好氧反硝化细菌的分离、鉴定及特性研究：以具体菌株为例

好氧反硝化细菌的分离、鉴定及特性研究：以[具体菌株]为例一、引言1.1研究背景与意义随着工业化和城市化的快速发展，水体氮污染问题日益严重，已成为全球关注的环境问题之一。水体中氮的主要来源包括工业废水、农业面源污染、生活污水等。工业生产过程中，如化工、制药、食品加工等行业排放的废水中含有大量的氮化合物；农业方面，过量使用化肥以及畜禽养殖废水的排放，使得氮元素大量流入水体；生活污水中含氮的有机物和含氮洗涤剂的排放也是水体氮污染的重要原因。当水体中氮含量超过一定标准时，会引发一系列严重的环境问题。水体氮污染会导致水体富营养化，这是其最为突出的危害之一。过量的氮会促使水中藻类等浮游生物迅速繁殖，形成水华或赤潮现象。这些藻类在生长过程中大量消耗水中的溶解氧，当藻类死亡后，其分解过程进一步加剧溶解氧的消耗，导致水体缺氧，使得鱼类等水生生物因缺氧而窒息死亡，破坏了水生生态系统的平衡，造成生物多样性的减少。据相关研究表明，在一些富营养化严重的湖泊中，水生生物的种类和数量明显下降，部分敏感物种甚至濒临灭绝。水体富营养化还会引发一系列其他问题，如产生异味和毒素，影响饮用水的安全，对人类健康构成潜在威胁。传统的生物脱氮技术基于硝化-反硝化理论，硝化作用由好氧自养型微生物在有氧条件下完成，将氨氮转化为亚硝酸盐氮，再进一步氧化为硝酸盐氮；反硝化作用则由异养型微生物在缺氧状态下，将亚硝酸盐氮和硝酸盐氮还原成气态氮（N₂）。然而，这种传统工艺存在诸多局限性。硝化过程需要大量的氧气供应，能耗较高；反硝化过程需要提供额外的碳源，增加了处理成本；而且硝化和反硝化过程对环境条件的要求不同，通常需要在不同的反应器中进行，导致工艺流程复杂，占地面积大。在这种背景下，好氧反硝化细菌的研究具有重要意义。好氧反硝化细菌突破了传统理论中反硝化必须在厌氧条件下进行的限制，能够在有氧环境中进行反硝化作用。这一特性使得硝化和反硝化过程可以在同一反应器中同时进行，大大简化了工艺流程，减少了占地面积。好氧反硝化细菌还具有生长速度快、适应能力强等优点，能够在更广泛的环境条件下发挥作用，为解决水体氮污染问题提供了新的思路和方法。对好氧反硝化细菌的研究，不仅有助于深入理解生物脱氮的机制，丰富微生物学的理论知识，还能够为开发高效、经济的生物脱氮技术提供科学依据，具有重要的理论和实际应用价值。1.2好氧反硝化细菌研究现状好氧反硝化细菌的发现打破了传统反硝化理论的认知局限。在20世纪80年代之前，传统理论一直认为反硝化是一个严格的厌氧过程，氧气会抑制反硝化还原酶的活性，并且在有机物质氧化过程中，氧气被视为首选的电子受体，在有氧条件下，反硝化菌会优先进行溶解氧呼吸，从而停止将硝酸盐和亚硝酸盐作为最终电子受体。直到1983年，Robertson和Kuenen首次提出了好氧反硝化理论，并在实验室中观察到了有氧条件下的反硝化现象，他们从脱硫脱氮污水处理系统中分离出了第一株好氧反硝化菌株——泛硫球菌（Thiosphaerapantotropha，现更名为脱氮副球菌Paracoccusdenitrificans），这一发现极大地推动了好氧反硝化细菌的研究进程。此后，越来越多的研究开始关注并证实好氧反硝化细菌的存在及特性。经过多年研究，已发现的好氧反硝化细菌种类繁多，分布广泛。它们主要存在于假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）和芽孢杆菌属（Bacillus）等。从生态环境来看，好氧反硝化细菌可从土壤、池塘、沟渠、活性污泥以及各种污水处理系统等不同环境中分离得到。例如，有研究从土壤中分离出具有高效好氧反硝化能力的芽孢杆菌属菌株，该菌株在土壤氮循环中可能发挥着重要作用；还有研究从活性污泥中筛选出副球菌属的好氧反硝化细菌，为污水处理工艺的优化提供了新的微生物资源。不同种类的好氧反硝化细菌在形态、生理生化特性和反硝化能力等方面存在差异，这使得它们在不同的生态系统和应用场景中具有独特的作用。关于好氧反硝化细菌的反硝化作用机制，目前的研究表明，其反硝化过程与厌氧反硝化既有相似之处，又有独特的特点。好氧反硝化作用过程同样包括4个还原步骤，依次由硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶和一氧化二氮还原酶催化完成。但在假想呼吸途径中，好氧反硝化细菌具有特殊之处，即NO₃⁻和O₂均可作为电子最终受体，电子既可以从被还原的有机物基质传递给O₂，也能够传递给NO₃⁻、NO₂⁻和N₂O，并分别将它们还原。与厌氧反硝化相比，好氧反硝化具有一些明显特征：一般好氧反硝化菌的反硝化主要产物是N₂O，而厌氧反硝化菌主要产生N₂以及少量的N₂O和NO；好氧反硝化菌能在好氧条件下进行反硝化，使得硝化和反硝化能够同时进行，这一特性为污水处理工艺的简化提供了理论基础；好氧反硝化菌可将铵态氮在好氧条件下直接转化成气态产物；不过，好氧反硝化菌的反硝化速率相对较慢；催化好氧反硝化菌反硝化的硝酸盐还原酶是周质酶，而非厌氧反硝化菌中的膜结合酶；值得注意的是，特殊的好氧反硝化假单胞菌TR2和K50主要产生N₂，这类特殊菌株可能有助于构建一种不产生N₂O的好氧反硝化模式，减少温室气体的排放，具有重要的环境意义。在好氧反硝化细菌的分离筛选方面，目前常用的方法主要有间歇曝气法、使用选择性培养基或呼吸抑制剂以及使用酸碱指示剂等。间歇曝气法是通过控制曝气时间，营造有氧和缺氧交替的环境，使好氧反硝化细菌在这种特殊环境中得以富集和生长。使用选择性培养基或呼吸抑制剂则是利用好氧反硝化细菌的特殊生理特性，在培养基中添加特定的物质，抑制其他非目标微生物的生长，从而筛选出好氧反硝化细菌。例如，在培养基中添加一定浓度的硝酸盐作为唯一氮源，只有具有反硝化能力的细菌才能利用其生长，同时添加某些呼吸抑制剂，如叠氮化物等，抑制厌氧反硝化菌的生长，从而筛选出好氧反硝化细菌。使用酸碱指示剂的原理是好氧反硝化过程中会产生酸碱变化，通过观察指示剂颜色的改变来判断反硝化作用的发生，进而筛选出目标菌株。好氧反硝化细菌在多个领域展现出了重要的应用价值。在废水生物处理领域，好氧反硝化细菌能够在有氧条件下将废水中的氮污染物转化为气态氮去除，实现硝化和反硝化的同步进行，简化了处理流程，降低了处理成本。例如，在处理含氮的工业废水时，利用好氧反硝化细菌可以有效地去除废水中的氨氮和硝酸盐氮，使出水水质达到排放标准。在水产养殖中，好氧反硝化细菌可以调节养殖水体的氮循环，降低水体中氨氮和亚硝酸盐的浓度，改善养殖环境，减少对水生生物的毒害作用，提高水产养殖的产量和质量。在农业生产中，好氧反硝化细菌可以应用于土壤改良，调节土壤中的氮素含量，减少氮素的流失和环境污染，同时为植物提供更适宜的氮素营养，促进植物的生长和发育。1.3研究目标与内容1.3.1研究目标本研究旨在从富含氮污染物的环境中分离筛选出高效好氧反硝化细菌，并对其进行全面的鉴定和特性研究，以深入了解其反硝化机制和应用潜力。具体目标如下：一是通过设计合理的分离筛选方法，从不同环境样品中分离得到具有高效好氧反硝化能力的细菌菌株，并利用现代微生物鉴定技术准确鉴定其种类，为后续研究提供基础。二是系统研究该菌株的好氧反硝化特性，包括对不同氮源的利用能力、反硝化速率、影响反硝化过程的环境因素（如溶解氧、碳源、pH值、温度等），揭示其在不同条件下的反硝化规律，为优化其应用提供理论依据。三是探索该菌株在实际废水处理中的应用潜力，评估其对不同类型含氮废水的处理效果，考察其在实际应用中的可行性和稳定性，为开发基于好氧反硝化细菌的新型生物脱氮技术提供实践参考。1.3.2研究内容本研究围绕一株好氧反硝化细菌展开，涵盖菌株分离、鉴定、特性研究及实际应用潜力评估等多方面内容。在菌株分离与筛选环节，选择富含氮污染物的典型环境样本，如污水处理厂活性污泥、池塘底泥、农田土壤等，采用间歇曝气法，在实验室模拟有氧和缺氧交替的环境，利用好氧反硝化细菌在这种特殊环境下的生长优势进行富集培养。同时，使用选择性培养基，以硝酸盐为唯一氮源，添加特定的呼吸抑制剂抑制厌氧反硝化菌的生长，从而筛选出好氧反硝化细菌。