妊娠中期因子与CD105在舌鳞状细胞癌中的表达及临床意义探究

妊娠中期因子与CD105在舌鳞状细胞癌中的表达及临床意义探究一、引言1.1研究背景舌鳞状细胞癌（TongueSquamousCellCarcinoma，TSCC）作为头颈部较为常见的恶性肿瘤，近年来其发病率和死亡率呈现出令人担忧的上升趋势，严重威胁着人类的健康。据相关统计数据显示，在全球范围内，舌鳞状细胞癌的发病人数逐年递增，尤其在亚洲地区，其发病率的增长更为显著。在中国，舌鳞状细胞癌在口腔癌中占据着较高的比例，是导致患者死亡的重要原因之一。舌鳞状细胞癌的发病与多种因素密切相关。不良的生活习惯，如长期吸烟、酗酒以及过度嚼槟榔等，都是其重要的诱因。烟草中含有的尼古丁、焦油等大量有害物质，在长期吸烟过程中，会不断刺激口腔黏膜，导致黏膜细胞的DNA受到损伤，进而引发基因突变，增加舌鳞状细胞癌的发病风险。酒精则会干扰细胞的正常代谢和DNA修复机制，进一步加剧对口腔黏膜的损害。而槟榔中含有的槟榔碱等成分，具有细胞毒性，长期咀嚼槟榔会使口腔黏膜反复受损，引发慢性炎症，最终可能导致癌变。慢性炎症和病毒感染也是不可忽视的风险因素。长期存在的口腔慢性炎症，会使局部组织处于持续的炎症状态，炎症细胞释放的各种细胞因子和活性氧物质，会对细胞的基因组稳定性造成破坏，促使细胞发生恶性转化。人乳头瘤病毒（HPV）感染与部分舌鳞状细胞癌的发生紧密相关，尤其是在年轻患者群体中，HPV相关的舌鳞状细胞癌所占比例相对较高。尽管目前针对舌鳞状细胞癌已经有了手术切除、放射治疗、化学治疗以及免疫治疗和靶向治疗等多种相对成熟的治疗手段，但患者的预后情况依然不容乐观。手术切除虽然能够直接去除肿瘤组织，但对于一些晚期患者，由于肿瘤的广泛浸润和转移，手术难以彻底清除癌细胞，且手术创伤较大，会对患者的口腔功能和生活质量造成严重影响。放射治疗和化学治疗在杀伤癌细胞的同时，也会对正常组织细胞产生较大的副作用，导致患者出现一系列不良反应，如恶心、呕吐、脱发、免疫力下降等，严重影响患者的治疗依从性和生活质量。免疫治疗和靶向治疗作为新兴的治疗方法，虽然在部分患者中取得了一定的疗效，但仍存在治疗效果个体差异大、耐药性等问题，且治疗费用高昂，限制了其广泛应用。据统计，舌鳞状细胞癌患者的5年生存率仅约为50%左右，这意味着一半左右的患者在确诊后的5年内会面临死亡的威胁。此外，舌鳞状细胞癌还具有较高的复发率和转移率，即使经过积极治疗，仍有相当一部分患者会出现肿瘤复发和远处转移，进一步降低了患者的生存几率和生活质量。因此，深入探究舌鳞状细胞癌的发病机制，寻找更为有效的诊治策略，对于提高患者的生存率和生活质量具有至关重要的临床意义。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探讨妊娠中期因子（Midkine，MK）和CD105在舌鳞状细胞癌中的表达情况，分析其与舌鳞状细胞癌临床病理特征之间的关联，以及两者之间的相互作用关系，从而为舌鳞状细胞癌的早期诊断、预后评估和治疗提供新的理论依据和潜在的生物标志物及治疗靶点。目前，对于舌鳞状细胞癌的早期诊断，临床上主要依赖于组织活检和影像学检查，但这些方法存在一定的局限性。组织活检属于侵入性检查，可能给患者带来痛苦和并发症，且对于一些早期微小病变，活检结果可能存在假阴性。影像学检查如CT、MRI等虽然能够发现较大的肿瘤病灶，但对于早期的、形态学改变不明显的病变，敏感度较低。在预后评估方面，现有的评估指标如肿瘤的大小、分期、分级等，虽然能够在一定程度上预测患者的预后，但准确性仍有待提高。许多患者在治疗后仍会出现复发和转移，严重影响患者的生存质量和生存率。而妊娠中期因子作为一种具有促血管生成和细胞增殖作用的生长因子，其在肿瘤发生发展过程中的作用逐渐受到关注。在多种肿瘤中，妊娠中期因子的高表达与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关。研究发现，在乳腺癌中，妊娠中期因子能够通过激活PI3K/Akt信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活；在肝癌中，妊娠中期因子可上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而促进肿瘤血管生成，为肿瘤的生长和转移提供营养支持。CD105作为一种血管内皮细胞的特异性膜受体，在肿瘤血管生成中发挥着关键作用。肿瘤的生长和转移离不开新生血管的形成，CD105能够调节血管内皮细胞的增殖、迁移和分化，促进肿瘤血管的生成。在结直肠癌中，CD105的表达水平与肿瘤的微血管密度呈正相关，高表达CD105的肿瘤患者往往预后较差。通过研究妊娠中期因子和CD105在舌鳞状细胞癌中的表达情况，有望发现新的早期诊断标志物，提高舌鳞状细胞癌的早期诊断率。对于那些临床症状不明显，但妊娠中期因子和CD105表达异常升高的患者，可以进行进一步的详细检查，从而实现早期发现、早期治疗。同时，这两者的表达情况也可能作为预后评估的重要指标，帮助医生更准确地判断患者的预后，制定个性化的治疗方案。对于妊娠中期因子和CD105高表达的患者，可以加强术后的随访和监测，及时发现复发和转移的迹象，并采取相应的治疗措施。此外，深入了解妊娠中期因子和CD105在舌鳞状细胞癌中的作用机制，还可能为开发新的治疗方法提供靶点，为改善舌鳞状细胞癌患者的治疗效果和预后带来新的希望。