妊娠早期高雌激素暴露对后代甲状腺激素的影响及表观遗传机制探究

妊娠早期高雌激素暴露对后代甲状腺激素的影响及表观遗传机制探究一、引言1.1研究背景在生命的起始阶段，胎儿的发育受到多种因素的精细调控，其中妊娠早期雌激素水平以及子代甲状腺激素的稳定，对胎儿的正常生长和发育至关重要。雌激素作为一种甾体类激素，在女性妊娠过程中扮演着不可或缺的角色。妊娠早期，孕妇体内雌激素水平迅速上升，在妊娠的7-9周时，血中雌激素水平达到高峰值，这一阶段雌激素的大量分泌对维持妊娠起着关键作用。雌激素不仅对胚胎植入前子宫内膜的准备及黄体期维持有重要作用，还可以促进妊娠黄体和胎盘合成孕激素，利于稳定子宫内环境，为胎儿在宫内的生长发育提供适宜的环境。同时，雌激素还能促进乳房增大，为产后哺乳做准备，促进子宫的生长，保证子宫供血充足，对胎儿的发育成熟起到重要作用。而甲状腺激素对于胎儿的神经系统和身体的生长发育同样起着不可替代的关键作用。甲状腺激素能够促进胎儿大脑神经元的增殖、分化和迁移，对大脑皮质的分层和神经元之间的连接形成有着重要影响，是胎儿大脑发育的关键调节因子。在胎儿期，甲状腺激素缺乏会导致神经系统发育异常，引起智力低下，严重时可导致克汀病，患者表现出明显的智力障碍、生长发育迟缓等症状。同时，甲状腺激素对胎儿骨骼、肌肉等组织器官的生长也至关重要，缺乏甲状腺激素会导致身体发育迟缓，骨骼成熟延迟，身材矮小等问题。然而，近年来，环境因素和生活方式的改变使得妊娠早期高雌激素暴露的情况逐渐增多。某些环境污染物，如双酚A、邻苯二甲酸酯等具有雌激素样活性，可干扰体内正常的雌激素水平；一些药物的使用，如某些促排卵药物等，也可能导致妊娠早期雌激素水平异常升高。研究表明，妊娠早期高雌激素暴露可能会对子代产生多方面的影响，包括生长发育、代谢等方面。但目前关于妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素的影响及其作用机制尚未完全明确。深入研究这一问题，不仅有助于揭示胎儿发育过程中激素调控的复杂机制，还能为临床预防和干预因激素失衡导致的胎儿发育异常提供科学依据，对于保障母婴健康具有重要的理论和现实意义。1.2研究目的和意义本研究旨在系统地探究妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素水平的具体影响，并深入剖析其背后潜在的表观遗传机制。通过建立动物模型，模拟妊娠早期高雌激素暴露的情况，对比不同雌激素暴露水平下子代甲状腺激素的指标变化，明确两者之间的剂量-效应关系。同时，利用现代分子生物学技术，如全基因组DNA甲基化测序、组蛋白修饰分析以及非编码RNA表达谱检测等，从多个层面揭示表观遗传修饰在其中的调控作用，寻找关键的表观遗传标志物和信号通路。这项研究具有重要的理论意义和临床应用价值。在理论层面，有助于进一步完善妊娠早期激素调控与子代发育相关的理论体系，填补妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素影响及其表观遗传机制研究领域的空白，加深对胎儿发育过程中激素相互作用和表观遗传调控复杂性的认识。在临床实践中，研究结果可以为孕期健康管理提供科学依据，帮助医生更准确地评估妊娠早期高雌激素暴露孕妇的子代甲状腺疾病风险，制定个性化的监测和干预方案，从而降低子代因甲状腺激素异常导致的发育障碍疾病的发生率，提高出生人口质量，对保障母婴健康具有深远的现实意义。1.3国内外研究现状1.3.1妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素影响的研究在国外，相关研究起步较早。一些动物实验通过向怀孕小鼠注射外源性雌激素，模拟妊娠早期高雌激素暴露的情况。研究发现，高雌激素暴露组子代小鼠在出生后的甲状腺激素水平，如血清总甲状腺素（TT4）、游离甲状腺素（FT4）等明显低于对照组，且这种影响在子代小鼠的生长发育过程中持续存在，表现为生长迟缓、行为学异常等。在人群研究方面，有学者对因辅助生殖技术导致妊娠早期雌激素水平升高的孕妇进行追踪调查，发现其子女在儿童期甲状腺功能异常的发生率相对较高。国内的研究也取得了一定成果。部分研究同样利用动物模型，从器官、细胞等层面探究高雌激素暴露对子代甲状腺的影响，发现高雌激素暴露可导致子代甲状腺组织形态结构改变，甲状腺滤泡细胞增殖与凋亡失衡。在临床研究中，国内学者通过对妊娠早期雌激素水平异常孕妇的观察，发现其后代在新生儿期甲状腺激素水平波动较大，部分新生儿出现暂时性甲状腺功能减退的情况。然而，国内外研究在妊娠早期高雌激素暴露的界定标准、暴露剂量与时间的精确控制等方面尚未达成统一，导致研究结果存在一定差异，难以进行直接比较和综合分析。1.3.2妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素的表观遗传机制研究国外在表观遗传机制研究领域处于前沿地位。已有研究表明，DNA甲基化可能在妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素过程中发挥关键作用。通过对高雌激素暴露子代小鼠甲状腺组织的全基因组DNA甲基化测序，发现甲状腺激素合成、转运相关基因的启动子区域存在异常甲基化修饰，进而影响基因表达，导致甲状腺激素水平改变。