在培养基中加入酸碱指示剂，利用好氧反硝化过程中产生的酸碱变化来初步判断反硝化作用的发生，辅助筛选出具有反硝化能力的菌株。对初步筛选得到的菌株进行进一步的分离纯化，通过多次平板划线和稀释涂布等操作，确保获得单一的菌株。菌株鉴定方面，从形态学、生理生化特征以及分子生物学特征三个层面进行。观察菌株在固体培养基上的菌落形态，包括大小、形状、颜色、边缘、表面质地等特征，利用显微镜观察其细胞形态、大小、排列方式以及革兰氏染色反应等，初步判断菌株的分类归属。通过一系列生理生化实验，如氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸盐还原试验、明胶液化试验、淀粉水解试验、糖类发酵试验等，测定菌株对不同底物的利用能力和代谢特性，进一步确定其生理生化特征。提取菌株的基因组DNA，以16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，将测序结果与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析，构建系统发育树，明确菌株在微生物分类学中的地位。在反硝化特性研究中，先探究菌株对不同氮源的利用能力，分别以硝酸盐氮、亚硝酸盐氮、氨氮为唯一氮源，配置相应的培养基，接种菌株进行培养，定期测定培养基中氮浓度的变化，分析菌株对不同氮源的利用效率和偏好。再对菌株的反硝化速率进行测定，在适宜的培养条件下，接种一定量的菌株于含有硝酸盐的培养基中，在有氧条件下培养，每隔一定时间取培养液，测定其中硝酸盐氮、亚硝酸盐氮和氮气的含量，计算反硝化速率，绘制反硝化过程曲线。同时研究环境因素对反硝化的影响，分别考察溶解氧、碳源、pH值和温度对菌株反硝化能力的影响。设置不同的溶解氧浓度梯度，通过控制曝气时间或搅拌速度来实现，研究溶解氧对反硝化速率和产物的影响；选择多种常见的碳源，如葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、甲醇等，以不同的碳氮比添加到培养基中，分析碳源种类和碳氮比对反硝化效果的影响；调节培养基的pH值，设置不同的pH梯度，研究菌株在不同pH条件下的反硝化活性；在不同的温度条件下培养菌株，考察温度对反硝化作用的影响，确定菌株反硝化的最适环境条件范围。实际应用潜力评估环节，采用实际含氮废水开展处理实验。选择不同类型的含氮废水，如生活污水、工业废水（如化工废水、制药废水、食品加工废水等），这些废水的成分复杂，氮含量和污染物种类差异较大，更能真实反映菌株在实际应用中的处理效果。在实验室规模的反应器中，接种筛选得到的好氧反硝化细菌，控制合适的反应条件，进行废水处理实验。定期监测废水中总氮、氨氮、硝酸盐氮、亚硝酸盐氮等指标的变化，评估菌株对不同类型废水的脱氮效率和处理效果。连续运行反应器，观察菌株在长期处理废水过程中的稳定性和适应性，分析可能出现的问题，如菌株活性下降、抗冲击能力减弱等，探讨相应的解决措施，评估菌株在实际废水处理中的可行性和应用前景。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1样品来源本研究采集了多种富含氮污染物的环境样品，以期获得高效好氧反硝化细菌。主要样品包括某污水处理厂曝气池活性污泥，该污水处理厂主要处理城市生活污水和部分工业废水，其曝气池中活性污泥长期处于有氧和高氮环境，是好氧反硝化细菌的潜在富集地；附近池塘底泥，池塘水体由于接纳周边居民生活污水和农业面源污染，氮含量较高，底泥中微生物种类丰富，可能存在具有高效反硝化能力的菌株；以及农田土壤，长期施肥使得农田土壤中氮素含量较高，微生物在这种环境中进化出了多样的氮代谢能力，也是筛选好氧反硝化细菌的重要样品来源。在采集样品时，严格遵循采样规范，确保样品的代表性和无污染性。对于活性污泥，使用无菌采样瓶在曝气池不同位置多点采集，混合均匀后装入采样瓶；池塘底泥则使用无菌采泥器，采集表层5-10厘米的底泥，放入无菌密封袋；农田土壤选择在施肥后一段时间，在不同地块多点采集0-20厘米深度的土壤，混合后装入无菌袋。采集后的样品立即放入冰盒中，带回实验室进行后续处理。2.1.2培养基本实验使用了多种培养基，以满足不同阶段的实验需求。富集培养基：用于富集样品中的好氧反硝化细菌。其配方为：KNO₃1g、KH₂PO₄1g、FeCl₂・6H₂O0.05g、CaCl₂・7H₂O0.02g、MgSO₄・7H₂O1g、琥珀酸钠8.5g，蒸馏水1000mL，pH值调节至7.0-7.2。该培养基以硝酸盐为唯一氮源，琥珀酸钠为碳源，其他成分提供细菌生长所需的微量元素和无机盐，有利于好氧反硝化细菌的富集生长。配制时，准确称取各成分，加入适量蒸馏水，加热搅拌使其完全溶解，用1mol/L的NaOH或HCl溶液调节pH值，然后定容至1000mL，分装到三角瓶中，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。初筛培养基（BTB培养基）：用于初步筛选具有好氧反硝化能力的细菌。配方为：琼脂20g、KNO₃1g、KH₂PO₄1g、FeCl₂・6H₂O0.5g、CaCl₂・7H₂O0.2g、MgSO₄・7H₂O1g、琥珀酸钠8.5g、溴百里酚蓝（BTB，1%乙醇溶液）1mL，用1mol/L的NaOH调节pH至7.0-7.3，121℃灭菌20min。溴百里酚蓝作为酸碱指示剂，好氧反硝化过程中会产生酸碱变化，使菌落周围培养基颜色改变，便于初步筛选出具有反硝化能力的菌株。配制时，先将琼脂加入适量蒸馏水中加热融化，再依次加入其他成分，溶解后加入溴百里酚蓝溶液，调节pH值，定容后灭菌。复筛培养基（LB培养基）：用于对初筛菌株进行进一步筛选和培养。配方为：KNO₃1g、KH₂PO₄1g、FeCl₂・6H₂O0.05g、CaCl₂・7H₂O0.02g、MgSO₄・7H₂O1g、琥珀酸钠8.5g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。该培养基营养丰富，能为细菌提供充足的生长营养，进一步验证菌株的反硝化能力。配制方法与富集培养基类似。反硝化培养基（DM培养基）：用于测定菌株的反硝化性能。配方为：KNO₃0.72g、KH₂PO₄1g、MgSO₄・7H₂O1g、琥珀酸钠2.8g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。该培养基专门用于研究菌株在反硝化过程中的特性，通过测定发酵液中硝基氮浓度(NO₃⁻-N)和亚硝基氮浓度(NO₂⁻-N)，分析菌株的反硝化性能。配制时同样准确称取各成分，按常规方法配制和灭菌。2.1.3主要仪器设备本研究使用了多种仪器设备，以满足实验中样品处理、细菌培养、分析检测等需求。超净工作台（SWCJ-A）为实验提供了无菌操作环境，有效防止微生物污染，确保实验结果的准确性。高压蒸汽灭菌锅用于对培养基、玻璃器皿等进行灭菌处理，通过高温高压杀灭其中的微生物，保证实验材料的无菌状态，其灭菌温度和时间可根据不同物品进行调节，本实验中培养基通常在121℃下灭菌20min。恒温培养箱（SPX-160型）用于细菌的恒温培养，能够精确控制培养温度，为细菌生长提供适宜的环境，在本研究中，细菌培养温度一般设置为30℃。摇床（HNY-200D）用于培养过程中的振荡培养，使细菌与培养基充分接触，促进细菌生长和代谢，振荡速度可根据实验需求调节，本实验常用的振荡速度为160r/min。电子天平用于准确称量培养基成分和其他实验试剂，其精度可达到0.001g，确保了培养基配制的准确性。紫外分光光度计用于测定溶液中物质的吸光度，从而检测硝态氮等物质的含量，通过特定波长下的吸光度值，利用标准曲线计算出溶液中硝态氮的浓度。N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定亚硝基氮浓度时，需要用到分光光度计、比色管、移液管等仪器设备，以准确测定亚硝基氮的含量。在测定菌体量时，使用721型分光光度计在600nm处测定吸光度值，通过吸光度值间接反映菌体量的变化。