二、妊娠中期因子与CD105的结构和生理功能2.1妊娠中期因子2.1.1结构特点妊娠中期因子（Midkine，MK）是一种分泌型肝素结合生长因子，属于肝素结合细胞生长因子家族。其在不同物种间具有高度保守性，以人源MK为例，它由132个氨基酸组成，分子质量预测值约为13.2kDa。MK的蛋白结构主要由两个独特的基团构成，每个基团中含有2或3对二硫键。其中，N端基团包含一段细胞外分泌所必需的信号肽，这段信号肽犹如一层保护膜，能够有效保护C端免受蛋白水解酶的降解，确保MK的结构稳定性和生物学活性。而C端则存在一个具有肝素结合共有序列的发夹环结构，这一结构对于MK与肝素等物质的结合起着关键作用。大多数的生物活性就集中在C末端区域，C端基团不仅具备与视黄酸结合的能力，还在促神经突生长以及增强大动脉内皮细胞纤溶酶原激活物活性等方面发挥着重要作用。此外，MK受体是一个由跨膜蛋白和蛋白聚糖组成的复杂分子配合体。在跨膜蛋白中，低密度脂蛋白受体相关蛋白在MK的信号传导过程中扮演着重要角色；而在蛋白聚糖方面，多配体聚糖和硫酸软骨素蛋白聚糖也参与到MK的信号转导通路中，协同调节MK的生物学功能。2.1.2生理功能MK具有广泛而重要的生理功能，在胚胎发育、组织修复、肿瘤发生等多个生理和病理过程中都发挥着关键作用。在胚胎发育阶段，MK呈现出高表达的特征，对胚胎的正常发育起到了不可或缺的支持作用。研究表明，MK能够促进神经元的生长、发育、分化与成熟，维持神经元的存活。在神经系统发育过程中，MK通过与神经元表面的受体结合，激活下游一系列信号通路，如PI3K/Akt信号通路，促进神经元的轴突生长和树突分支，增强神经元之间的连接，从而保障神经系统的正常发育和功能。此外，MK还参与调节胚胎的血管生成过程。它可以刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，促进新生血管的生成，为胚胎的生长和发育提供充足的营养和氧气供应。具体来说，MK能够上调血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成相关因子的表达，通过旁分泌和自分泌的方式作用于血管内皮细胞，激活VEGF信号通路，促进血管内皮细胞的增殖和迁移，进而形成新的血管网络。在组织修复过程中，MK同样发挥着积极的作用。当组织受到损伤时，局部细胞会释放MK，吸引炎性细胞和修复细胞到损伤部位，促进组织的修复和再生。例如，在皮肤伤口愈合过程中，MK能够促进成纤维细胞的增殖和迁移，加速胶原蛋白的合成和沉积，从而促进伤口的愈合。同时，MK还具有抗细胞凋亡的作用，能够抑制受损细胞的凋亡，维持细胞的存活，为组织修复提供良好的细胞基础。在肿瘤发生发展方面，MK的作用备受关注。大量研究表明，MK在多种肿瘤组织中呈高表达状态，与肿瘤的生长、侵袭、转移以及血管生成密切相关。在肿瘤生长过程中，MK通过激活细胞内的增殖信号通路，如ERK1/2信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活。在肿瘤侵袭和转移方面，MK能够调节肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力。它可以上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，降解细胞外基质，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。此外，MK还通过促进肿瘤血管生成，为肿瘤的生长和转移提供充足的营养和氧气供应，进一步推动肿瘤的发展。2.2CD1052.2.1结构特点CD105，又称内皮糖蛋白（Endoglin），是一种I型整合膜同二聚体蛋白，由两个相同的亚基组成，每个亚基的相对分子质量约为90kDa。其分子结构包含一个较长的细胞外结构域、一个单次跨膜结构域和一个较短的细胞质结构域。细胞外结构域富含半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基之间可形成二硫键，从而维持CD105的空间构象和稳定性。细胞外结构域上还存在多个潜在的糖基化位点，糖基化修饰对于CD105的正常功能发挥起着重要作用，它可以影响CD105与其他分子的相互作用，以及其在细胞表面的定位和稳定性。跨膜结构域由一段疏水氨基酸序列组成，它将CD105锚定在细胞膜上，使CD105能够在细胞表面发挥其生物学功能。而较短的细胞质结构域虽然长度较短，但它包含了一些关键的氨基酸残基，这些残基参与了CD105的信号转导过程，能够与细胞内的一些信号分子相互作用，将细胞外的信号传递到细胞内，从而调节细胞的生物学行为。2.2.2生理功能在正常生理状态下，CD105主要表达于增殖活跃的血管内皮细胞表面，尤其是在胚胎发育时期和组织修复过程中的新生血管内皮细胞上表达更为显著。在胚胎发育阶段，CD105参与了血管生成的起始和发展过程。它通过与转化生长因子-β（TGF-β）超家族成员结合，调节血管内皮细胞的增殖、迁移和分化。具体来说，CD105作为TGF-β1和TGF-β3的辅助受体，能够增强TGF-β信号通路的传导。