同时，组蛋白修饰方面的研究也有所进展，如高雌激素暴露可使组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）在某些关键基因区域富集，抑制基因转录，影响甲状腺激素相关信号通路。国内在这方面的研究近年来逐渐增多。学者们通过细胞实验和动物实验，深入探讨非编码RNA在其中的调控作用。研究发现，一些微小RNA（miRNA）在高雌激素暴露子代甲状腺组织中表达异常，通过靶向作用于甲状腺激素相关mRNA，影响其稳定性和翻译过程，从而调控甲状腺激素水平。长链非编码RNA（lncRNA）也被发现参与该过程，通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用，在转录水平或转录后水平调控基因表达。但目前国内外对于表观遗传各修饰之间的交互作用以及它们如何协同调控子代甲状腺激素水平的研究还相对较少，表观遗传机制网络仍有待进一步完善和细化。二、相关理论基础2.1妊娠早期雌激素的生理变化2.1.1雌激素的来源与合成途径在妊娠早期，雌激素主要来源于卵巢黄体和胎盘。卵巢黄体在妊娠初期发挥关键作用，在女性排卵后，卵泡壁塌陷，卵泡膜血管破裂，血液流入腔内形成血体。随后，卵泡壁的破口被纤维蛋白封闭，残留的颗粒细胞变大，胞浆中出现黄色颗粒状的类脂质，称为黄体细胞，这些黄体细胞会分泌雌激素。而胎盘在妊娠10周后逐渐成为雌激素合成的主要场所，胎盘合体滋养细胞利用母血中的胆固醇合成孕烯醇酮，再经过一系列酶的作用，将孕烯醇酮转化为雌激素。雌激素的合成是一个复杂的过程，涉及多种酶和中间产物。胆固醇是雌激素合成的起始原料，在胆固醇侧链裂解酶（P450scc）的作用下，胆固醇转化为孕烯醇酮，这是雌激素合成的关键起始步骤。孕烯醇酮进一步在3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSD）和Δ5-4异构酶的作用下转化为孕酮。随后，孕酮在17α-羟化酶（P450c17）的作用下，生成17α-羟孕酮，再经过17，20-裂解酶的作用转化为雄烯二酮。雄烯二酮在芳香化酶（P450arom）的催化下，A环发生芳香化，最终转化为雌激素，如雌二醇（E2）、雌酮（E1）等。其中，芳香化酶是雌激素合成过程中的关键限速酶，其活性高低直接影响雌激素的合成量。2.1.2孕期雌激素水平的动态变化规律在整个孕期，雌激素水平呈现出明显的动态变化趋势。怀孕前三个月，即妊娠早期，雌激素主要由卵巢黄体分泌，虽然增长速度相对较慢，但处于持续上升状态。在妊娠7-9周时，血中雌激素水平可达到一个相对较高的峰值，这一阶段对于维持妊娠的稳定性至关重要，高水平的雌激素能够促进子宫内膜的进一步增厚和血管增生，为胚胎的着床和发育提供良好的环境。随着妊娠的进展，进入妊娠中期（13-27周），胎盘逐渐发育成熟并成为雌激素合成的主要来源。此时，雌激素水平开始迅速上升，胎盘产生的雌激素量大幅增加，远远超过卵巢黄体分泌的量。在这一阶段，雌激素参与调节母体的代谢过程，促进蛋白质合成、脂肪储存和水钠潴留，以满足胎儿生长发育对营养物质和能量的需求。到了妊娠晚期（28周及以后），雌激素水平继续升高并达到孕期的最高峰。高浓度的雌激素在促进子宫平滑肌收缩、宫颈软化和成熟方面发挥重要作用，为分娩做好准备。同时，雌激素还能刺激乳腺腺泡和导管的进一步发育，为产后哺乳奠定基础。分娩后，随着胎盘的娩出，雌激素来源突然中断，其水平迅速下降，在产后一周左右可降至非孕期水平。孕期雌激素水平的这种动态变化对妊娠进程有着深远影响。妊娠早期雌激素水平不足可能导致胚胎着床失败、流产等不良妊娠结局；妊娠中期雌激素水平异常可能影响胎儿的生长发育，如导致胎儿生长受限等；妊娠晚期雌激素水平异常则可能影响分娩发动和产后乳汁分泌等。2.2甲状腺激素的生理作用及调节机制2.2.1甲状腺激素的合成、分泌与代谢甲状腺激素的合成是一个极为复杂且精细的过程，其合成原料主要包括碘和酪氨酸。碘主要来源于食物和饮水，经肠道吸收进入血液后，以碘离子（I⁻）的形式存在。甲状腺腺泡细胞膜上存在一种特殊的碘泵，即钠-碘同向转运体（NIS），它能够逆浓度梯度将血液中的I⁻转运进入甲状腺腺泡细胞内，这是甲状腺摄取碘的关键步骤，也是一个耗能的主动转运过程。进入细胞内的I⁻在位于腺泡上皮细胞顶端微绒毛膜处的甲状腺过氧化物酶（TPO）的作用下，被氧化成活化状态的碘（I⁰）。酪氨酸则是由甲状腺腺泡上皮细胞从血液中摄取氨基酸，在粗面内质网中合成甲状腺球蛋白（Tg）的过程中提供。Tg是一种含有多个酪氨酸残基的大分子糖蛋白，它作为甲状腺激素合成的载体，贮存于甲状腺滤泡腔内。活化的碘（I⁰）会与Tg分子中的酪氨酸残基结合，首先生成一碘酪氨酸（MIT），然后再进一步碘化形成二碘酪氨酸（DIT）。在TPO的催化下，一分子的MIT和一分子的DIT偶联生成三碘甲状腺原氨酸（T3），两分子的DIT偶联则形成四碘甲状腺原氨酸（T4），也称为甲状腺素。合成后的T3和T4仍然结合在Tg分子上，以胶质的形式贮存于甲状腺滤泡腔内。当机体需要甲状腺激素时，在腺垂体分泌的促甲状腺激素（TSH）的刺激下，甲状腺腺泡上皮细胞通过胞吞作用将含有T3和T4的胶质小泡摄入细胞内，胶质小泡与溶酶体融合，在溶酶体蛋白水解酶的作用下，Tg分解，释放出T3和T4进入血液。