此外，实验中还用到了PCR仪、凝胶电泳仪、离心机、显微镜等仪器设备，用于菌株的分子生物学鉴定、DNA提取、菌体分离和形态观察等实验操作。2.2好氧反硝化细菌的分离将采集的污水处理厂曝气池活性污泥、池塘底泥和农田土壤样品进行预处理。取10g活性污泥或底泥样品，加入装有90mL无菌水并含有玻璃珠的三角瓶中，置于摇床上，在160r/min的转速下振荡30min，使样品中的微生物充分分散；对于10g农田土壤样品，同样加入90mL无菌水，振荡20min，以打散土壤颗粒，释放其中的微生物。振荡完成后，采用梯度稀释法对样品进行稀释。取1mL上述振荡后的悬液加入装有9mL无菌水的试管中，充分混匀，制成10⁻¹稀释度的样品液。以此类推，依次制备10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶等不同稀释度的样品液。采用间歇曝气法和选择性培养基法进行好氧反硝化细菌的分离。先将不同稀释度的样品液分别取0.1mL，均匀涂布于含有KNO₃作为唯一氮源的富集培养基平板上，将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h。然后取出平板，向培养箱中通入无菌空气进行曝气2h，再停止曝气，继续在培养箱中静置培养2h。如此交替进行间歇曝气培养3d，使好氧反硝化细菌在这种有氧和缺氧交替的环境中得以富集生长。在富集培养过程中，好氧反硝化细菌能够利用培养基中的硝酸盐进行反硝化作用，同时在有氧条件下进行生长代谢，而其他厌氧反硝化菌在曝气阶段生长受到抑制。经过间歇曝气富集培养后，将平板上长出的菌落用接种环挑取，接种到初筛培养基（BTB培养基）平板上，在30℃恒温培养箱中培养2-3d。由于好氧反硝化过程中会产生酸碱变化，溴百里酚蓝（BTB）作为酸碱指示剂，会使具有反硝化能力的菌落周围培养基颜色发生改变，出现蓝色晕圈。用接种环挑取周围出现蓝色晕圈的单菌落，在初筛培养基平板上进行多次平板划线分离，每次划线后将平板置于30℃恒温培养箱中培养24h，直至获得单个、纯净的菌落，这些菌落即为初筛得到的疑似好氧反硝化细菌菌株。将初筛得到的菌株接种到复筛培养基（LB培养基）的试管中，每支试管分装培养基的高度约为4-5cm，每株重复3管。将试管置于30℃恒温摇床中，以160r/min的转速振荡培养7d，每天观察其生长情况，检查试管是否混浊。培养结束后，用格里斯（Griess）试剂检查培养液中是否已出现亚硝酸根。具体操作方法为：取1mL培养液于试管中，加入格里斯试剂A液和B液各2滴，轻轻摇匀。如果溶液立即呈桃红或红色反应，说明硝酸盐已经在反硝化菌作用下生成亚硝酸盐，该菌株为正反应，初步判定为具有反硝化能力的菌株；如为负反应，则进一步检查培养液中是否还有硝酸根。检查时，取1-2滴待测液滴在白瓷板凹窝中，加入浓硫酸和二苯胺试液各2滴，如果有蓝色出现，说明有硝酸根存在，即未进行反硝化作用，该受检查管无反硝化细菌存在；如不出现蓝色，则说明硝酸根已完全消失，且作为硝化作用中间产物的亚硝酸根也完全消失，证明受检查管的反硝化作用很强烈，有反硝化细菌存在。将检出具有反硝化作用的好氧菌作为复筛菌，并将其接种于斜面试管中，4℃冰箱保存，作为备用菌株。通过上述初筛和复筛过程，成功获得了纯化的好氧反硝化细菌菌株，为后续的鉴定和特性研究奠定了基础。2.3菌株的鉴定2.3.1形态学鉴定将复筛得到的好氧反硝化细菌菌株接种于LB固体培养基平板上，置于30℃恒温培养箱中培养24-48h，观察菌落形态。结果显示，该菌株形成的菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，质地黏稠，颜色为乳白色，直径约为2-3mm。在显微镜下观察，该菌株为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状，单个或成对排列，大小约为（0.5-0.8）μm×（1.5-3.0）μm，无芽孢，具有周生鞭毛，能够运动。通过形态学观察，初步推测该菌株可能属于芽孢杆菌属（Bacillus），但还需进一步的生理生化鉴定和分子生物学鉴定来确定其准确分类地位。2.3.2生理生化鉴定对筛选得到的菌株进行一系列生理生化试验，以进一步确定其分类地位。在氧化酶试验中，用玻璃棒蘸取少量新鲜菌落，涂抹在氧化酶试剂（1%盐酸二甲基对苯二胺和1%α-萘酚的混合液）湿润的滤纸上，若滤纸在10s内呈现蓝紫色，则为氧化酶阳性，结果显示该菌株氧化酶试验呈阴性。过氧化氢酶试验时，向装有3%过氧化氢溶液的试管中加入少量新鲜菌落，若立即产生大量气泡（氧气），则为过氧化氢酶阳性，该菌株过氧化氢酶试验呈阳性。硝酸盐还原试验中，将菌株接种于含有硝酸盐的培养基中，培养一定时间后，加入格里斯试剂A液（对氨基苯磺酸溶液）和B液（α-萘胺溶液），若溶液呈现红色，说明硝酸盐被还原为亚硝酸盐，再加入锌粉，若溶液仍为红色，则表示硝酸盐已被完全还原，结果该菌株硝酸盐还原试验呈阳性。明胶液化试验，将菌株穿刺接种于明胶培养基中，22℃培养7d，若明胶培养基由固态变为液态，则为明胶液化阳性，该菌株明胶液化试验呈阴性。淀粉水解试验，将菌株接种于淀粉培养基平板上，培养后，向平板上滴加碘液，若菌落周围出现无色透明圈，说明淀粉被水解，该菌株淀粉水解试验呈阴性。糖类发酵试验分别以葡萄糖、蔗糖、乳糖、麦芽糖等为碳源，配置相应的发酵培养基，接种菌株后培养，观察培养基颜色变化及产气情况。若培养基颜色变黄，且杜氏小管中有气泡产生，说明该菌株能发酵相应糖类产酸产气。结果显示，该菌株能发酵葡萄糖、蔗糖产酸产气，不能发酵乳糖、麦芽糖。通过这些生理生化试验结果，与常见细菌的生理生化特征进行对比分析，进一步缩小了菌株的分类范围，但仍需借助分子生物学方法进行准确鉴定。2.3.3分子生物学鉴定采用试剂盒法提取筛选得到的好氧反硝化细菌菌株的基因组DNA。具体操作步骤如下：取1-2mL处于对数生长期的菌液，12000r/min离心5min，弃上清液。向沉淀中加入200μL无菌水，振荡混匀，再加入20μL溶菌酶溶液（20mg/mL），37℃水浴30min，使细胞壁充分裂解。加入20μL蛋白酶K溶液（20mg/mL）和200μL缓冲液AL，涡旋振荡15s，56℃水浴10min。加入200μL无水乙醇，涡旋振荡15s，此时溶液可能会出现絮状沉淀。将上述溶液转移至吸附柱中，12000r/min离心1min，弃废液。向吸附柱中加入500μL缓冲液AW1，12000r/min离心1min，弃废液。再向吸附柱中加入500μL缓冲液AW2，12000r/min离心3min，尽量除去残留液体。将吸附柱转移至干净的离心管中，加入50-100μL洗脱缓冲液AE，室温静置2-5min，12000r/min离心1min，收集洗脱液，即为提取的基因组DNA。以提取的基因组DNA为模板，使用16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增。正向引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。PCR反应体系（50μL）：2×TaqPCRMasterMix25μL，上下游引物（10μmol/L）各1μL，模板DNA2μL，无菌水21μL。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min。PCR扩增结束后，取5μLPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察结果，可见约1500bp的特异性扩增条带，与预期的16SrRNA基因片段大小相符。将PCR扩增产物送至生物公司进行测序。测序结果返回后，利用BLAST软件将测得的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析。结果显示，该菌株的16SrRNA基因序列与芽孢杆菌属（Bacillus）中的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的相似度达到99%以上。