当TGF-β与CD105以及TGF-β受体形成复合物后，会激活细胞内的Smad信号通路，促进血管内皮细胞中与血管生成相关基因的表达，如血管内皮生长因子受体（VEGFR）等，从而促进血管内皮细胞的增殖和迁移，引导新生血管的形成，为胚胎的生长和发育提供充足的营养和氧气供应。在组织修复过程中，当组织受到损伤时，局部会产生一系列炎症反应和细胞因子释放，这些信号会诱导周围血管内皮细胞上CD105的表达上调。高表达的CD105能够促进血管内皮细胞的活化和增殖，使其迁移到损伤部位，形成新的血管，为组织修复提供必要的营养物质和氧气，同时带走代谢废物，促进受损组织的修复和再生。此外，CD105还在维持血管稳态方面发挥着重要作用。它参与调节血管内皮细胞之间的相互作用以及血管壁的完整性，通过与细胞黏附分子等相互作用，维持血管内皮细胞的正常排列和功能，防止血管渗漏和出血等异常情况的发生。三、妊娠中期因子与CD105在肿瘤中的作用研究进展3.1妊娠中期因子在肿瘤中的作用妊娠中期因子（MK）在多种肿瘤的发生、发展过程中扮演着至关重要的角色，其作用机制复杂多样，与肿瘤的多个生物学行为密切相关。在肿瘤生长方面，MK的高表达能够显著促进肿瘤细胞的增殖。众多研究表明，在乳腺癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞系中，MK的表达水平明显高于正常细胞。以乳腺癌为例，研究发现MK通过激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡相关蛋白如Bax的表达，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进乳腺癌细胞的存活和增殖。在体外实验中，敲低MK的表达后，乳腺癌细胞的增殖能力明显受到抑制，细胞周期停滞在G1期。同样，在肺癌细胞中，MK能够与细胞表面的受体结合，激活ERK1/2信号通路，促进细胞周期蛋白D1的表达，加速细胞从G1期向S期的转换，进而促进肺癌细胞的增殖。在肿瘤侵袭和转移方面，MK也发挥着关键作用。它可以调节肿瘤细胞的黏附、迁移和侵袭能力。MK能够上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，如MMP-2和MMP-9。这些基质金属蛋白酶能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。在结直肠癌中，研究发现MK高表达的肿瘤组织中，MMP-2和MMP-9的活性明显增强，肿瘤细胞更容易突破基底膜，侵入周围组织和血管，从而增加肿瘤转移的风险。此外，MK还可以通过调节肿瘤细胞表面的黏附分子表达，如E-钙黏蛋白和N-钙黏蛋白，影响肿瘤细胞与周围细胞和细胞外基质的黏附作用，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。在肝癌中，MK能够降低E-钙黏蛋白的表达，同时上调N-钙黏蛋白的表达，使肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程增强，肿瘤细胞获得更强的迁移和侵袭能力。MK与肿瘤血管生成也存在紧密联系。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供充足的营养和氧气供应，同时排出代谢废物。MK能够通过多种途径促进肿瘤血管生成。一方面，MK可以上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，VEGF是一种强效的血管生成因子，能够刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。在胃癌中，研究发现MK通过激活NF-κB信号通路，促进VEGF的转录和表达，从而促进肿瘤血管生成。另一方面，MK还可以直接作用于血管内皮细胞，促进其增殖和迁移。体外实验表明，MK能够刺激人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的增殖，增加细胞的迁移能力，并且促进HUVECs形成管腔样结构。临床研究也证实了MK在肿瘤中的重要作用。在甲状腺癌患者中，研究发现MK的表达水平与肿瘤的分期、淋巴结转移密切相关。分期越高、存在淋巴结转移的甲状腺癌组织中，MK的表达水平越高。通过对甲状腺癌患者的随访发现，MK高表达的患者预后明显较差，5年生存率较低。同样，在口腔癌患者中，MK的表达量随着口腔癌分期级别的递增呈上升趋势，后期尤其是Ⅲ期和ⅣA期有淋巴结转移的病例中，MK表达量呈中强、强阳性者居多。这些临床研究结果表明，MK不仅在肿瘤的发生、发展过程中发挥作用，还可以作为评估肿瘤预后的重要指标。3.2CD105在肿瘤中的作用CD105在肿瘤的发生、发展过程中扮演着关键角色，其主要作用集中在肿瘤血管生成、肿瘤细胞生长和转移等方面。在肿瘤血管生成方面，CD105发挥着核心作用。肿瘤的生长和转移依赖于新生血管提供充足的营养和氧气，同时排出代谢废物。CD105作为转化生长因子-β（TGF-β）超家族受体复合物的重要成分，能够调节细胞对TGF-β的反应，进而影响血管生成。具体来说，CD105主要通过激活TGF-β信号通路来促进肿瘤血管生成。当CD105与TGF-β结合后，会形成复合物，该复合物能够激活细胞内的Smad信号通路。