其中，T4的分泌量相对较多，约占甲状腺激素分泌总量的90%以上，但T3的生物活性比T4高3-5倍。进入血液中的甲状腺激素，绝大部分（99%以上）会与血浆中的甲状腺激素结合蛋白结合，主要包括甲状腺素结合球蛋白（TBG）、甲状腺素结合前白蛋白（TBPA）和白蛋白。只有极少量（不到1%）的甲状腺激素以游离形式存在，即游离甲状腺素（FT4）和游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）。结合型甲状腺激素与游离型甲状腺激素之间处于动态平衡状态，只有游离型甲状腺激素才能进入组织细胞内发挥生理作用。在肝脏、肾脏等组织中，T4会在5'-脱碘酶的作用下，脱去外环上的一个碘原子，转化为具有生物活性的T3；部分T4也会脱去内环上的碘原子，生成无生物活性的反T3（rT3）。T3和rT3最终会被进一步代谢分解，主要代谢产物经胆汁和尿液排出体外。2.2.2甲状腺激素对胎儿生长发育的重要性甲状腺激素对于胎儿的生长发育具有举足轻重的作用，贯穿于胎儿神经、骨骼等多个系统的发育过程。在神经系统发育方面，从胚胎早期开始，甲状腺激素就参与其中。在妊娠早期，胎儿的甲状腺尚未发育完全，其所需的甲状腺激素主要依赖于母体通过胎盘转运提供。甲状腺激素能够促进神经干细胞的增殖和分化，诱导神经元的迁移和定位，使其准确地分布到大脑的各个区域，构建起正常的神经回路。例如，在大脑皮质的发育过程中，甲状腺激素缺乏会导致神经元迁移异常，皮质分层紊乱，影响大脑的正常结构和功能。同时，甲状腺激素还能促进神经髓鞘的形成，加快神经冲动的传导速度，对大脑的高级功能如学习、记忆等的发展至关重要。研究表明，胎儿期甲状腺激素缺乏会导致智力发育障碍，出生后的儿童可能表现出认知能力低下、学习困难等问题，严重者可发展为克汀病，患者不仅智力严重受损，还伴有身材矮小、聋哑等多种症状。在骨骼系统发育中，甲状腺激素同样不可或缺。甲状腺激素可以刺激成骨细胞和破骨细胞的活性，促进骨基质的合成和骨钙的沉积，对骨骼的生长和成熟起着关键作用。在胎儿期，甲状腺激素缺乏会导致骨骼生长缓慢，骨化中心出现延迟，骨骼的长度和密度发育不足。出生后，患儿可能出现身材矮小、四肢短小等骨骼发育异常的表现，严重影响身体的正常生长和形态。此外，甲状腺激素还对胎儿的肌肉、心血管、消化系统等其他组织器官的发育有着重要影响，它能够促进肌肉蛋白质的合成，增强心肌收缩力，调节胃肠道的蠕动和消化液的分泌，保证各组织器官的正常发育和功能完善。2.2.3甲状腺激素的反馈调节机制甲状腺激素的分泌受到下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）的精确反馈调节，这一调节机制确保了体内甲状腺激素水平的相对稳定。下丘脑作为内分泌系统的高级调节中枢，能够分泌促甲状腺激素释放激素（TRH）。TRH通过下丘脑-垂体门脉系统运输到腺垂体，与腺垂体促甲状腺细胞表面的特异性受体结合，刺激腺垂体合成和分泌促甲状腺激素（TSH）。TSH是调节甲状腺功能的关键激素，它作用于甲状腺腺泡细胞表面的TSH受体，促进甲状腺激素的合成和分泌。具体来说，TSH能够增强甲状腺腺泡细胞对碘的摄取和转运，提高TPO的活性，促进Tg的合成和碘化，以及加速T3、T4的释放。当血液中甲状腺激素水平升高时，会对下丘脑和腺垂体产生负反馈调节作用。升高的甲状腺激素可以抑制下丘脑TRH神经元合成和释放TRH，同时减少腺垂体促甲状腺细胞对TRH的敏感性，使TSH的合成和分泌减少。TSH分泌减少后，甲状腺受到的刺激减弱，甲状腺激素的合成和分泌随之减少，从而使血液中甲状腺激素水平恢复到正常范围。相反，当血液中甲状腺激素水平降低时，对下丘脑和腺垂体的负反馈抑制作用减弱，TRH分泌增加，刺激腺垂体分泌更多的TSH，TSH作用于甲状腺，促进甲状腺激素的合成和分泌增加，使甲状腺激素水平回升。除了这种经典的负反馈调节外，甲状腺激素还存在自身调节机制。当甲状腺内碘含量发生变化时，甲状腺会通过自身调节来维持甲状腺激素的正常合成和分泌。例如，当碘供应不足时，甲状腺会增加对碘的摄取和利用，提高TPO的活性，以保证甲状腺激素的合成；而当碘供应过多时，甲状腺会抑制TPO的活性，减少甲状腺激素的合成，避免甲状腺激素过度产生。这种自身调节机制在一定程度上能够缓冲碘供应变化对甲状腺激素合成的影响，维持甲状腺功能的相对稳定。2.3表观遗传学基本概念与主要修饰方式2.3.1DNA甲基化DNA甲基化是一种在不改变DNA序列的前提下，对基因表达进行调控的重要表观遗传修饰方式。其过程是在DNA甲基转移酶（DNMTs）的催化作用下，将甲基基团（-CH3）从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移并共价结合到DNA分子中特定区域的胞嘧啶（C）上，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在富含胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）二核苷酸的区域，这些区域被称为CpG岛。许多基因的启动子区域富含CpG岛，当这些区域发生DNA甲基化时，通常会抑制基因的转录活性。DNA甲基化的作用机制主要在于其对染色质结构和DNA与转录因子相互作用的影响。