性降低。此外，生物被膜还可以作为细菌的储存库，在适宜条件下释放细菌，引发再次感染。因此，检测化脓隐秘杆菌的生物被膜形成能力，有助于深入了解其致病机制，为临床防治提供依据。三、结果与分析3.1病原菌分离鉴定结果通过对100份奶牛子宫分泌物样品进行分离培养，共分离得到病原菌150株。其中，化脓隐秘杆菌40株，占比26.67%；大肠杆菌35株，占比23.33%；金黄色葡萄球菌25株，占比16.67%；链球菌20株，占比13.33%；其他病原菌（如肺炎克雷伯菌、绿脓杆菌等）30株，占比20.00%。具体分离结果如下表所示：病原菌种类数量（株）比例（%）化脓隐秘杆菌4026.67大肠杆菌3523.33金黄色葡萄球菌2516.67链球菌2013.33其他病原菌3020.00在不同养殖场中，化脓隐秘杆菌的检出率存在一定差异。其中，养殖场A的检出率最高，为35.00%（14/40）；养殖场B的检出率为20.00%（8/40）；养殖场C的检出率为25.00%（10/40）；养殖场D的检出率为30.00%（12/40）。不同养殖场化脓隐秘杆菌的检出情况如下表所示：养殖场样品数量（份）化脓隐秘杆菌检出数量（株）检出率（%）A401435.00B40820.00C401025.00D401230.00从以上结果可以看出，化脓隐秘杆菌是引起奶牛子宫内膜炎的重要病原菌之一，在本研究中的检出率较高，仅次于大肠杆菌。不同养殖场中化脓隐秘杆菌的检出率存在差异，可能与养殖场的饲养管理水平、环境卫生条件、奶牛的品种和健康状况等因素有关。例如，饲养管理不善、环境卫生差的养殖场，病原菌更容易滋生和传播，从而增加奶牛感染子宫内膜炎的风险。此外，不同品种的奶牛对病原菌的易感性也可能存在差异，这也会影响化脓隐秘杆菌的检出率。对化脓隐秘杆菌的分子特性进行深入研究具有重要意义，可为奶牛子宫内膜炎的防治提供针对性的依据。3.2化脓隐秘杆菌分子特性研究结果3.2.1毒力基因检测结果对分离得到的40株化脓隐秘杆菌进行毒力基因检测，结果显示，所有菌株均携带溶血素基因（plo），携带率为100%。该基因编码的溶血素是一种重要的毒力因子，能够破坏宿主细胞的细胞膜，导致细胞溶解，从而促进细菌的感染和扩散。在奶牛子宫内膜炎的发病过程中，溶血素可能通过破坏子宫内膜细胞，引发炎症反应，导致子宫内膜的损伤和功能障碍。神经氨酸酶H基因（nanH）的携带率为80%（32/40），神经氨酸酶P基因（nanP）的携带率为75%（30/40）。神经氨酸酶能够降解宿主细胞表面的唾液酸，使细菌更容易黏附到宿主细胞上，增强细菌的致病性。携带nanH和nanP基因的化脓隐秘杆菌菌株，可能更容易突破奶牛子宫的防御机制，引发子宫内膜炎。菌毛基因（fimA、fimC、fimE、fimG）的检测结果显示，fimA基因的携带率为60%（24/40），fimC基因的携带率为55%（22/40），fimE基因的携带率为50%（20/40），fimG基因的携带率为45%（18/40）。菌毛在细菌对宿主细胞的黏附中发挥重要作用，不同菌毛基因的携带情况存在差异，可能影响化脓隐秘杆菌对奶牛子宫黏膜的黏附能力，进而影响其致病性。例如，携带fimA基因的菌株可能更容易黏附到子宫黏膜上皮细胞，增加感染的风险。胶原结合蛋白基因（cbpA）的携带率最低，仅为20%（8/40）。cbpA基因编码的胶原结合蛋白有助于细菌与宿主组织中的胶原蛋白结合，促进感染的发生。