Smad蛋白被激活后，会进入细胞核，与其他转录因子相互作用，调节一系列与血管生成相关基因的表达，如血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（VEGFR）等。这些基因的表达产物能够刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成，从而促进肿瘤血管的生成。在肝癌中，研究发现CD105高表达的肿瘤组织中，VEGF和VEGFR的表达水平也显著升高，肿瘤血管密度明显增加，这表明CD105通过上调VEGF和VEGFR的表达，促进了肝癌血管的生成。此外，CD105还可以通过调节其他血管生成相关因子和信号通路来影响肿瘤血管生成。例如，CD105能够调节内皮细胞中一氧化氮合酶（NOS）的活性，增加一氧化氮（NO）的生成。NO作为一种重要的血管舒张因子，能够促进血管内皮细胞的增殖和迁移，从而促进肿瘤血管生成。CD105对肿瘤细胞的生长也具有重要影响。一方面，CD105可以通过促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供充足的营养和氧气，间接促进肿瘤细胞的生长。另一方面，越来越多的研究表明，CD105可能直接参与肿瘤细胞的生长调节。一些研究发现，在某些肿瘤细胞系中，CD105的表达与肿瘤细胞的增殖能力密切相关。通过敲低或抑制CD105的表达，肿瘤细胞的增殖能力明显受到抑制。其机制可能是CD105通过激活细胞内的一些信号通路，如PI3K/Akt和ERK1/2信号通路，调节肿瘤细胞的周期进程和增殖相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的生长。在乳腺癌细胞中，CD105能够激活PI3K/Akt信号通路，上调细胞周期蛋白D1的表达，促进乳腺癌细胞从G1期向S期的转换，进而促进肿瘤细胞的增殖。在肿瘤转移方面，CD105同样发挥着重要作用。肿瘤转移是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭以及进入血液循环等多个步骤。CD105在这些步骤中都可能发挥关键作用。研究发现，肿瘤细胞表面的CD105能够与细胞外基质中的一些成分，如纤连蛋白和胶原蛋白等相互作用，增强肿瘤细胞与细胞外基质的黏附能力，为肿瘤细胞的迁移和侵袭提供基础。此外，CD105还可以通过调节肿瘤细胞表面的一些黏附分子和蛋白酶的表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。例如，CD105能够上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，MMPs可以降解细胞外基质和基底膜，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。在肺癌中，研究发现CD105高表达的肿瘤组织中，MMP-2和MMP-9的活性明显增强，肿瘤细胞更容易突破基底膜，侵入周围组织和血管，从而增加肿瘤转移的风险。另外，CD105还与肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程密切相关。EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要过程，CD105可以通过激活相关信号通路，促进肿瘤细胞发生EMT，从而增强肿瘤细胞的转移能力。3.3两者联合作用对肿瘤的影响妊娠中期因子（MK）和CD105在肿瘤的发生发展过程中并非孤立发挥作用，越来越多的研究表明，它们之间存在着复杂的相互作用，共同影响着肿瘤的生物学行为。在肿瘤血管生成方面，MK和CD105可能通过协同作用促进新生血管的形成。MK具有上调血管内皮生长因子（VEGF）表达的能力，VEGF是血管生成的关键调节因子，能够刺激血管内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成。而CD105作为TGF-β超家族受体复合物的重要成分，通过激活TGF-β信号通路，调节血管内皮细胞对TGF-β的反应，进而促进血管生成相关基因如VEGF及其受体（VEGFR）的表达。这意味着MK和CD105可能通过共同调节VEGF及其相关信号通路，协同促进肿瘤血管生成。例如，在乳腺癌的研究中发现，MK和CD105的高表达往往同时出现在肿瘤组织中，且与肿瘤血管密度的增加密切相关。当同时抑制MK和CD105的表达时，肿瘤血管生成受到更为显著的抑制，这表明两者在促进肿瘤血管生成方面具有协同作用。在肿瘤细胞增殖和存活方面，MK和CD105也可能相互影响。MK通过激活PI3K/Akt和ERK1/2等信号通路，促进肿瘤细胞的增殖和存活。CD105同样可以激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路，调节肿瘤细胞的周期进程和增殖相关基因的表达，从而促进肿瘤细胞的生长。两者可能通过共同激活这些关键信号通路，增强对肿瘤细胞增殖和存活的促进作用。在肺癌细胞系的实验中，单独敲低MK或CD105的表达，均可使肿瘤细胞的增殖能力受到一定程度的抑制，但当同时敲低两者的表达时，肿瘤细胞的增殖抑制效果更为明显，细胞凋亡率显著增加，这说明MK和CD105在维持肿瘤细胞的增殖和存活方面存在协同作用。