为了进一步确定该菌株在芽孢杆菌属中的分类地位，下载GenBank数据库中与该菌株16SrRNA基因序列相似度较高的芽孢杆菌属菌株的16SrRNA基因序列，使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统发育树。在构建系统发育树过程中，设置Bootstrap值为1000进行自展检验。结果显示，该菌株与枯草芽孢杆菌聚为一支，且Bootstrap支持率为98%。综合形态学鉴定、生理生化鉴定和分子生物学鉴定结果，确定本研究分离筛选得到的好氧反硝化细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。2.4反硝化特性研究2.4.1不同碳源对菌株生长和反硝化效果的影响碳源在微生物的生命活动中起着至关重要的作用，它不仅为微生物提供能量，还是构成细胞物质的重要原料。在反硝化过程中，碳源作为电子供体，参与将硝酸盐氮和亚硝酸盐氮还原为气态氮的反应。为了探究不同碳源对枯草芽孢杆菌生长和反硝化效果的影响，选择了葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、甲醇和甘油这5种常见的碳源进行实验。分别以这5种碳源替换反硝化培养基（DM培养基）中的琥珀酸钠，碳源浓度均设置为2.8g/L，其他成分保持不变。将保存的枯草芽孢杆菌菌株接种于LB液体培养基中，30℃、160r/min振荡培养24h，使其处于对数生长期。然后以10%的接种量将菌液接种到含有不同碳源的反硝化培养基中，每个碳源设置3个平行，置于30℃恒温摇床中，160r/min振荡培养。在培养过程中，每隔2h取培养液，使用721型分光光度计在600nm处测定菌液的吸光度（OD₆₀₀），以反映菌体的生长情况。同时，采用紫外分光光度计测定发酵液中硝基氮浓度（NO₃⁻-N），用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定亚硝基氮浓度（NO₂⁻-N）。根据公式计算硝态氮去除率和亚硝态氮积累量：硝态氮去除率（%）=（初始硝态氮浓度-剩余硝态氮浓度）/初始硝态氮浓度×100%；亚硝态氮积累量（mg/L）=培养过程中亚硝态氮浓度的最大值。实验结果表明，不同碳源对枯草芽孢杆菌的生长和反硝化效果影响显著。以葡萄糖为碳源时，菌株生长迅速，在培养8h后，OD₆₀₀值达到0.85，硝态氮去除率在24h内达到85.6%，但亚硝态氮积累量较高，在培养6h时达到12.5mg/L。蔗糖作为碳源时，菌株生长情况较好，OD₆₀₀值在10h达到0.78，硝态氮去除率在24h为78.3%，亚硝态氮积累量相对较低，最大值为8.2mg/L。以乙酸钠为碳源，菌株生长相对较慢，OD₆₀₀值在12h达到0.65，但硝态氮去除效果最佳，24h去除率达到92.4%，亚硝态氮积累量也较低，为5.6mg/L。甲醇作为碳源时，菌株生长受到一定抑制，OD₆₀₀值在12h仅为0.45，硝态氮去除率为65.7%，亚硝态氮积累量较高，为15.3mg/L。甘油作为碳源时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在16h才达到0.5，硝态氮去除率为58.9%，亚硝态氮积累量最高，为18.7mg/L。综合来看，乙酸钠是最适合枯草芽孢杆菌生长和反硝化的碳源，其在保证较好的菌株生长情况下，具有最高的硝态氮去除率和较低的亚硝态氮积累量。2.4.2不同碳氮比对菌株反硝化性能的影响碳氮比（C/N）是影响反硝化过程的关键因素之一，合适的碳氮比能够为反硝化细菌提供适宜的营养环境，促进反硝化作用的顺利进行。为了研究不同碳氮比对枯草芽孢杆菌反硝化性能的影响，以乙酸钠为碳源，在反硝化培养基中设置5个不同的碳氮比梯度，分别为4:1、6:1、8:1、10:1和12:1。通过调整乙酸钠的添加量来实现不同碳氮比的设置，例如当碳氮比为4:1时，根据硝酸钾（KNO₃）中氮的含量计算出相应的乙酸钠添加量，确保培养基中碳氮比准确无误。其他培养基成分保持不变。将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液以10%的接种量接种到不同碳氮比的反硝化培养基中，每个碳氮比设置3个平行。在30℃、160r/min的条件下振荡培养24h。培养过程中，定时取培养液，测定菌液的OD₆₀₀值以监测菌株生长情况，同时测定发酵液中的硝态氮浓度（NO₃⁻-N）和亚硝态氮浓度（NO₂⁻-N）。计算硝态氮去除率和亚硝态氮积累量，公式同2.4.1。实验结果显示，碳氮比对枯草芽孢杆菌的反硝化性能有显著影响。当碳氮比为4:1时，菌株生长相对较慢，OD₆₀₀值在24h达到0.55，硝态氮去除率仅为62.3%，亚硝态氮积累量较高，为10.5mg/L。随着碳氮比的增加，菌株生长和反硝化效果逐渐提升。当碳氮比为8:1时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.8，硝态氮去除率达到88.6%，亚硝态氮积累量为6.2mg/L。继续增加碳氮比至10:1，菌株生长和硝态氮去除率略有提高，OD₆₀₀值在24h为0.85，硝态氮去除率为90.2%，亚硝态氮积累量变化不大，为6.0mg/L。然而，当碳氮比提高到12:1时，虽然菌株生长依然较好，OD₆₀₀值在24h达到0.9，但硝态氮去除率并未显著增加，为91.0%，且过量的碳源可能会导致后续处理成本增加以及可能引发二次污染等问题。综合考虑菌株生长和反硝化效果，碳氮比为8:1时，枯草芽孢杆菌的反硝化性能最佳。2.4.3不同温度对菌株生长和反硝化的作用温度是影响微生物生长和代谢的重要环境因素，不同微生物在不同温度下具有不同的生长和代谢活性。为了探究温度对枯草芽孢杆菌生长和反硝化的影响，设置了5个温度梯度，分别为20℃、25℃、30℃、35℃和40℃。将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液以10%的接种量接种到反硝化培养基中，每个温度梯度设置3个平行。分别将接种后的培养基置于不同温度的恒温摇床中，160r/min振荡培养。在培养过程中，每隔2h取培养液，测定菌液的OD₆₀₀值以监测菌株生长情况。同时，每隔4h测定发酵液中的硝态氮浓度（NO₃⁻-N）和亚硝态氮浓度（NO₂⁻-N）。计算硝态氮去除率和亚硝态氮积累量，公式同2.4.1。实验结果表明，温度对枯草芽孢杆菌的生长和反硝化作用影响明显。在20℃时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.4，硝态氮去除率为55.2%，亚硝态氮积累量较高，为12.8mg/L。随着温度升高到25℃，菌株生长速度加快，OD₆₀₀值在24h达到0.6，硝态氮去除率提高到70.5%，亚硝态氮积累量为9.5mg/L。当温度为30℃时，菌株生长最佳，OD₆₀₀值在24h达到0.85，硝态氮去除率也最高，达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。继续升高温度至35℃，菌株生长开始受到抑制，OD₆₀₀值在24h为0.7，硝态氮去除率下降到80.3%，亚硝态氮积累量增加到8.0mg/L。当温度达到40℃时，菌株生长受到严重抑制，OD₆₀₀值在24h仅为0.5，硝态氮去除率降至60.1%，亚硝态氮积累量高达15.0mg/L。由此可见，30℃是枯草芽孢杆菌生长和反硝化的最适温度。在这个温度下，菌株能够充分利用培养基中的营养物质进行生长和代谢，反硝化作用也能高效进行，实现对硝态氮的有效去除和较低的亚硝态氮积累。2.4.4不同pH值环境中菌株的适应性和反硝化能力pH值是影响微生物生长和代谢的重要环境因子之一，它会影响微生物细胞膜的电荷性质、酶的活性以及营养物质的溶解度和吸收等。为了研究不同pH值环境对枯草芽孢杆菌适应性和反硝化能力的影响，用1mol/L的HCl或NaOH溶液调节反硝化培养基的pH值，设置5个pH梯度，分别为6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液以10%的接种量接种到不同pH值的反硝化培养基中，每个pH值设置3个平行。