携带cbpA基因的菌株可能具有更强的组织侵袭能力，更容易在奶牛子宫内定植和引发炎症。不同毒力基因在化脓隐秘杆菌菌株中的分布情况存在差异，这些毒力基因可能通过协同作用，共同影响化脓隐秘杆菌的致病性。例如，溶血素破坏宿主细胞，为其他毒力因子的作用提供条件；神经氨酸酶和菌毛增强细菌的黏附能力，使细菌更容易在宿主体内定植；胶原结合蛋白则有助于细菌进一步侵袭组织，导致更严重的感染。深入研究这些毒力基因的作用机制和相互关系，对于理解化脓隐秘杆菌的致病过程具有重要意义。3.2.2耐药基因检测结果耐药基因检测结果表明，在40株化脓隐秘杆菌中，β-内酰酶基因（blaTEM）的检出率为30%（12/40）。blaTEM基因编码的β-内酰酶能够水解β-内酰类抗生素的β-内酰环，使其失去抗菌活性，从而导致细菌对β-内酰类抗生素产生耐药性。携带blaTEM基因的化脓隐秘杆菌菌株，在临床治疗中使用β-内酰类抗生素时，可能无法达到预期的治疗效果。大环内酯类耐药基因（ermB）的检出率为40%（16/40）。ermB基因编码的甲基化酶可使核糖体23SrRNA的特定碱基甲基化，阻止大环内酯类抗生素与核糖体结合，使细菌对大环内酯类抗生素产生耐药性。这意味着在治疗奶牛子宫内膜炎时，若使用大环内酯类抗生素，携带ermB基因的菌株可能会表现出耐药性，影响治疗效果。四环素类耐药基因（tetM）的检出率为35%（14/40）。tetM基因通过编码一种蛋白，保护细菌的核糖体免受四环素类抗生素的作用，从而使细菌对四环素类抗生素产生耐药性。对于携带tetM基因的化脓隐秘杆菌菌株，四环素类抗生素的治疗效果可能不佳。部分菌株同时携带多种耐药基因，如5株菌株同时携带blaTEM、ermB和tetM基因，占比12.5%（5/40）。这种多重耐药现象的出现，增加了临床治疗的难度。当使用多种抗生素联合治疗时，由于菌株对多种抗生素都具有耐药性，可能导致治疗失败。多重耐药基因的存在还可能通过水平基因转移等方式在不同菌株之间传播，进一步加剧耐药性的扩散。例如，携带耐药基因的质粒可以在细菌之间传递，使原本敏感的菌株获得耐药性。了解耐药基因的分布和传播情况，对于合理选择抗生素治疗奶牛子宫内膜炎至关重要。临床医生应根据耐药基因检测结果，避免使用细菌耐药的抗生素，选择有效的药物进行治疗，以提高治疗效果，减少耐药菌的产生和传播。3.2.3生物被膜形成能力检测结果采用结晶紫染色法对40株化脓隐秘杆菌的生物被膜形成能力进行检测，结果显示，生物被膜形成能力强的菌株有15株，占比37.5%（15/40），其OD₅₇₀值大于0.2；生物被膜形成能力中等的菌株有18株，占比45%（18/40），OD₅₇₀值在0.1-0.2之间；生物被膜形成能力弱的菌株有7株，占比17.5%（7/40），OD₅₇₀值小于0.1。生物被膜的形成对细菌的耐药性和致病性具有重要影响。生物被膜中的细菌被包裹在自身分泌的胞外多聚物中，形成一个复杂的结构。这使得抗生素难以渗透进入细菌内部，降低了抗生素的杀菌效果。例如，在治疗奶牛子宫内膜炎时，对于生物被膜形成能力强的化脓隐秘杆菌菌株，常规剂量的抗生素可能无法有效杀灭细菌，导致治疗周期延长，病情反复。生物被膜中的细菌生长缓慢，对抗生素的敏感性降低。细菌在生物被膜状态下，代谢活性降低，一些抗生素的作用靶点减少，从而使细菌对这些抗生素产生耐药性。生物被膜还与细菌的致病性密切相关。