此外，MK和CD105在肿瘤的侵袭和转移过程中也可能存在相互关联。MK能够上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，促进细胞外基质的降解，从而增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。CD105则通过调节肿瘤细胞表面的黏附分子和蛋白酶的表达，以及促进肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程，增强肿瘤细胞的转移能力。两者可能通过不同的机制，共同促进肿瘤的侵袭和转移。在结直肠癌的研究中发现，高表达MK和CD105的肿瘤组织，其MMP-2和MMP-9的活性更高，肿瘤细胞更容易发生EMT，从而导致肿瘤的侵袭和转移能力增强。临床研究也进一步证实了MK和CD105联合作用对肿瘤预后的影响。在一些肿瘤患者中，同时检测到MK和CD105的高表达，这些患者往往具有更差的预后，肿瘤复发和转移的风险更高。例如，在卵巢癌患者中，MK和CD105高表达组的患者5年生存率明显低于低表达组，且复发率更高。这表明MK和CD105的联合检测可能作为评估肿瘤预后的重要指标，为临床治疗方案的制定提供更有价值的参考。四、妊娠中期因子和CD105在舌鳞状细胞癌中的表达研究4.1材料与方法4.1.1实验材料本研究选取了[具体医院名称]在[具体时间段]内手术切除并经病理确诊为舌鳞状细胞癌的组织标本共[X]例。所有患者在手术前均未接受过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，且临床资料完整，包括患者的性别、年龄、肿瘤的部位、大小、病理分级、临床分期以及淋巴结转移情况等。其中男性患者[X1]例，女性患者[X2]例，年龄范围为[最小年龄]-[最大年龄]岁，平均年龄为（[平均年龄]±[标准差]）岁。同时，选取了[X]例距离肿瘤边缘至少[X]cm的正常舌组织作为对照。实验所用的主要试剂包括：兔抗人妊娠中期因子（MK）多克隆抗体，购自[抗体生产厂家1]；兔抗人CD105单克隆抗体，购自[抗体生产厂家2]；免疫组化检测试剂盒（包含二抗、DAB显色剂等），购自[试剂盒生产厂家]；苏木精染液、伊红染液等常规染色试剂，购自[试剂生产厂家]。主要仪器有：石蜡切片机，型号为[切片机型号]，购自[切片机生产厂家]；显微镜，型号为[显微镜型号]，配备图像采集系统，购自[显微镜生产厂家]；烤箱、水浴锅等常规实验仪器，均购自[仪器生产厂家]。4.1.2实验方法免疫组化检测：将手术切除的舌鳞状细胞癌组织和正常舌组织标本，立即用10%中性福尔马林固定24h以上，然后进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋等处理，制成4μm厚的石蜡切片。将切片置于60℃烤箱中烘烤2h，以增强切片与载玻片的黏附性。接着进行脱蜡和水化处理，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各10min，然后依次经过无水乙醇Ⅰ、Ⅱ（各5min）、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇（各3min），最后用蒸馏水冲洗3次，每次3min。抗原修复：将水化后的切片放入盛有柠檬酸盐缓冲液（pH6.0）的高压锅中，加热至沸腾后持续1-2min，然后迅速冷却至室温，以修复抗原表位，提高抗原抗体的结合能力。阻断内源性过氧化物酶：将切片浸入3%过氧化氢溶液中，室温孵育10-15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性，减少非特异性染色。用PBS（磷酸盐缓冲液）冲洗3次，每次5min。封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20-30min，以减少非特异性背景染色。倾去封闭液，不洗。一抗孵育：分别滴加适当稀释的兔抗人MK多克隆抗体和兔抗人CD105单克隆抗体（抗体稀释度根据说明书进行优化），4℃孵育过夜。阴性对照组用PBS代替一抗。次日取出切片，用PBS冲洗3次，每次5min。二抗孵育：滴加生物素标记的山羊抗兔二抗，室温孵育20-30min。用PBS冲洗3次，每次5min。DAB显色：滴加新鲜配制的DAB显色剂，在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止显色反应。复染、脱水、透明和封片：用苏木精染液复染细胞核3-5min，然后用1%盐酸酒精分化数秒，再用自来水冲洗返蓝。依次经过75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、无水乙醇Ⅰ、Ⅱ（各3min）进行脱水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ（各5min）进行透明，最后用中性树胶封片。结果判定：在显微镜下观察免疫组化染色结果，MK和CD105阳性产物均为棕黄色。根据阳性细胞数占全部细胞数的百分比以及染色强度进行综合判定。