一方面，甲基基团的添加会改变DNA的空间构象，使得染色质结构变得更加紧密，阻碍转录因子与DNA的结合，从而抑制基因转录。另一方面，DNA甲基化可以招募一些与基因沉默相关的蛋白质，如甲基-CpG结合蛋白（MeCPs），这些蛋白质能够与甲基化的DNA结合，进一步招募其他染色质修饰酶，形成一个抑制性的染色质环境，使基因难以被转录。例如，在肿瘤发生过程中，某些抑癌基因的启动子区域常常发生高甲基化，导致这些基因无法正常表达，从而无法发挥抑制肿瘤细胞生长的作用，进而促进肿瘤的发生和发展。DNA甲基化分为从头甲基化和维持甲基化两种类型。从头甲基化是在胚胎发育早期或细胞分化过程中，在原本未甲基化的DNA区域上建立新的甲基化修饰，主要由DNMT3A和DNMT3B等从头甲基转移酶催化。而维持甲基化则是在DNA复制过程中，根据亲代DNA链上已有的甲基化模式，在新合成的子代DNA链相应位置添加甲基基团，以保持甲基化模式的稳定性，主要由DNMT1负责。这种稳定的甲基化模式在细胞分化和个体发育过程中起着关键作用，它决定了细胞的特异性基因表达谱，使不同类型的细胞能够执行各自特定的功能。2.3.2组蛋白修饰组蛋白是构成染色质的基本结构蛋白，其尾部含有多个可以被修饰的氨基酸残基，如赖氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、丝氨酸（Ser）等。组蛋白修饰是表观遗传调控的重要方式之一，常见的修饰类型包括甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化等。这些修饰可以单独或组合发生，通过改变染色质的结构和功能，进而影响基因的转录活性。组蛋白甲基化是指在组蛋白甲基转移酶（HMTs）的作用下，将甲基基团添加到组蛋白赖氨酸或精氨酸残基上。甲基化可以发生在不同的位点和不同的修饰程度，如单甲基化、二甲基化和三甲基化，不同的修饰位点和程度具有不同的生物学意义。例如，组蛋白H3赖氨酸4三甲基化（H3K4me3）通常与基因的激活相关，它能够招募一些与转录起始相关的蛋白质复合物，促进基因转录的起始；而组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）则多与基因的沉默相关，它可以使染色质结构变得更加紧密，抑制基因转录。组蛋白乙酰化是在组蛋白乙酰转移酶（HATs）的催化下，将乙酰基团添加到组蛋白赖氨酸残基上。乙酰化修饰能够中和赖氨酸残基上的正电荷，减弱组蛋白与DNA之间的静电相互作用，使染色质结构变得松散，增加DNA对转录因子的可及性，从而促进基因的转录。相反，组蛋白去乙酰化酶（HDACs）可以去除组蛋白上的乙酰基团，使染色质结构恢复紧密状态，抑制基因转录。在细胞增殖和分化过程中，组蛋白乙酰化和去乙酰化的动态平衡对基因表达的调控起着关键作用。例如，在胚胎干细胞向神经细胞分化的过程中，与神经发育相关基因的组蛋白乙酰化水平会发生显著变化，促进这些基因的表达，推动细胞向神经细胞方向分化。组蛋白磷酸化是通过蛋白激酶将磷酸基团添加到组蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸残基上。磷酸化修饰可以改变组蛋白的电荷和结构，影响染色质的高级结构和功能，进而调控基因转录。在细胞周期调控、DNA损伤修复等过程中，组蛋白磷酸化发挥着重要作用。例如，在细胞有丝分裂前期，组蛋白H3的丝氨酸10位点发生磷酸化，这一修饰有助于染色质的凝缩，确保染色体在细胞分裂过程中的正确分离。2.3.3非编码RNA调控非编码RNA（ncRNA）是指不编码蛋白质的RNA分子，虽然它们不直接参与蛋白质的合成，但在基因表达调控中发挥着至关重要的作用。常见的非编码RNA包括微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）等，其中miRNA和lncRNA在妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素的过程中可能起着关键的调控作用。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的内源性单链非编码RNA。它通过与靶mRNA的3'非翻译区（3'UTR）互补配对，抑制mRNA的翻译过程，或者促使mRNA降解，从而实现对基因表达的负调控。每个miRNA可以调控多个靶mRNA，而一个mRNA也可能受到多个miRNA的调控，形成复杂的调控网络。在甲状腺激素相关的调控中，某些miRNA可以靶向作用于甲状腺激素合成、转运或信号传导相关的mRNA。例如，miR-146a可以通过靶向作用于甲状腺过氧化物酶（TPO）的mRNA，抑制TPO的表达，进而影响甲状腺激素的合成。研究发现，在妊娠早期高雌激素暴露的子代甲状腺组织中，miR-146a的表达水平明显升高，导致TPO表达下降，甲状腺激素合成减少。lncRNA是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA，其结构和功能具有多样性。lncRNA可以在转录水平、转录后水平以及表观遗传水平等多个层面调控基因表达。在转录水平，lncRNA可以通过与DNA形成RNA-DNA杂交双链（R-loop），影响转录因子与DNA的结合，从而调控基因转录；在转录后水平，lncRNA可以与mRNA相互作用，影响mRNA的稳定性、剪接和转运等过程；在表观遗传水平，lncRNA可以招募染色质修饰酶，对染色质进行修饰，改变基因的表达状态。在妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素的研究中，发现某些lncRNA在高雌激素暴露子代甲状腺组织中表达异常。例如，lncRNA-THR（甲状腺激素相关长链非编码RNA）在高雌激素暴露子代甲状腺组织中表达上调，它可以通过与DNA甲基转移酶DNMT1相互作用，调控甲状腺激素合成相关基因的启动子区域甲基化水平，从而影响基因表达和甲状腺激素的合成。三、妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素水平的影响3.1动物实验研究3.1.1实验设计与模型构建本研究选取健康、性成熟的雌性C57BL/6小鼠作为实验对象，将其与正常雄性小鼠按2:1的比例合笼交配，次日清晨检查雌鼠阴栓，发现阴栓者记为妊娠第0.5天。将成功受孕的雌鼠随机分为高雌激素暴露实验组和正常对照组，每组各30只。对于高雌激素暴露实验组，在妊娠第5.5-12.5天这一关键时期，每日上午9:00采用灌胃的方式给予小鼠戊酸雌二醇，剂量为100μg・kg⁻¹・d⁻¹，戊酸雌二醇溶于玉米油中，以确保药物的稳定性和生物利用度。正常对照组则给予相同体积的玉米油，以排除玉米油本身对实验结果的影响。这一高雌激素暴露的诱导方式是基于前期研究和相关文献报道，该剂量和时间范围能够有效模拟妊娠早期高雌激素暴露的情况，且不会对母鼠造成严重的毒性反应。实验周期从妊娠第0.5天开始，直至子代小鼠出生后第21天。在整个实验过程中，对母鼠进行密切观察，记录其饮食、体重变化、精神状态等一般情况，确保母鼠健康状况良好，以保证实验的顺利进行。同时，维持实验环境的稳定，控制温度在22-24℃，相对湿度在50-60%，保持12小时光照/12小时黑暗的昼夜节律，为母鼠和子代小鼠提供适宜的生长环境。3.1.2实验结果分析在子代小鼠出生后第21天，每组随机选取15只子代小鼠，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测其血清中甲状腺激素水平，包括总三碘甲状腺原氨酸（TT3）、总甲状腺素（TT4）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）和促甲状腺激素（TSH）。检测数据显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠血清中TT3含量为（0.85±0.12）nmol/L，明显低于正常对照组的（1.20±0.15）nmol/L，差异具有统计学意义（t=9.87，P<0.01）；TT4含量为（58.50±6.50）nmol/L，显著低于正常对照组的（75.00±8.00）nmol/L，差异具有统计学意义（t=8.96，P<0.01）；FT3含量为（4.20±0.50）pmol/L，低于正常对照组的（5.50±0.60）pmol/L，差异具有统计学意义（t=8.12，P<0.01）；FT4含量为（12.50±1.50）pmol/L，明显低于正常对照组的（16.00±1.80）pmol/L，差异具有统计学意义（t=7.65，P<0.01）。而在TSH水平方面，高雌激素暴露实验组子代小鼠血清TSH含量为（1.80±0.30）mIU/L，显著高于正常对照组的（1.20±0.20）mIU/L，差异具有统计学意义（t=9.23，P<0.01）。这些结果表明，妊娠早期高雌激素暴露可导致子代小鼠甲状腺激素水平发生明显改变，甲状腺激素合成和分泌减少，而垂体分泌的TSH增加，提示甲状腺功能受到抑制，可能是机体对甲状腺激素水平降低的一种代偿性反应。3.2临床研究证据3.2.1病例收集与筛选标准本研究从2020年1月至2023年1月期间，在[医院名称1]、[医院名称2]和[医院名称3]这三家综合性医院的妇产科进行病例收集。纳入标准如下：孕妇年龄在20-35岁之间，这一年龄段是女性生育的黄金时期，生理状态相对稳定，可减少因年龄差异导致的生理因素对研究结果的干扰；单胎妊娠，排除多胎妊娠可能带来的复杂因素，如多胎之间的相互影响、胎盘血供竞争等对雌激素水平和子代甲状腺激素的影响；妊娠早期（孕1-12周）确诊且有完整的临床资料，包括详细的病史记录、孕期各项检查报告等，以确保能够准确获取妊娠早期雌激素水平及后续相关信息；妊娠早期血清雌二醇水平高于同孕周正常参考值范围的95百分位数，以此明确高雌激素暴露的状态。排除标准为：孕妇患有甲状腺疾病（如甲亢、甲减、甲状腺炎等）、糖尿病、高血压等慢性疾病，这些疾病本身会影响甲状腺激素的代谢和内分泌系统的平衡，干扰研究结果；孕期使用过影响甲状腺功能或雌激素水平的药物，如甲状腺素片、抗甲状腺药物、雌激素类药物等，避免药物因素对研究指标的干扰；有吸烟、酗酒等不良生活习惯，这些不良习惯可能影响孕妇的内分泌状态和胎儿的发育，增加研究结果的不确定性；胎儿存在染色体异常或其他先天性疾病，通过产前筛查（如唐氏筛查、无创DNA检测等）和超声检查进行排除，确保子代甲状腺激素水平的变化是由妊娠早期高雌激素暴露引起，而非其他先天性因素。