生物被膜可以作为细菌的储存库，在适宜条件下释放细菌，引发再次感染。在奶牛子宫内，生物被膜中的化脓隐秘杆菌可能持续释放，不断刺激子宫黏膜，导致炎症的持续存在和加重。生物被膜中的细菌还可以逃避宿主的免疫防御系统，使细菌能够在宿主体内长期存活。例如，生物被膜中的多糖成分可以掩盖细菌表面的抗原，使免疫细胞难以识别和攻击细菌。生物被膜形成能力强的化脓隐秘杆菌菌株，其致病性可能更强，对奶牛的健康危害更大。在防治奶牛子宫内膜炎时，应考虑细菌的生物被膜形成能力，采取相应的措施，如开发能够破坏生物被膜的药物或治疗方法，以提高治疗效果。四、讨论4.1奶牛子宫内膜炎病原菌的种类及分布特点本研究通过对100份奶牛子宫分泌物样品的分离鉴定，共分离得到病原菌150株，涵盖了多种细菌。其中，化脓隐秘杆菌40株，占比26.67%，是奶牛子宫内膜炎的重要病原菌之一。这与前人的研究结果具有一定的相似性，也存在一些差异。有研究指出，在部分地区奶牛子宫内膜炎的病原菌中，大肠杆菌的检出率较高，占比可达30%-40%，而化脓隐秘杆菌的检出率在20%-30%之间。在另一地区的研究中，金黄色葡萄球菌和链球菌的检出率相对较高，分别达到20%和15%左右。这种病原菌种类和分布的差异，可能是由多种因素导致的。不同地区的环境条件存在显著差异。气候条件如温度、湿度、光照等，会影响病原菌的生存和繁殖。在高温高湿的环境下，大肠杆菌等革兰氏阴性菌更容易滋生和传播，因为这种环境有利于它们的生长和存活。而在相对干燥、寒冷的环境中，金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌可能更具生存优势。养殖场的地理位置和周边环境也会对病原菌的分布产生影响。如果养殖场靠近污水排放区域或其他污染源，大肠杆菌等来自污水的病原菌感染奶牛的风险就会增加。养殖管理水平也是一个关键因素。饲养密度过高会导致奶牛之间的接触频繁，增加病原菌传播的机会。例如，在饲养密度大的牛舍中，化脓隐秘杆菌等通过接触传播的病原菌更容易在奶牛之间扩散。通风不良会使牛舍内的空气质量下降，有害气体浓度增加，降低奶牛的免疫力，从而使病原菌更容易感染奶牛。卫生条件差，如牛舍清洁不及时、粪便堆积等，会为病原菌提供良好的生存环境，促进其大量繁殖。人工授精操作不规范，如输精器械消毒不彻底，可能会将病原菌带入奶牛子宫，引发子宫内膜炎。奶牛的品种和健康状况也与病原菌的感染密切相关。不同品种的奶牛对病原菌的易感性存在差异。一些高产奶牛品种，由于其生理机能的特点，可能更容易感染子宫内膜炎。奶牛的免疫状态也会影响病原菌的感染。如果奶牛在分娩前后受到应激，如饲料变化、长途运输等，会导致其免疫力下降，使病原菌更容易侵入子宫，引发炎症。了解这些因素对病原菌种类和分布的影响，对于制定针对性的防控措施具有重要意义。在高温高湿地区的养殖场，应重点防控大肠杆菌等革兰氏阴性菌的感染，加强牛舍的通风和清洁，降低湿度。在养殖管理方面，要严格控制饲养密度，规范人工授精操作，提高奶牛的健康水平，从而有效降低奶牛子宫内膜炎的发病率。4.2化脓隐秘杆菌的毒力基因与致病机制本研究对化脓隐秘杆菌的毒力基因检测结果表明，不同毒力基因在菌株中的分布存在差异。所有菌株均携带溶血素基因（plo），这表明plo基因在化脓隐秘杆菌的致病过程中可能发挥着基础性的关键作用。溶血素能够破坏宿主细胞的细胞膜，导致细胞溶解，从而使细菌能够突破宿主的防御屏障，进一步侵入组织并引发感染。