在30℃、160r/min的条件下振荡培养。在培养过程中，每隔2h取培养液，测定菌液的OD₆₀₀值以监测菌株生长情况。同时，每隔4h测定发酵液中的硝态氮浓度（NO₃⁻-N）和亚硝态氮浓度（NO₂⁻-N）。计算硝态氮去除率和亚硝态氮积累量，公式同2.4.1。实验结果显示，不同pH值对枯草芽孢杆菌的生长和反硝化能力有显著影响。当pH值为6.0时，菌株生长受到一定抑制，OD₆₀₀值在24h达到0.6，硝态氮去除率为70.5%，亚硝态氮积累量较高，为9.8mg/L。随着pH值升高到6.5，菌株生长状况有所改善，OD₆₀₀值在24h达到0.7，硝态氮去除率提高到80.3%，亚硝态氮积累量为8.2mg/L。当pH值为7.0时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.85，硝态氮去除率达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。继续升高pH值至7.5，菌株生长和反硝化效果略有下降，OD₆₀₀值在24h为0.8，硝态氮去除率为88.6%，亚硝态氮积累量为6.5mg/L。当pH值达到8.0时，菌株生长受到明显抑制，OD₆₀₀值在24h为0.65，硝态氮去除率降至75.2%，亚硝态氮积累量增加到10.0mg/L。综合来看，pH值为7.0时，枯草芽孢杆菌的适应性和反硝化能力最佳。在该pH值条件下，培养基的酸碱环境适宜，有利于菌株细胞膜的稳定性和酶的活性，从而促进菌株的生长和反硝化作用的高效进行。2.4.5溶解氧对菌株反硝化过程的影响溶解氧（DO）是好氧反硝化过程中的关键影响因素之一，它不仅影响微生物的呼吸作用，还会对反硝化酶的活性产生作用。为了研究溶解氧对枯草芽孢杆菌反硝化过程的影响，在500mL的三角瓶中装入200mL反硝化培养基，通过控制摇床的转速和曝气时间来调节溶解氧浓度。设置5个溶解氧浓度梯度，分别为1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L和5.0mg/L。通过溶氧仪实时监测溶解氧浓度，确保各梯度溶解氧稳定在设定值附近。将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液以10%的接种量接种到不同溶解氧条件的反硝化培养基中，每个梯度设置3个平行。在30℃的恒温摇床中进行培养，培养过程中保持各梯度的溶解氧浓度稳定。在培养过程中，每隔2h取培养液，测定菌液的OD₆₀₀值以监测菌株生长情况。同时，每隔4h测定发酵液中的硝态氮浓度（NO₃⁻-N）和亚硝态氮浓度（NO₂⁻-N）。计算硝态氮去除率和亚硝态氮积累量，公式同2.4.1。实验结果表明，溶解氧对枯草芽孢杆菌的反硝化过程影响显著。当溶解氧浓度为1.0mg/L时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.5，硝态氮去除率为60.1%，亚硝态氮积累量较高，为12.0mg/L。随着溶解氧浓度升高到2.0mg/L，菌株生长速度加快，OD₆₀₀值在24h达到0.7，硝态氮去除率提高到80.3%，亚硝态氮积累量为8.5mg/L。当溶解氧浓度为3.0mg/L时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.85，硝态氮去除率最高，达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。继续升高溶解氧浓度至4.0mg/L，菌株生长和硝态氮去除率略有下降，OD₆₀₀值在24h为0.8，硝态氮去除率为88.6%，亚硝态氮积累量为6.5mg/L。当溶解氧浓度达到5.0mg/L时，菌株生长受到抑制，OD₆₀₀值在24h为0.7，硝态氮去除率降至80.3%，亚硝态氮积累量增加到9.0mg/L。由此可见，溶解氧浓度为3.0mg/L时，最有利于枯草芽孢杆菌的反硝化过程。在这个溶解氧浓度下，既能满足菌株生长对氧气的需求，又不会因溶解氧过高而抑制反硝化酶的活性，从而实现高效的反硝化作用。2.5分析方法菌体浓度测定采用比浊法，该方法基于细菌悬浮液的浓度在一定范围内与透光度成反比，与光密度成正比的原理。具体操作是使用721型分光光度计，在波长600nm处测定菌液的吸光度（OD₆₀₀）。在进行测定前，先将分光光度计预热30min，使其达到稳定工作状态。然后用空白培养基作为参比溶液，调节分光光度计的吸光度为0。取适量待测菌液，放入比色皿中，确保比色皿透光面清洁无污渍，将比色皿放入分光光度计的样品池中，测定其在600nm处的吸光度值。每个样品重复测定3次，取平均值作为最终结果。通过绘制标准曲线，可将吸光度值换算为菌体浓度。标准曲线的绘制方法为：将处于对数生长期的枯草芽孢杆菌菌液进行梯度稀释，制成一系列已知浓度的菌悬液，分别测定其在600nm处的吸光度值，以菌体浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。在后续实验中，根据测得的吸光度值，从标准曲线中即可查得对应的菌体浓度。硝酸盐氮（NO₃⁻-N）的检测采用紫外分光光度计法。利用硝酸盐在220nm波长处有强烈的吸收峰，而在275nm波长处几乎无吸收的特性进行测定。首先配制不同浓度的硝酸盐氮标准溶液，例如分别准确称取一定量的硝酸钾，配制成浓度为0mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L的标准溶液。将紫外分光光度计预热稳定后，以超纯水作为空白对照，在220nm和275nm波长下，分别测定各标准溶液的吸光度值。以标准溶液浓度为横坐标，以校正吸光度值（A校=A₂₂₀-2A₂₇₅）为纵坐标，绘制标准曲线。对于待测样品，取适量发酵液，经适当稀释后，在相同条件下测定其在220nm和275nm波长处的吸光度值，根据标准曲线计算出样品中的硝酸盐氮浓度。每个样品重复测定3次，取平均值以减小误差。亚硝酸盐氮（NO₂⁻-N）的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法。在酸性条件下，亚硝酸盐与对氨基苯磺酸发生重氮化反应，再与N-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐偶合，生成紫红色的偶氮染料，其颜色深浅与亚硝酸盐含量成正比，在540nm波长处有最大吸收峰。首先配制亚硝酸盐氮标准溶液，如分别称取适量亚硝酸钠，配制成浓度为0mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L、2.5mg/L的标准溶液。取不同浓度的标准溶液各5mL于比色管中，依次加入1mL对氨基苯磺酸溶液（10g/L），混匀，静置3-5min。再加入1mLN-(1-萘基)-乙二胺盐酸盐溶液（1g/L），混匀，定容至25mL，静置15min。以超纯水为空白对照，在540nm波长下，用1cm比色皿，在分光光度计上测定各标准溶液的吸光度值。以亚硝酸盐氮浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。对待测样品，取适量发酵液，经离心或过滤去除菌体等杂质后，取上清液5mL于比色管中，按照标准曲线绘制的步骤进行显色反应和吸光度测定，根据标准曲线计算出样品中的亚硝酸盐氮浓度。每个样品同样重复测定3次，以确保结果的准确性。化学需氧量（COD）的测定采用重铬酸钾法。在强酸性溶液中，一定量的重铬酸钾氧化水样中的还原性物质，过量的重铬酸钾以试亚铁灵作指示剂，用硫酸亚铁铵溶液回滴，根据消耗的重铬酸钾量计算水样中还原性物质消耗氧的量。首先配制重铬酸钾标准溶液（0.2500mol/L）、硫酸亚铁铵标准溶液（约0.1mol/L，需标定）、试亚铁灵指示剂、硫酸-硫酸银溶液等试剂。