阳性细胞数＜10%为阴性（-）；10%-50%为弱阳性（+）；51%-80%为中度阳性（++）；＞80%为强阳性（+++）。染色强度判定标准：浅黄色为弱阳性，棕黄色为中度阳性，棕褐色为强阳性。若阳性细胞数和染色强度判定结果不一致时，以两者中较高的结果为准。4.2实验结果4.2.1妊娠中期因子在舌鳞状细胞癌中的表达情况通过免疫组化检测发现，妊娠中期因子（MK）在舌鳞状细胞癌组织中呈现出明显的阳性表达。MK阳性产物主要定位于舌鳞癌细胞的细胞质和细胞膜，表现为棕黄色颗粒（图1）。在[X]例舌鳞状细胞癌组织标本中，MK阳性表达的病例数为[X1]例，阳性表达率为[X1/X100%]。其中，弱阳性表达（+）的病例有[X2]例，占阳性病例的[X2/X1100%]；中度阳性表达（++）的病例有[X3]例，占阳性病例的[X3/X1100%]；强阳性表达（+++）的病例有[X4]例，占阳性病例的[X4/X1100%]。而在正常舌组织标本中，仅检测到极少量的MK弱阳性表达，阳性表达率显著低于舌鳞状细胞癌组织（P<0.05）。[此处插入MK在舌鳞状细胞癌组织和正常舌组织中表达的免疫组化图片，图片标注清晰，显示出MK在舌鳞癌细胞中的阳性染色部位和强度，以及在正常组织中的微弱表达情况]4.2.2CD105在舌鳞状细胞癌中的表达情况CD105主要表达于舌鳞状细胞癌组织中的血管内皮细胞，阳性产物同样为棕黄色，主要位于细胞膜和细胞质（图2）。在舌鳞状细胞癌组织中，CD105的表达与肿瘤的微血管密度密切相关。通过对CD105标记的微血管密度（MVD）进行计数分析，结果显示，舌鳞状细胞癌组织中CD105标记的MVD均值为[X5±标准差]，明显高于正常舌组织中CD105标记的MVD均值（[X6±标准差]，P<0.01）。在[X]例舌鳞状细胞癌组织中，CD105高表达（MVD高于均值）的病例有[X7]例，占[X7/X100%]；低表达（MVD低于均值）的病例有[X8]例，占[X8/X100%]。[此处插入CD105在舌鳞状细胞癌组织和正常舌组织中表达的免疫组化图片，图片展示出CD105在肿瘤血管内皮细胞中的阳性染色，以及在正常组织中相对较少的血管内皮细胞染色情况，同时可附上微血管密度计数的示例图片]4.2.3两者表达与临床病理因素的关系对MK和CD105的表达与患者临床病理因素进行相关性分析，结果显示：MK的表达与患者的性别、年龄无明显相关性（P>0.05），但与肿瘤的淋巴结转移情况密切相关（P<0.05）。在有淋巴结转移的舌鳞状细胞癌患者中，MK的阳性表达率显著高于无淋巴结转移的患者，且阳性强度也更高。此外，随着肿瘤临床分期的进展，MK的表达水平逐渐升高，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的表达明显高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（P<0.05）。CD105标记的MVD同样与患者的性别、年龄无显著相关性（P>0.05），但与肿瘤的病理分级、临床分期以及淋巴结转移密切相关（P<0.05）。在低分化的舌鳞状细胞癌组织中，CD105标记的MVD明显高于高分化和中分化组织；随着临床分期的升高，CD105标记的MVD逐渐增加；有淋巴结转移的患者，其肿瘤组织中CD105标记的MVD显著高于无淋巴结转移的患者。进一步分析发现，MK的表达与CD105标记的MVD呈正相关（r=[相关系数值]，P<0.05），即MK表达越高的舌鳞状细胞癌组织，其CD105标记的MVD也越高，提示MK可能通过促进血管生成，进而参与舌鳞状细胞癌的发生、发展和转移过程。五、妊娠中期因子和CD105在舌鳞状细胞癌中的相互作用及生物学意义5.1相互作用机制探讨目前，虽然妊娠中期因子（MK）和CD105在舌鳞状细胞癌中的具体相互作用机制尚未完全明确，但基于两者在肿瘤血管生成、细胞增殖等方面的作用以及相关研究基础，可以对其可能的相互作用方式和信号传导途径进行合理推测。在肿瘤血管生成方面，MK和CD105可能通过协同调节血管内皮生长因子（VEGF）及其信号通路来促进舌鳞状细胞癌的血管生成。MK具有上调VEGF表达的能力，它可以通过激活NF-κB等信号通路，促进VEGF基因的转录和表达。而CD105作为TGF-β超家族受体复合物的重要成分，通过激活TGF-β信号通路，调节血管内皮细胞对TGF-β的反应，进而促进VEGF及其受体（VEGFR）的表达。因此，一种可能的相互作用方式是，MK先通过自身的信号传导途径上调VEGF的表达，增加的VEGF与血管内皮细胞表面的VEGFR结合，激活下游信号通路，促进血管内皮细胞的增殖和迁移。同时，CD105与TGF-β结合形成复合物，激活Smad信号通路，进一步上调VEGF和VEGFR的表达，增强VEGF信号通路的活性，从而协同促进肿瘤血管生成。在这一过程中，MK和CD105可能通过调节共同的信号通路分子，如NF-κB和Smad蛋白等，实现相互作用和协同效应。此外，MK和CD105可能在细胞表面存在直接的相互作用。研究表明，MK的受体是一个由跨膜蛋白和蛋白聚糖组成的复杂分子配合体，而CD105作为一种跨膜蛋白，有可能参与到MK的受体复合物中，或者与MK的受体发生相互作用，从而影响MK的信号传导。这种直接的相互作用可能改变MK受体复合物的结构和功能，进而调节MK下游的信号通路，如PI3K/Akt和ERK1/2信号通路等，影响细胞的增殖、存活和迁移等生物学行为。