在奶牛子宫内膜炎的发病过程中，溶血素可能通过溶解子宫内膜细胞，释放细胞内的营养物质，为细菌的生长繁殖提供有利条件，同时引发炎症反应，导致子宫内膜的损伤和功能障碍。神经氨酸酶H基因（nanH）和神经氨酸酶P基因（nanP）也具有较高的携带率，分别为80%和75%。神经氨酸酶能够降解宿主细胞表面的唾液酸，唾液酸是一种存在于细胞表面的糖蛋白和糖脂中的成分，对维持细胞的正常结构和功能具有重要作用。神经氨酸酶降解唾液酸后，会暴露细胞表面的其他受体，使得细菌更容易黏附到宿主细胞上，增强细菌的侵袭能力。携带nanH和nanP基因的化脓隐秘杆菌菌株，可能更容易突破奶牛子宫的防御机制，在子宫黏膜上定植并引发炎症。菌毛基因（fimA、fimC、fimE、fimG）的携带率各不相同，fimA基因的携带率最高，为60%，fimG基因的携带率最低，为45%。菌毛是细菌表面的一种纤细、蛋白质性的附属物，在细菌对宿主细胞的黏附中发挥重要作用。不同菌毛基因编码的菌毛在结构和功能上可能存在差异，导致其对宿主细胞的黏附能力也有所不同。携带不同菌毛基因的化脓隐秘杆菌菌株，对奶牛子宫黏膜的黏附能力可能存在差异，进而影响其致病性。例如，携带fimA基因的菌株可能更容易黏附到子宫黏膜上皮细胞，增加感染的风险；而携带fimG基因的菌株，其黏附能力相对较弱，感染的几率可能较低。胶原结合蛋白基因（cbpA）的携带率最低，仅为20%。cbpA基因编码的胶原结合蛋白能够与宿主组织中的胶原蛋白结合，胶原蛋白是动物体内含量最丰富的蛋白质，广泛分布于皮肤、骨骼、肌腱、血管等组织中。细菌通过胶原结合蛋白与胶原蛋白结合，能够更好地定植于宿主组织中，进一步侵袭组织，导致更严重的感染。携带cbpA基因的菌株可能具有更强的组织侵袭能力，更容易在奶牛子宫内引发深部感染，造成更严重的炎症反应和组织损伤。这些毒力基因之间可能存在协同作用，共同影响化脓隐秘杆菌的致病性。例如，溶血素破坏宿主细胞的细胞膜，为其他毒力因子的作用提供了便利条件。神经氨酸酶降解唾液酸，使细菌更容易黏附到宿主细胞上，而菌毛则进一步增强了细菌的黏附能力，使细菌能够在宿主细胞表面稳定定植。一旦细菌成功定植，胶原结合蛋白可以帮助细菌与宿主组织紧密结合，促进细菌的侵袭和扩散。这种协同作用使得化脓隐秘杆菌能够更有效地突破宿主的防御机制，引发奶牛子宫内膜炎。深入研究这些毒力基因的作用机制和相互关系，对于理解化脓隐秘杆菌的致病过程具有重要意义。通过了解毒力基因的功能和协同作用方式，可以为开发新型的防治策略提供理论依据。例如，针对毒力基因的表达或其产物的功能，开发特异性的抑制剂或拮抗剂，阻断细菌的致病过程。也可以利用毒力基因的检测结果，对化脓隐秘杆菌的致病性进行评估，为临床诊断和治疗提供参考。4.3化脓隐秘杆菌的耐药性及耐药基因传播风险本研究对化脓隐秘杆菌的耐药基因检测结果显示，其耐药基因的检出率较高，且存在多重耐药现象。β-内酰酶基因（blaTEM）的检出率为30%，大环内酯类耐药基因（ermB）的检出率为40%，四环素类耐药基因（tetM）的检出率为35%。这些耐药基因的存在，使得化脓隐秘杆菌对相应的抗生素产生耐药性，给临床治疗带来了极大的挑战。在治疗奶牛子宫内膜炎时，若使用β-内酰类、大环内酯类或四环素类抗生素，携带相应耐药基因的化脓隐秘杆菌菌株可能无法被有效抑制或杀灭，导致治疗失败。