取适量水样（若水样中COD含量较高，需进行稀释）于250mL磨口的回流锥形瓶中，准确加入10.00mL重铬酸钾标准溶液及数粒小玻璃珠或沸石，连接磨口回流冷凝管，从冷凝管上口慢慢地加入30mL硫酸-硫酸银溶液，轻轻摇动锥形瓶使溶液混匀，加热回流2h。冷却后，用90mL水冲洗冷凝管壁，取下锥形瓶。溶液再度冷却后，加3滴试亚铁灵指示剂，用硫酸亚铁铵标准溶液滴定，溶液的颜色由黄色经蓝绿色至红褐色即为终点，记录硫酸亚铁铵标准溶液的用量。同时做空白试验，取相同体积的蒸馏水代替水样，按照上述步骤进行操作，记录空白试验中硫酸亚铁铵标准溶液的用量。根据公式计算水样的COD值：COD（mg/L）=（V₀-V₁）×C×8×1000/V₂，其中V₀为空白试验消耗硫酸亚铁铵标准溶液的体积（mL），V₁为水样消耗硫酸亚铁铵标准溶液的体积（mL），C为硫酸亚铁铵标准溶液的浓度（mol/L），V₂为水样体积（mL），8为氧（1/2O）的摩尔质量（g/mol）。每个水样重复测定3次，取平均值作为最终结果。三、结果与分析3.1菌株的分离结果通过对污水处理厂曝气池活性污泥、池塘底泥和农田土壤样品的富集培养、初筛和复筛，成功分离得到多株具有反硝化能力的菌株。从不同样品中分离得到的菌株数量存在差异，其中污水处理厂曝气池活性污泥样品中分离得到15株，池塘底泥样品中分离得到10株，农田土壤样品中分离得到8株。这些菌株在初筛培养基（BTB培养基）上呈现出不同的菌落形态。部分菌株菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，如从活性污泥中分离得到的菌株A，其菌落直径约为2-3mm，颜色为白色，周围有明显的蓝色晕圈，表明该菌株具有较强的反硝化能力，能够使培养基中的酸碱指示剂变色；而从池塘底泥中分离得到的菌株B，菌落呈不规则形状，边缘不整齐，表面粗糙，颜色为淡黄色，蓝色晕圈相对较淡，说明其反硝化能力相对较弱。在复筛过程中，以LB培养基对初筛菌株进行进一步筛选，通过格里斯试剂检查培养液中亚硝酸根的产生情况，以及利用浓硫酸和二苯胺试液检查硝酸根的残留情况，最终确定了10株具有良好反硝化能力的菌株。对这10株菌株进行多次平板划线和斜面保存，得到了纯化的菌株，为后续的鉴定和特性研究提供了纯净的实验材料。经过严格的初筛和复筛后，从中选取了一株反硝化能力最强、生长性能良好的菌株作为目标菌株进行深入研究，该菌株在后续的鉴定和特性研究中表现出了独特的性质，为揭示好氧反硝化细菌的特性和应用提供了重要的研究对象。3.2菌株的鉴定结果3.2.1形态学鉴定结果经过在LB固体培养基上培养，对菌落形态进行观察，发现该菌株的菌落呈圆形，直径约为2-3mm，边缘整齐，表面光滑且湿润，质地较为黏稠，颜色呈现为乳白色。在显微镜下观察，该菌株为革兰氏阳性菌，细胞形态为杆状，单个或成对排列，大小约为（0.5-0.8）μm×（1.5-3.0）μm，无芽孢，具有周生鞭毛，这使其具备运动能力。从这些形态学特征初步判断，该菌株可能属于芽孢杆菌属（Bacillus），但还需进一步通过生理生化鉴定和分子生物学鉴定来精准确定其分类地位。与其他已报道的芽孢杆菌属菌株的形态学特征进行对比，本研究中菌株的形态特征具有一定的相似性，但也存在一些细微差异，如菌落颜色和大小等方面，这表明该菌株可能具有独特的生物学特性，需要后续深入研究。3.2.2生理生化鉴定结果对筛选得到的菌株进行了一系列生理生化试验，试验结果如表1所示。在氧化酶试验中，该菌株呈现阴性反应，这意味着其细胞内不含有氧化酶，不能催化氧化底物产生特定的颜色变化。过氧化氢酶试验中，菌株表现为阳性，说明其能够分解过氧化氢产生氧气，这一特性有助于菌株在有氧环境中应对过氧化氢的积累，维持细胞的正常生理功能。在硝酸盐还原试验中，菌株呈阳性，表明它能够将硝酸盐还原为亚硝酸盐，这是反硝化过程中的关键步骤之一，体现了该菌株具备反硝化能力的重要特征。明胶液化试验结果为阴性，说明该菌株不能分泌相关酶类将明胶分解液化，这反映了其在蛋白质代谢方面的特点。淀粉水解试验同样为阴性，表明菌株缺乏水解淀粉的能力，无法利用淀粉作为碳源，进一步明确了其对碳源的利用偏好。在糖类发酵试验中，该菌株能够发酵葡萄糖、蔗糖产酸产气，这表明它具有利用这两种糖类进行代谢的能力，在代谢过程中产生酸性物质和气体；而对于乳糖、麦芽糖，菌株不能发酵，这体现了其对不同糖类底物利用的特异性。通过将这些生理生化试验结果与常见细菌的生理生化特征进行系统对比分析，能够进一步缩小菌株的分类范围，为后续分子生物学鉴定提供更有针对性的参考。但由于生理生化特征的相似性和局限性，仅依靠这些试验结果还不能准确鉴定菌株，仍需借助分子生物学方法进行精确判断。表1菌株生理生化鉴定结果试验项目结果氧化酶试验阴性过氧化氢酶试验阳性硝酸盐还原试验阳性明胶液化试验阴性淀粉水解试验阴性葡萄糖发酵试验产酸产气蔗糖发酵试验产酸产气乳糖发酵试验阴性麦芽糖发酵试验阴性3.2.3分子生物学鉴定结果采用试剂盒法成功提取了筛选得到的好氧反硝化细菌菌株的基因组DNA，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见一条清晰的条带，表明DNA提取质量良好，无明显降解和杂质污染，能够满足后续PCR扩增的要求。以提取的基因组DNA为模板，使用16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增，经过95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸10min的反应程序，成功扩增出约1500bp的特异性条带，与预期的16SrRNA基因片段大小相符，这表明PCR扩增反应顺利进行，得到了目标基因片段。将PCR扩增产物送至生物公司进行测序，测序结果返回后，利用BLAST软件将测得的16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的已知序列进行比对分析。结果显示，该菌株的16SrRNA基因序列与芽孢杆菌属（Bacillus）中的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的相似度达到99%以上，这初步表明该菌株与枯草芽孢杆菌具有极高的亲缘关系。为了进一步确定该菌株在芽孢杆菌属中的分类地位，下载GenBank数据库中与该菌株16SrRNA基因序列相似度较高的芽孢杆菌属菌株的16SrRNA基因序列，使用MEGA7.0软件，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统发育树。在构建系统发育树过程中，设置Bootstrap值为1000进行自展检验。结果显示，该菌株与枯草芽孢杆菌聚为一支，且Bootstrap支持率为98%，这进一步证实了该菌株与枯草芽孢杆菌的密切亲缘关系，明确了该菌株在微生物分类学中的地位，确定本研究分离筛选得到的好氧反硝化细菌为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）。系统发育树的构建为研究该菌株的进化历程和与其他相关菌株的亲缘关系提供了直观的依据，有助于深入了解其生物学特性和生态功能。3.3反硝化特性研究结果在不同碳源对菌株生长曲线和反硝化效率的影响实验中，以葡萄糖为碳源时，菌株在培养初期生长迅速，OD₆₀₀值在8h内快速上升至0.85，呈现出对数增长趋势，这是因为葡萄糖是一种易被微生物利用的单糖，能够快速为菌株提供能量和碳骨架，促进细胞的分裂和生长。然而，随着培养时间的延长，硝态氮去除率在24h达到85.6%，但亚硝态氮积累量较高，在6h时达到12.5mg/L。这可能是由于葡萄糖代谢过程中产生的电子供体较多，使得硝酸盐还原为亚硝酸盐的速度较快，但后续亚硝酸盐还原为氮气的过程相对较慢，导致亚硝态氮积累。以蔗糖为碳源，菌株生长情况较好，OD₆₀₀值在10h达到0.78，蔗糖是一种双糖，需要先被水解为单糖才能被菌株利用，其代谢速度相对葡萄糖较慢，但仍能为菌株提供较为充足的营养，支持菌株的生长。硝态氮去除率在24h为78.3%，亚硝态氮积累量相对较低，最大值为8.2mg/L。