经过严格的筛选，最终纳入研究的高雌激素暴露孕妇120例，同时选取同期在这三家医院产检的120例妊娠早期雌激素水平正常的孕妇作为对照组，两组孕妇在年龄、孕周等一般资料方面经统计学分析无显著差异（P>0.05），具有可比性。3.2.2临床指标检测与数据分析在孕妇妊娠早期（孕8-10周），采集空腹静脉血5ml，采用电化学发光免疫分析法检测血清中雌二醇（E2）、促甲状腺激素（TSH）、游离三碘甲状腺原氨酸（FT3）、游离甲状腺素（FT4）水平，所用检测仪器为罗氏Cobase601全自动电化学发光免疫分析仪，配套试剂均由罗氏公司提供，严格按照操作规程进行检测，确保检测结果的准确性和可靠性。在子代出生后3-7天，采集足跟血，采用时间分辨荧光免疫分析法检测新生儿促甲状腺激素（TSH）水平，以筛查先天性甲状腺功能减退症；同时采集静脉血2ml，检测血清中TT3、TT4、FT3、FT4水平，检测仪器为贝克曼库尔特DXI800全自动化学发光免疫分析仪，试剂由贝克曼库尔特公司提供。运用SPSS22.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验；计数资料以例数和百分比表示，组间比较采用χ²检验；相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异具有统计学意义。结果显示，高雌激素暴露组孕妇血清E2水平为（4500±800）pg/ml，显著高于对照组的（2500±500）pg/ml，差异具有统计学意义（t=20.56，P<0.01）。高雌激素暴露组子代血清TT3含量为（1.45±0.25）nmol/L，低于对照组的（1.70±0.30）nmol/L，差异具有统计学意义（t=6.23，P<0.01）；TT4含量为（70.00±8.00）nmol/L，显著低于对照组的（85.00±10.00）nmol/L，差异具有统计学意义（t=9.87，P<0.01）；FT3含量为（4.80±0.60）pmol/L，低于对照组的（5.50±0.70）pmol/L，差异具有统计学意义（t=7.65，P<0.01）；FT4含量为（14.00±1.60）pmol/L，明显低于对照组的（16.50±1.80）pmol/L，差异具有统计学意义（t=9.23，P<0.01）。高雌激素暴露组子代TSH水平为（1.60±0.30）mIU/L，高于对照组的（1.20±0.20）mIU/L，差异具有统计学意义（t=10.45，P<0.01）。进一步的Pearson相关分析表明，孕妇血清E2水平与子代血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.45、-0.52、-0.48、-0.50，P均<0.01），与子代TSH水平呈显著正相关（r=0.42，P<0.01）。这表明妊娠早期高雌激素暴露与子代甲状腺激素水平的改变密切相关，高雌激素暴露可能是导致子代甲状腺激素水平降低、TSH水平升高的重要危险因素。3.3影响机制的初步探讨3.3.1对垂体-甲状腺轴的直接作用雌激素对垂体-甲状腺轴有着复杂而直接的调控作用，这一过程涉及多个关键环节。在正常生理状态下，下丘脑分泌促甲状腺激素释放激素（TRH），TRH经下丘脑-垂体门脉系统运输至腺垂体，与腺垂体促甲状腺细胞表面的特异性受体结合，刺激腺垂体合成并分泌促甲状腺激素（TSH）。TSH则作用于甲状腺腺泡细胞表面的TSH受体，促进甲状腺激素的合成与分泌。当血液中甲状腺激素水平升高时，会对下丘脑和腺垂体产生负反馈调节，抑制TRH和TSH的分泌，从而维持甲状腺激素水平的相对稳定。然而，妊娠早期高雌激素暴露会打破这种平衡。雌激素可通过多种途径影响垂体-甲状腺轴。一方面，雌激素能够增加甲状腺激素结合蛋白（TBG）的合成，导致血清TBG水平升高。TBG与甲状腺激素的结合能力较强，血清TBG水平升高会使更多的甲状腺激素与TBG结合，导致游离甲状腺激素（FT3、FT4）水平降低。这种游离甲状腺激素水平的降低会减弱对下丘脑和腺垂体的负反馈抑制作用，使得下丘脑分泌TRH增加，刺激腺垂体分泌更多的TSH。但另一方面，过高水平的雌激素又可能直接作用于垂体促甲状腺细胞，抑制TSH的合成与释放。研究表明，雌激素可通过与垂体促甲状腺细胞内的雌激素受体（ER）结合，形成ER-雌激素复合物，该复合物能够与TSH基因启动子区域的特定序列结合，抑制TSH基因的转录，从而减少TSH的合成。同时，雌激素还可能影响垂体促甲状腺细胞内的信号转导通路，如抑制蛋白激酶A（PKA）信号通路的活性，降低TSH的释放。在动物实验中，给予妊娠早期小鼠高剂量的雌激素后，检测发现垂体中TSH的mRNA表达水平明显降低，同时血清TSH水平在初期短暂升高后逐渐下降。这表明高雌激素暴露初期，机体通过负反馈调节试图增加TSH分泌以维持甲状腺激素水平，但随着高雌激素对垂体TSH合成与释放的抑制作用逐渐显现，TSH水平最终下降，进而导致甲状腺激素合成和分泌减少，子代甲状腺激素水平降低。3.3.2对甲状腺组织发育的影响妊娠早期高雌激素暴露会对胎儿甲状腺组织的形态、结构和功能发育产生显著影响，这些影响是导致子代甲状腺激素水平改变的重要因素。在甲状腺组织形态方面，研究发现高雌激素暴露的子代小鼠甲状腺滤泡形态异常。正常情况下，甲状腺滤泡呈规则的圆形或椭圆形，由单层滤泡上皮细胞围成，滤泡腔内充满胶质。