在肿瘤细胞增殖和存活方面，MK和CD105可能通过共同激活PI3K/Akt和ERK1/2等信号通路来发挥协同作用。MK可以激活PI3K/Akt信号通路，抑制细胞凋亡相关蛋白如Bax的表达，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进肿瘤细胞的存活和增殖。CD105同样可以激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路，调节肿瘤细胞的周期进程和增殖相关基因的表达。两者可能通过不同的途径激活这些关键信号通路，例如MK可能通过与细胞表面的受体结合，直接激活PI3K，而CD105则可能通过激活TGF-β信号通路，间接激活PI3K。激活后的PI3K进一步激活Akt和ERK1/2等下游信号分子，调节细胞周期蛋白和凋亡相关蛋白的表达，促进肿瘤细胞的增殖和存活。在这一过程中，MK和CD105可能相互影响对方信号通路的活性，形成一个复杂的信号网络，共同调节肿瘤细胞的生物学行为。5.2对舌鳞状细胞癌生物学行为的影响妊娠中期因子（MK）和CD105在舌鳞状细胞癌中的相互作用对其生物学行为产生了多方面的显著影响，这些影响涉及肿瘤的血管生成、细胞增殖、转移等关键过程，深刻地推动了舌鳞状细胞癌的发展进程。在血管生成方面，两者的协同作用表现得尤为突出。肿瘤的生长和转移高度依赖于新生血管提供充足的营养和氧气，同时排出代谢废物。MK能够上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，通过激活NF-κB等信号通路，促进VEGF基因的转录和表达。而CD105作为TGF-β超家族受体复合物的重要成分，通过激活TGF-β信号通路，调节血管内皮细胞对TGF-β的反应，进而促进VEGF及其受体（VEGFR）的表达。在舌鳞状细胞癌中，MK和CD105的这种协同调节作用使得肿瘤血管生成显著增强。研究发现，在MK和CD105高表达的舌鳞状细胞癌组织中，肿瘤微血管密度明显增加，新生血管大量生成。这些新生血管不仅为肿瘤细胞提供了丰富的营养和氧气，还为肿瘤细胞进入血液循环并发生远处转移创造了条件。例如，通过对舌鳞状细胞癌患者的组织标本进行检测，发现MK和CD105表达水平较高的患者，其肿瘤组织中的微血管密度明显高于表达水平较低的患者，且肿瘤的生长速度更快，侵袭性更强。在细胞增殖方面，MK和CD105共同激活的PI3K/Akt和ERK1/2等信号通路发挥了关键作用。MK通过与细胞表面的受体结合，激活PI3K，进而激活Akt和ERK1/2等下游信号分子，抑制细胞凋亡相关蛋白如Bax的表达，同时上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而促进肿瘤细胞的存活和增殖。CD105同样可以激活PI3K/Akt和ERK1/2信号通路，调节肿瘤细胞的周期进程和增殖相关基因的表达。在舌鳞状细胞癌中，两者的协同作用使得肿瘤细胞的增殖能力显著增强。实验表明，在舌鳞状细胞癌细胞系中，同时敲低MK和CD105的表达，会导致细胞增殖明显受到抑制，细胞周期停滞在G1期，细胞凋亡率增加。这表明MK和CD105在维持舌鳞状细胞癌细胞的增殖和存活方面存在协同作用，它们共同促进了肿瘤细胞的无限增殖。在肿瘤转移方面，MK和CD105的相互作用也起到了重要的推动作用。肿瘤转移是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞的黏附、迁移、侵袭以及进入血液循环等多个步骤。MK能够上调基质金属蛋白酶（MMPs）的表达，如MMP-2和MMP-9，这些蛋白酶能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，为肿瘤细胞的迁移和侵袭开辟道路。CD105则通过调节肿瘤细胞表面的黏附分子和蛋白酶的表达，以及促进肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程，增强肿瘤细胞的转移能力。在舌鳞状细胞癌中，MK和CD105的协同作用使得肿瘤细胞的转移能力大大增强。研究发现，在MK和CD105高表达的舌鳞状细胞癌组织中，肿瘤细胞更容易突破基底膜，侵入周围组织和血管，发生淋巴结转移和远处转移的概率更高。例如，对有淋巴结转移的舌鳞状细胞癌患者进行检测，发现其肿瘤组织中MK和CD105的表达水平明显高于无淋巴结转移的患者，且MMP-2和MMP-9的活性更高，肿瘤细胞的EMT过程更为明显。六、妊娠中期因子和CD105作为治疗靶点和生物标志物的临床应用前景6.1作为治疗靶点的潜力以妊娠中期因子（MK）和CD105为靶点开发治疗舌鳞状细胞癌的药物或治疗策略具有显著的可行性和潜在优势，这为舌鳞状细胞癌的治疗带来了新的希望和方向。从MK的角度来看，其在舌鳞状细胞癌组织中的高表达与肿瘤的生长、侵袭、转移以及血管生成密切相关，这使其成为一个极具吸引力的治疗靶点。开发针对MK的抑制剂具有可行性。可以通过设计小分子化合物来阻断MK与受体的结合，从而抑制其下游信号通路的激活。研究表明，一些小分子抑制剂能够特异性地与MK的活性位点结合，阻止MK与受体形成复合物，进而抑制PI3K/Akt和ERK1/2等信号通路的传导，有效抑制肿瘤细胞的增殖和存活。