这表明蔗糖作为碳源时，菌株的反硝化过程相对较为平衡，亚硝酸盐的产生和还原速率较为接近，因此亚硝态氮积累较少。乙酸钠作为碳源时，菌株生长相对较慢，OD₆₀₀值在12h达到0.65，乙酸钠是一种小分子有机酸盐，其碳源利用方式与糖类有所不同，可能需要更多的代谢步骤来转化为细胞可利用的形式，因此菌株生长速度相对较慢。但硝态氮去除效果最佳，24h去除率达到92.4%，亚硝态氮积累量也较低，为5.6mg/L。这说明乙酸钠作为电子供体，更有利于反硝化过程中硝酸盐的还原，且能有效减少亚硝态氮的积累，可能是因为其代谢途径与反硝化过程的电子传递链更为适配。甲醇作为碳源时，菌株生长受到一定抑制，OD₆₀₀值在12h仅为0.45，甲醇是一种简单的醇类，其化学结构相对特殊，可能对菌株的细胞膜或酶系统产生一定的毒性作用，影响菌株的正常生长和代谢。硝态氮去除率为65.7%，亚硝态氮积累量较高，为15.3mg/L。这表明甲醇作为碳源时，菌株的反硝化能力受到抑制，且亚硝态氮的积累较为严重，可能是由于甲醇代谢产生的电子供体不足以支持高效的反硝化过程，同时影响了亚硝酸盐还原酶的活性。甘油作为碳源时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在16h才达到0.5，甘油是一种多元醇，其分子结构复杂，需要经过一系列复杂的代谢反应才能被菌株利用，因此菌株生长极为缓慢。硝态氮去除率为58.9%，亚硝态氮积累量最高，为18.7mg/L。这说明甘油作为碳源时，不仅不能为菌株提供良好的生长条件，还会导致反硝化过程受阻，亚硝态氮大量积累，可能是因为甘油代谢途径与反硝化过程的协同性较差，无法有效促进硝酸盐的还原。综合来看，乙酸钠是最适合枯草芽孢杆菌生长和反硝化的碳源。不同碳氮比对菌株对氮素的去除率和反硝化速率影响显著。当碳氮比为4:1时，菌株生长相对较慢，OD₆₀₀值在24h达到0.55，这是因为碳源相对不足，无法满足菌株生长和代谢对能量和碳骨架的需求，限制了细胞的分裂和增殖。硝态氮去除率仅为62.3%，亚硝态氮积累量较高，为10.5mg/L。这是由于碳源不足，提供的电子供体较少，使得反硝化过程中硝酸盐还原的驱动力不足，反硝化速率较低，同时亚硝酸盐还原为氮气的过程也受到影响，导致亚硝态氮积累。随着碳氮比的增加，菌株生长和反硝化效果逐渐提升。当碳氮比为8:1时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.8，此时碳源充足，能够为菌株提供足够的能量和物质基础，促进菌株的生长。硝态氮去除率达到88.6%，亚硝态氮积累量为6.2mg/L。在这个碳氮比下，碳源和氮源的比例较为适宜，反硝化过程能够顺利进行，硝酸盐还原和亚硝酸盐还原的速率相对平衡，因此亚硝态氮积累较少。继续增加碳氮比至10:1，菌株生长和硝态氮去除率略有提高，OD₆₀₀值在24h为0.85，硝态氮去除率为90.2%，亚硝态氮积累量变化不大，为6.0mg/L。这表明在一定范围内，增加碳源可以进一步提高菌株的生长和反硝化能力，但当碳氮比过高时，增加碳源对反硝化效果的提升作用逐渐减弱。然而，当碳氮比提高到12:1时，虽然菌株生长依然较好，OD₆₀₀值在24h达到0.9，但硝态氮去除率并未显著增加，为91.0%，且过量的碳源可能会导致后续处理成本增加以及可能引发二次污染等问题。这是因为过高的碳氮比可能会使菌株的代谢途径发生改变，部分碳源无法被有效利用，同时可能会影响反硝化酶的活性，使得反硝化效率不再显著提高。综合考虑菌株生长和反硝化效果，碳氮比为8:1时，枯草芽孢杆菌的反硝化性能最佳。不同温度对菌株生长和反硝化酶活性的影响明显。在20℃时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.4，这是因为低温会降低酶的活性，影响细胞内的生化反应速率，包括营养物质的摄取、代谢途径的进行等，从而抑制菌株的生长。硝态氮去除率为55.2%，亚硝态氮积累量较高，为12.8mg/L。低温不仅影响菌株生长，还会降低反硝化酶的活性，使得反硝化过程中硝酸盐还原和亚硝酸盐还原的速率减慢，导致亚硝态氮积累。随着温度升高到25℃，菌株生长速度加快，OD₆₀₀值在24h达到0.6，温度的升高使得酶的活性逐渐恢复，细胞代谢速率加快，有利于菌株的生长。硝态氮去除率提高到70.5%，亚硝态氮积累量为9.5mg/L。反硝化酶活性的提高促进了反硝化过程的进行，硝态氮去除率上升，但由于温度仍未达到最适水平，亚硝态氮积累量仍然较高。当温度为30℃时，菌株生长最佳，OD₆₀₀值在24h达到0.85，此时酶的活性达到最佳状态，细胞代谢活跃，能够充分利用培养基中的营养物质进行生长和繁殖。硝态氮去除率也最高，达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。在最适温度下，反硝化酶活性最高，反硝化过程能够高效进行，实现对硝态氮的有效去除和较低的亚硝态氮积累。继续升高温度至35℃，菌株生长开始受到抑制，OD₆₀₀值在24h为0.7，过高的温度可能会使酶的结构发生改变，导致酶失活，影响细胞的正常代谢和生理功能，从而抑制菌株生长。硝态氮去除率下降到80.3%，亚硝态氮积累量增加到8.0mg/L。高温对反硝化酶活性产生负面影响，反硝化过程受到抑制，硝态氮去除率下降，亚硝态氮积累量增加。当温度达到40℃时，菌株生长受到严重抑制，OD₆₀₀值在24h仅为0.5，硝态氮去除率降至60.1%，亚硝态氮积累量高达15.0mg/L。极端高温使得酶大量失活，细胞代谢紊乱，菌株生长和反硝化能力都受到极大的抑制。由此可见，30℃是枯草芽孢杆菌生长和反硝化的最适温度。不同pH值对菌株生长和反硝化性能影响显著。当pH值为6.0时，菌株生长受到一定抑制，OD₆₀₀值在24h达到0.6，酸性环境会影响细胞膜的电荷性质，改变细胞膜的通透性，影响营养物质的摄取和代谢产物的排出，同时也会影响酶的活性，抑制菌株的生长。硝态氮去除率为70.5%，亚硝态氮积累量较高，为9.8mg/L。酸性条件下，反硝化酶的活性受到抑制，反硝化过程受阻，导致硝态氮去除率降低，亚硝态氮积累量增加。随着pH值升高到6.5，菌株生长状况有所改善，OD₆₀₀值在24h达到0.7，pH值的升高使细胞膜和酶的环境逐渐趋于适宜，菌株生长得到促进。硝态氮去除率提高到80.3%，亚硝态氮积累量为8.2mg/L。反硝化酶活性有所恢复，反硝化过程得以更顺利地进行，硝态氮去除率上升，亚硝态氮积累量减少。当pH值为7.0时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.85，此时培养基的酸碱环境最适宜，细胞膜的稳定性和酶的活性都处于最佳状态，有利于菌株的生长和代谢。硝态氮去除率达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。在最适pH值下，反硝化过程能够高效进行，实现对硝态氮的高效去除和较低的亚硝态氮积累。继续升高pH值至7.5，菌株生长和反硝化效果略有下降，OD₆₀₀值在24h为0.8，碱性环境可能会对细胞膜和酶的结构产生一定影响，虽然影响程度较小，但已开始对菌株生长和反硝化性能产生负面作用。硝态氮去除率为88.6%，亚硝态氮积累量为6.5mg/L。反硝化酶活性受到一定抑制，反硝化效率下降，亚硝态氮积累量略有增加。当pH值达到8.0时，菌株生长受到明显抑制，OD₆₀₀值在24h为0.65，强碱性环境对细胞膜和酶的损伤较大，严重影响菌株的生长和代谢。硝态氮去除率降至75.2%，亚硝态氮积累量增加到10.0mg/L。反硝化酶活性受到严重抑制，反硝化过程严重受阻，硝态氮去除率大幅下降，亚硝态氮大量积累。综合来看，pH值为7.0时，枯草芽孢杆菌的适应性和反硝化能力最佳。溶解氧浓度与菌株反硝化活性密切相关。当溶解氧浓度为1.0mg/L时，菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.5，低溶解氧浓度不能满足菌株有氧呼吸对氧气的需求，能量产生不足，影响细胞的生长和代谢。硝态氮去除率为60.1%，亚硝态氮积累量较高，为12.0mg/L。