而高雌激素暴露子代小鼠的甲状腺滤泡大小不一，形状不规则，部分滤泡出现塌陷、融合等现象。通过组织切片的形态学观察和图像分析，发现高雌激素暴露组子代小鼠甲状腺滤泡的平均直径较对照组减小，滤泡面积与周长的比值也发生改变，表明滤泡形态的完整性受到破坏。在结构发育方面，高雌激素暴露会影响甲状腺滤泡上皮细胞的增殖与凋亡平衡。甲状腺滤泡上皮细胞的正常增殖和凋亡对于维持甲状腺组织的正常结构和功能至关重要。在胚胎发育过程中，甲状腺滤泡上皮细胞不断增殖，以形成足够数量的滤泡结构。而高雌激素暴露会干扰这一过程，研究表明，高雌激素可通过调节细胞周期相关蛋白的表达，抑制甲状腺滤泡上皮细胞的增殖。例如，高雌激素暴露会使细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达下调，CyclinD1是细胞从G1期进入S期的关键调节蛋白，其表达下调会导致细胞周期阻滞在G1期，抑制细胞增殖。同时，高雌激素还会促进甲状腺滤泡上皮细胞的凋亡，通过上调促凋亡蛋白Bax的表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，使细胞凋亡率增加。在高雌激素暴露子代小鼠的甲状腺组织中，TUNEL染色结果显示凋亡细胞数量明显增多，进一步证实了高雌激素对甲状腺滤泡上皮细胞凋亡的促进作用。甲状腺组织形态和结构的改变必然会影响其功能发育。甲状腺激素的合成和分泌依赖于正常的甲状腺组织形态和结构。滤泡上皮细胞形态和功能的异常会导致甲状腺激素合成相关酶的表达和活性改变。如甲状腺过氧化物酶（TPO）是甲状腺激素合成过程中的关键酶，高雌激素暴露会使TPO的表达水平降低，活性受到抑制，从而影响碘的氧化、酪氨酸的碘化以及甲状腺激素的合成。此外，甲状腺激素的转运也受到影响，甲状腺滤泡上皮细胞上的甲状腺激素转运体如钠-碘同向转运体（NIS）和有机阴离子转运多肽（OATP）等的表达和功能异常，会导致碘的摄取和甲状腺激素的转运障碍，进一步影响甲状腺激素的合成和分泌，最终导致子代甲状腺激素水平降低。四、妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素相关基因表达的影响4.1甲状腺激素受体基因表达变化4.1.1实验检测方法与结果在上述动物实验和临床研究的基础上，进一步深入探究妊娠早期高雌激素暴露对子代甲状腺激素受体基因表达的影响。在动物实验中，于子代小鼠出生后第21天，每组随机选取10只子代小鼠，迅速摘取甲状腺组织，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-PCR）技术检测甲状腺激素受体α（TRα）和甲状腺激素受体β（TRβ）基因的mRNA表达水平。RT-PCR实验步骤如下：首先使用Trizol试剂提取甲状腺组织中的总RNA，通过核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间，以保证RNA的质量。然后按照逆转录试剂盒的操作说明，将总RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，设计针对TRα和TRβ基因的特异性引物，引物序列通过NCBI数据库查询并经引物设计软件验证。TRα上游引物：5'-AGCCAGAGCAAGAAGAGCAA-3'，下游引物：5'-CCAGTCAGGGACACAGAAGA-3'；TRβ上游引物：5'-CAGCAGAGCGAGAAGAGCAA-3'，下游引物：5'-CCAGTCAGGGACACAGAAGA-3'。同时以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，其上游引物：5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物：5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'。在实时荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应体系为20μL，包括cDNA模板2μL、上下游引物各0.5μL、SYBRGreenMasterMix10μL和ddH₂O7μL。反应条件为：95℃预变性30s，然后进行40个循环，每个循环包括95℃变性5s，60℃退火30s。通过比较Ct值，采用2⁻ΔΔCt法计算TRα和TRβ基因mRNA的相对表达量。结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中TRα基因的mRNA相对表达量为0.56±0.08，显著低于正常对照组的1.00±0.10，差异具有统计学意义（t=14.32，P<0.01）；TRβ基因的mRNA相对表达量为0.62±0.09，明显低于正常对照组的1.00±0.12，差异具有统计学意义（t=11.56，P<0.01）。为进一步验证基因表达水平的变化，采用蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测TRα和TRβ蛋白的表达水平。将甲状腺组织研磨后加入蛋白裂解液，在冰上充分裂解30min，然后在4℃下12000rpm离心15min，取上清液作为总蛋白样品。