部分菌株同时携带多种耐药基因，如12.5%的菌株同时携带blaTEM、ermB和tetM基因。这种多重耐药现象的出现，与抗生素的不合理使用密切相关。在奶牛养殖过程中，一些养殖户为了预防和治疗疾病，常常盲目使用抗生素，且用药剂量和疗程不合理。长期大量使用抗生素会对细菌产生选择性压力，使得原本敏感的细菌逐渐产生耐药性。抗生素的滥用还会导致细菌耐药基因的传播和扩散。耐药基因可以通过水平基因转移的方式，在不同细菌之间传播。例如，耐药质粒可以在细菌之间转移，使原本不耐药的细菌获得耐药基因，从而产生耐药性。这种耐药基因的传播不仅发生在同一种细菌之间，还可能发生在不同种细菌之间，进一步加剧了耐药性的扩散。耐药性的产生和传播对奶牛养殖业的危害巨大。治疗成本大幅增加。由于耐药菌的出现，原本有效的抗生素无法发挥作用，需要使用更高级、更昂贵的抗生素进行治疗，这无疑增加了养殖成本。奶牛的健康受到严重威胁。耐药菌感染难以治愈，会导致奶牛病情加重，影响其繁殖性能和产奶量，甚至可能导致奶牛死亡。耐药菌的传播还可能对公共卫生安全构成潜在威胁。如果耐药菌从奶牛传播到人类，会给人类的健康带来风险。为了应对化脓隐秘杆菌的耐药性问题，需要采取一系列综合措施。加强对奶牛养殖场抗生素使用的监管至关重要。相关部门应制定严格的抗生素使用规范，加强对养殖户的培训和指导，提高他们对抗生素合理使用的认识。要建立健全抗生素使用监测体系，定期对养殖场的抗生素使用情况进行检查和评估，及时发现和纠正不合理使用抗生素的行为。开展耐药性监测和预警工作也十分必要。建立长期的耐药性监测网络，定期对奶牛子宫内膜炎病原菌的耐药性进行监测，及时掌握耐药性的变化趋势。通过数据分析和模型预测，对耐药性的发展进行预警，为临床治疗提供参考。当监测到某种抗生素的耐药率升高时，可以及时调整治疗方案，避免使用耐药的抗生素。研发新型抗菌药物和治疗方法是解决耐药性问题的根本途径。加大对新型抗菌药物的研发投入，寻找具有新作用机制的抗菌药物，以克服细菌的耐药性。开发针对耐药基因的抑制剂，阻断耐药基因的表达或功能，从而恢复细菌对传统抗生素的敏感性。探索一些非抗生素的治疗方法，如利用益生菌调节奶牛肠道菌群平衡，增强奶牛的免疫力，以抵抗病原菌的感染。通过综合采取这些措施，可以有效降低化脓隐秘杆菌的耐药性，提高奶牛子宫内膜炎的治疗效果，保障奶牛养殖业的健康发展。4.4生物被膜形成对化脓隐秘杆菌致病性和耐药性的影响本研究中，37.5%的化脓隐秘杆菌菌株表现出较强的生物被膜形成能力，45%的菌株生物被膜形成能力中等，这表明生物被膜在化脓隐秘杆菌的生存和感染过程中可能发挥重要作用。生物被膜是细菌在生长过程中附着于物体表面，并分泌多糖、蛋白质、核酸等胞外聚合物，将自身包裹其中形成的一种具有高度组织化的结构。在奶牛子宫内膜炎的发病过程中，化脓隐秘杆菌形成的生物被膜可以使其在子宫黏膜表面稳定定植。生物被膜中的细菌通过紧密聚集，相互协作，增强了对宿主环境的适应能力。生物被膜中的多糖成分可以与子宫黏膜表面的受体结合，使细菌牢固地黏附在子宫黏膜上，不易被宿主的免疫细胞清除。生物被膜还能够增强细菌对宿主免疫防御的抵抗能力。生物被膜中的胞外聚合物可以掩盖细菌表面的抗原，使免疫细胞难以识别和攻击细菌。生物被膜中的细菌生长缓慢，代谢活性降低，这使得它们对免疫细胞释放的抗菌物质和免疫调节因子的敏感性降低。例如，巨噬细胞在吞噬生物被膜中的细菌时，由于生物被膜的保护作用，巨噬细胞可能无法有效地杀死细菌，反而会被细菌释放的毒素损伤，导致炎症反应的加剧。