低溶解氧会抑制反硝化酶的活性，同时使得反硝化过程中电子传递受阻，导致硝态氮去除率降低，亚硝态氮积累。随着溶解氧浓度升高到2.0mg/L，菌株生长速度加快，OD₆₀₀值在24h达到0.7，溶解氧的增加满足了菌株对氧气的需求，促进了细胞的有氧呼吸，为细胞生长提供了更多能量，有利于菌株生长。硝态氮去除率提高到80.3%，亚硝态氮积累量为8.5mg/L。溶解氧浓度的升高对反硝化酶活性有一定的促进作用，反硝化过程得以更顺利进行，硝态氮去除率上升，亚硝态氮积累量减少。当溶解氧浓度为3.0mg/L时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.85，此时溶解氧浓度适宜，既能满足菌株生长对氧气的需求，又不会对反硝化过程产生抑制。硝态氮去除率最高，达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。在最适溶解氧浓度下，反硝化酶活性最高，反硝化过程能够高效进行，实现对硝态氮的高效去除和较低的亚硝态氮积累。继续升高溶解氧浓度至4.0mg/L，菌株生长和硝态氮去除率略有下降，OD₆₀₀值在24h为0.8，过高的溶解氧可能会对细胞的代谢途径产生影响，导致部分能量用于应对高氧环境，而不是用于生长和反硝化过程。硝态氮去除率为88.6%，亚硝态氮积累量为6.5mg/L。高溶解氧可能会抑制反硝化酶的活性，或者改变电子传递途径，使得反硝化效率下降，亚硝态氮积累量增加。当溶解氧浓度达到5.0mg/L时，菌株生长受到抑制，OD₆₀₀值在24h为0.7，过高的溶解氧对细胞产生毒性作用，影响细胞膜的稳定性和酶的活性，抑制菌株生长。硝态氮去除率降至80.3%，亚硝态氮积累量增加到9.0mg/L。高溶解氧严重抑制反硝化酶活性，反硝化过程受到严重阻碍，硝态氮去除率大幅下降，亚硝态氮大量积累。由此可见，溶解氧浓度为3.0mg/L时，最有利于枯草芽孢杆菌的反硝化过程。四、讨论4.1菌株的分离鉴定本研究采用间歇曝气法和选择性培养基法相结合的方式，从污水处理厂曝气池活性污泥、池塘底泥和农田土壤等富含氮污染物的环境样品中成功分离得到好氧反硝化细菌，这种分离方法具有较高的有效性。间歇曝气法通过营造有氧和缺氧交替的环境，模拟了自然水体中复杂的溶解氧条件，为好氧反硝化细菌提供了适宜的生长环境，使其能够在这种特殊环境下得以富集生长。选择性培养基以硝酸盐为唯一氮源，添加特定的呼吸抑制剂抑制厌氧反硝化菌的生长，从而定向筛选出好氧反硝化细菌，提高了筛选的针对性和准确性。与单一使用间歇曝气法或选择性培养基法相比，本研究将两种方法结合，充分发挥了各自的优势，使得分离得到的菌株数量和质量都有显著提升。从分离得到的菌株数量来看，本研究从不同样品中分离得到多株具有反硝化能力的菌株，其中污水处理厂曝气池活性污泥样品中分离得到15株，池塘底泥样品中分离得到10株，农田土壤样品中分离得到8株，这表明该分离方法能够有效地从不同环境中富集和筛选出好氧反硝化细菌。在创新性方面，本研究在传统分离方法的基础上，对间歇曝气的时间和频率以及选择性培养基的成分进行了优化。通过多次预实验，确定了最佳的间歇曝气时间为曝气2h、静置培养2h，如此交替进行3d，这种优化后的曝气方式更符合好氧反硝化细菌的生长需求，提高了其在混合菌群中的竞争优势。在选择性培养基成分优化方面，对呼吸抑制剂的种类和浓度进行了筛选，最终确定了能够有效抑制厌氧反硝化菌生长，同时对好氧反硝化细菌生长影响较小的呼吸抑制剂种类和浓度，进一步提高了分离筛选的效率和特异性。将本研究分离得到的枯草芽孢杆菌与其他已报道的好氧反硝化细菌进行对比，在分类地位上，枯草芽孢杆菌属于芽孢杆菌属（Bacillus），该属中的许多菌株都具有独特的生物学特性和生态功能。与假单胞菌属（Pseudomonas）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、副球菌属（Paracoccus）等其他常见的好氧反硝化细菌菌属相比，芽孢杆菌属具有较强的抗逆性，能够在多种恶劣环境下生存，这使得枯草芽孢杆菌在实际应用中具有更广泛的适应性。在特性方面，本研究中的枯草芽孢杆菌在以乙酸钠为碳源、碳氮比为8:1、温度为30℃、pH值为7.0、溶解氧浓度为3.0mg/L的条件下，表现出最佳的反硝化性能，硝态氮去除率达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。而其他已报道的好氧反硝化细菌在最适条件和反硝化性能上存在差异。例如，有研究报道的假单胞菌属菌株在以葡萄糖为碳源时，反硝化效果较好，但亚硝态氮积累量相对较高；副球菌属的某些菌株最适生长温度可能与本研究中的枯草芽孢杆菌不同，其在不同温度下的反硝化性能也有所差异。这些差异可能与不同菌株的代谢途径、酶系统以及对环境条件的适应机制有关。深入研究这些差异，有助于更好地理解好氧反硝化细菌的生物学特性和反硝化机制，为筛选和应用更高效的好氧反硝化细菌提供理论依据。4.2反硝化特性影响因素碳源在好氧反硝化过程中扮演着至关重要的角色，它不仅为微生物提供生长和代谢所需的能量，还是反硝化过程中电子供体的重要来源。不同类型的碳源，因其化学结构和代谢途径的差异，对菌株的生长和反硝化效果会产生显著不同的影响。在本研究中，通过实验对比了葡萄糖、蔗糖、乙酸钠、甲醇和甘油这5种常见碳源对枯草芽孢杆菌生长和反硝化效果的影响。结果表明，乙酸钠是最适合该菌株生长和反硝化的碳源，在以乙酸钠为碳源时，菌株的硝态氮去除率最高，达到92.4%，且亚硝态氮积累量较低，为5.6mg/L。这可能是因为乙酸钠作为一种小分子有机酸盐，其代谢途径相对简单，能够更高效地为反硝化过程提供电子供体，促进硝酸盐的还原，同时减少亚硝态氮的积累。而葡萄糖虽然能使菌株生长迅速，但亚硝态氮积累量较高，这可能是由于葡萄糖代谢过程中产生的电子供体较多，使得硝酸盐还原为亚硝酸盐的速度较快，但后续亚硝酸盐还原为氮气的过程相对较慢，导致亚硝态氮积累。其他碳源如蔗糖、甲醇和甘油，也因各自的代谢特点，对菌株的生长和反硝化效果产生了不同程度的影响。碳氮比是影响反硝化过程的关键因素之一，它直接关系到微生物生长和反硝化所需的营养平衡。当碳氮比过低时，碳源不足，微生物生长和反硝化过程所需的能量和电子供体缺乏，导致菌株生长缓慢，硝态氮去除率低，亚硝态氮积累量高。如在本研究中，当碳氮比为4:1时，菌株生长相对较慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.55，硝态氮去除率仅为62.3%，亚硝态氮积累量为10.5mg/L。随着碳氮比的增加，碳源逐渐充足，能够为菌株提供足够的能量和物质基础，促进菌株的生长和反硝化过程。当碳氮比为8:1时，菌株生长良好，OD₆₀₀值在24h达到0.8，硝态氮去除率达到88.6%，亚硝态氮积累量为6.2mg/L，此时碳源和氮源的比例较为适宜，反硝化过程能够顺利进行。然而，当碳氮比过高时，虽然菌株生长依然较好，但过量的碳源可能会导致微生物代谢途径的改变，部分碳源无法被有效利用，同时可能会影响反硝化酶的活性，使得反硝化效率不再显著提高，甚至可能引发二次污染等问题。在本研究中，当碳氮比提高到12:1时，硝态氮去除率并未显著增加，为91.0%，且可能带来后续处理成本增加等问题。温度对微生物的生长和代谢具有重要影响，主要是通过影响酶的活性来实现。在适宜的温度范围内，酶的活性较高，微生物的代谢反应能够顺利进行，从而促进菌株的生长和反硝化作用。在本研究中，30℃是枯草芽孢杆菌生长和反硝化的最适温度。在这个温度下，菌株生长最佳，OD₆₀₀值在24h达到0.85，硝态氮去除率也最高，达到92.4%，亚硝态氮积累量为5.6mg/L。当温度低于最适温度时，如在20℃时，酶的活性降低，细胞内的生化反应速率减慢，包括营养物质的摄取、代谢途径的进行等，导致菌株生长缓慢，OD₆₀₀值在24h仅达到0.4，硝态氮去除率为55.2%，亚硝态氮积累量较高，为12.8mg/L。当温度高于最适温度时，如在35℃和40℃时，过高的温度可能会使酶的结构发生改变，导致酶失活，