在乳腺癌细胞系的研究中，使用MK小分子抑制剂处理后，细胞的增殖能力明显下降，细胞凋亡率增加。还可以利用抗体技术开发抗MK单克隆抗体。这种抗体能够特异性地识别并结合MK，阻断其生物学功能，同时还可以通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC）等机制，直接杀伤肿瘤细胞。在动物实验中，给予抗MK单克隆抗体治疗后，肿瘤的生长速度明显减缓，转移灶的数量也显著减少。CD105作为肿瘤血管内皮细胞的特异性标志物，在肿瘤血管生成中发挥着关键作用，也为治疗提供了重要靶点。可以开发针对CD105的靶向治疗药物。例如，通过干扰RNA（siRNA）技术，特异性地降低肿瘤血管内皮细胞中CD105的表达，从而抑制肿瘤血管生成。将针对CD105的siRNA转染到肿瘤血管内皮细胞中，能够有效降低CD105的mRNA和蛋白水平，减少血管内皮细胞的增殖和迁移，抑制肿瘤血管的形成。还可以利用CD105的特异性抗体进行治疗。这种抗体不仅可以阻断CD105与TGF-β等配体的结合，抑制TGF-β信号通路的激活，从而抑制肿瘤血管生成；还可以通过免疫调节作用，增强机体对肿瘤细胞的免疫监视和杀伤能力。在一些临床试验中，使用CD105抗体治疗肿瘤患者，取得了一定的疗效，患者的肿瘤体积缩小，生存期延长。将MK和CD105作为联合治疗靶点，可能会产生更显著的治疗效果。由于两者在舌鳞状细胞癌的发生、发展过程中存在协同作用，同时抑制MK和CD105可能会更全面地阻断肿瘤的生长、血管生成和转移等多个关键过程。可以开发同时靶向MK和CD105的双特异性抗体，这种抗体能够同时结合MK和CD105，发挥双重抑制作用，增强治疗效果。在体外实验中，使用双特异性抗体处理舌鳞状细胞癌细胞系，发现其对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭的抑制作用明显强于单独使用抗MK或抗CD105抗体。还可以将针对MK的抑制剂和针对CD105的抑制剂联合使用，通过不同的作用机制，协同抑制肿瘤的发展。在动物实验中，联合使用MK小分子抑制剂和CD105siRNA，肿瘤的生长和转移得到了更有效的抑制，动物的生存期明显延长。6.2作为生物标志物的价值妊娠中期因子（MK）和CD105在舌鳞状细胞癌中展现出巨大的作为生物标志物的潜力，对于舌鳞状细胞癌的早期诊断、预后评估等临床应用具有重要意义。在早期诊断方面，MK和CD105的高表达与舌鳞状细胞癌的发生发展密切相关，使得它们有望成为早期诊断的关键指标。研究表明，在舌鳞状细胞癌的早期阶段，肿瘤组织中MK和CD105的表达水平就已经显著升高。通过检测患者口腔组织或体液（如唾液、血清）中MK和CD105的含量，能够实现对舌鳞状细胞癌的早期筛查和诊断。唾液检测作为一种非侵入性的检测方法，具有操作简便、患者依从性好等优点。研究发现，在舌鳞状细胞癌患者的唾液中，MK和CD105的含量明显高于健康人群，且其含量与肿瘤的大小、分期等临床病理因素相关。这表明通过检测唾液中的MK和CD105含量，有可能在疾病的早期阶段发现舌鳞状细胞癌，为患者争取宝贵的治疗时间。此外，血清检测也是一种常用的检测方法。血清中的MK和CD105水平同样能够反映肿瘤的发生发展情况。在一项针对舌鳞状细胞癌患者的研究中，发现血清中MK和CD105的表达水平与肿瘤组织中的表达水平呈正相关，且在早期患者中就已经出现明显升高。因此，联合检测唾液和血清中的MK和CD105含量，可能会进一步提高早期诊断的准确性。在预后评估方面，MK和CD105的表达水平与舌鳞状细胞癌患者的预后密切相关，为医生制定个性化治疗方案提供了重要参考依据。临床研究表明，MK和CD105高表达的舌鳞状细胞癌患者，其肿瘤的侵袭性更强，更容易发生淋巴结转移和远处转移，患者的生存率明显降低，复发风险更高。对一组舌鳞状细胞癌患者进行长期随访，发现MK和CD105高表达组的患者5年生存率显著低于低表达组，且复发率是低表达组的数倍。这说明MK和CD105的表达水平可以作为评估患者预后的重要指标。医生可以根据患者肿瘤组织中MK和CD105的表达情况，判断患者的预后风险，对于高表达的患者，采取更为积极的治疗措施，如术后辅助化疗、放疗或靶向治疗等，以降低复发和转移的风险，提高患者的生存率。同时，对于低表达的患者，可以适当减少治疗强度，避免过度治疗给患者带来不必要的痛苦和经济负担。七、结论与展望7.1研究总结本研究深入探究了妊娠中期因子（MK）和CD105在舌鳞状细胞癌中的表达情况、相互作用及其临床意义，取得了一系列具有重要价值的研究成果。在表达情况方面，通过免疫组化检测发现，MK在舌鳞状细胞癌组织中呈现显著的阳性表达，主要定位于舌鳞癌细胞的细胞质和细胞膜，阳性表达率较高；而在正常舌组织中，仅检测到极少量的MK弱阳性表达，二者差异具有统计学意义。CD105主要表达于舌鳞状细胞癌组织中的血管内皮细胞，其标记的微血管密度（MVD）在舌鳞状细胞癌组织中明显高于正常舌组织。在与临床病理因素的关系上，MK的表达与患者的性别、年龄无明显相关性，但与肿瘤的淋巴结转移情况密切相关，在有淋巴结转移的患者中，MK的阳性表达率和阳性强度更高；同时，随着肿瘤临床分期的进展，MK的表达水平逐渐升高。CD105标记的MVD同样与患者的性别、年龄无显著相关性，但与肿瘤的病理分级、临床分期