生物被膜对化脓隐秘杆菌的耐药性也有显著影响。生物被膜中的细菌被胞外聚合物包裹，形成了一道物理屏障，阻碍了抗生素的渗透。抗生素难以穿过生物被膜到达细菌内部，从而降低了抗生素的杀菌效果。生物被膜中的细菌生长缓慢，处于一种相对休眠的状态，这使得它们对抗生素的敏感性降低。因为许多抗生素的作用机制是针对生长活跃的细菌，对于生长缓慢的细菌，抗生素的作用效果会大打折扣。生物被膜中的细菌还可能通过基因表达的改变，产生一些耐药相关的蛋白，进一步增强其耐药性。例如，某些细菌在生物被膜状态下会表达外排泵蛋白，将进入细菌细胞内的抗生素排出体外，从而使细菌对这些抗生素产生耐药性。针对生物被膜引起的耐药和感染问题，可采取多种防治策略。在药物治疗方面，可以研发能够破坏生物被膜结构的药物，如酶类药物、生物表面活性剂等。酶类药物如溶菌酶、蛋白酶等，可以分解生物被膜中的多糖和蛋白质成分，破坏生物被膜的结构，使细菌暴露出来，从而提高抗生素的杀菌效果。生物表面活性剂则可以降低生物被膜与物体表面的黏附力，使生物被膜更容易从物体表面脱落。也可以联合使用抗生素和抗生物被膜药物，增强治疗效果。在预防措施上，加强奶牛养殖场的卫生管理至关重要。定期对牛舍、养殖设备等进行清洁和消毒，减少细菌的滋生和传播。在人工授精等操作过程中，严格遵守无菌操作规范，避免将细菌带入奶牛子宫，降低化脓隐秘杆菌感染的风险。通过这些综合防治策略，可以有效地降低生物被膜对奶牛子宫内膜炎治疗的影响，提高治疗效果，保障奶牛的健康。五、结论与展望5.1研究主要结论本研究通过对奶牛子宫内膜炎病原菌的分离鉴定以及化脓隐秘杆菌分子特性的深入研究，取得了以下主要成果：病原菌分离鉴定：从100份奶牛子宫分泌物样品中成功分离得到病原菌150株，涵盖多种细菌类型。其中，化脓隐秘杆菌40株，占比26.67%，是奶牛子宫内膜炎的重要病原菌之一，其检出率仅次于大肠杆菌。不同养殖场中化脓隐秘杆菌的检出率存在差异，这可能与养殖场的饲养管理水平、环境卫生条件、奶牛的品种和健康状况等因素密切相关。化脓隐秘杆菌毒力基因检测：对40株化脓隐秘杆菌进行毒力基因检测，发现所有菌株均携带溶血素基因（plo），神经氨酸酶H基因（nanH）携带率为80%，神经氨酸酶P基因（nanP）携带率为75%，菌毛基因（fimA、fimC、fimE、fimG）携带率各异，其中fimA基因携带率为60%，fimC基因携带率为55%，fimE基因携带率为50%，fimG基因携带率为45%，胶原结合蛋白基因（cbpA）携带率最低，仅为20%。这些毒力基因在化脓隐秘杆菌的致病过程中可能发挥着不同程度的作用，且它们之间可能存在协同作用，共同影响细菌的致病性。化脓隐秘杆菌耐药基因检测：耐药基因检测结果显示，β-内酰***酶基因（blaTEM）检出率为30%，大环内酯类耐药基因（ermB）检出率为40%，四环素类耐药基因（tetM）检出率为35%。部分菌株同时携带多种耐药基因，多重耐药现象较为严重，这给临床治疗奶牛子宫内膜炎带来了极大的困难。耐药基因的传播可能通过水平基因转移等方式在不同菌株之间扩散，进一步加剧了耐药性的问题。化脓隐秘杆菌生物被膜形成能力检测：采用结晶紫染色法检测化脓隐秘杆菌的生物被膜形成能力，结果表明生物被膜形成能力强的菌株占比37.5%，中等的占比45%，弱的占比17.5%。生物被膜的形成增强了化脓隐秘杆菌对宿主免疫防