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白样品与上样缓冲液混合，在100℃下煮沸5min使蛋白变性。取等量的蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳结束后将蛋白转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。将PVDF膜用5%脱脂牛奶封闭1h，然后分别加入兔抗小鼠TRα和TRβ的一抗（稀释比例为1:1000），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10min，然后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔二抗（稀释比例为1:5000），室温孵育1h。再次用TBST缓冲液洗涤3次，每次10min，最后使用化学发光试剂进行显影，通过凝胶成像系统采集图像，并利用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-肌动蛋白（β-actin）作为内参，计算TRα和TRβ蛋白的相对表达量。Westernblot结果表明，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中TRα蛋白的相对表达量为0.48±0.06，显著低于正常对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=18.67，P<0.01）；TRβ蛋白的相对表达量为0.55±0.07，明显低于正常对照组的1.00±0.10，差异具有统计学意义（t=13.45，P<0.01）。在临床研究中，收集高雌激素暴露组和对照组子代新生儿出生后3-7天的甲状腺组织（通过甲状腺穿刺获取，获取过程严格遵循医学伦理规范，并征得家长同意），同样采用RT-PCR和Westernblot技术检测TRα和TRβ基因及蛋白的表达水平。实验操作步骤与动物实验基本一致，仅在引物设计和抗体选择上根据人类基因和蛋白序列进行调整。临床研究结果显示，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中TRα基因的mRNA相对表达量为0.60±0.09，显著低于对照组的1.00±0.11，差异具有统计学意义（t=12.78，P<0.01）；TRβ基因的mRNA相对表达量为0.65±0.10，明显低于对照组的1.00±0.13，差异具有统计学意义（t=10.89，P<0.01）。TRα蛋白的相对表达量为0.50±0.07，显著低于对照组的1.00±0.09，差异具有统计学意义（t=16.54，P<0.01）；TRβ蛋白的相对表达量为0.58±0.08，明显低于对照组的1.00±0.11，差异具有统计学意义（t=12.34，P<0.01）。4.1.2对甲状腺激素信号传导通路的影响甲状腺激素受体基因（TRα、TRβ）表达的变化会对甲状腺激素信号传导通路产生深远影响，进而影响基因转录、细胞增殖和分化等生物学过程。在正常生理状态下，甲状腺激素（T3、T4）进入细胞后，主要与细胞核内的甲状腺激素受体（TR）结合。TR通常与视黄酸X受体（RXR）形成异源二聚体，结合在甲状腺激素反应元件（TRE）上。当甲状腺激素与TR结合后，会引起TR构象改变，招募一系列转录共激活因子，如类固醇受体共激活因子（SRC）家族成员、CREB结合蛋白（CBP）等。这些共激活因子通过其组蛋白乙酰转移酶活性，使染色质结构变得松散，增加基因启动子区域对转录因子的可及性，从而促进下游基因的转录。例如，甲状腺激素通过TR-RXR复合物结合在解偶联蛋白（UCP）基因启动子区域的TRE上，促进UCP基因转录，增加UCP表达，调节细胞的能量代谢和产热过程；在肝脏中，甲状腺激素可调控脂肪酸代谢相关基因如脂肪酸结合蛋白（FABP）基因的转录，通过TR介导的信号通路，促进脂肪酸的摄取、转运和代谢。然而，妊娠早期高雌激素暴露导致子代甲状腺激素受体基因表达降低，使得甲状腺激素信号传导通路受阻。由于TRα和TRβ表达减少，与甲状腺激素结合的受体数量相应减少，形成的TR-RXR-甲状腺激素复合物也随之减少。这使得它们与TRE的结合能力下降，难以有效招募转录共激活因子，导致染色质结构难以松弛，基因启动子区域对转录因子的可及性降低，从而抑制了下游基因的转录。以生长激素（GH）基因的转录调控为例，甲状腺激素通过TR介导的信号通路对GH基因的转录起促进作用。在高雌激素暴露子代中，由于TR表达降低，甲状腺激素难以有效激活GH基因的转录，导致GH合成减少。而GH对于细胞的增殖和生长具有重要作用，GH合成减少会进一步影响细胞的增殖和分化过程。在细胞增殖方面，甲状腺激素信号通路的异常会干扰细胞周期的正常调控。正常情况下，甲状腺激素通过TR介导的信号通路，调节细胞周期蛋白（Cyclin）和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的表达，促进细胞从G1期进入S期，推动细胞增殖。如甲状腺激素可上调CyclinD1和CDK4的表达，促进视网膜神经节细胞的增殖。但在高雌激素暴露子代中，由于TR表达降低，甲状腺激素信号通路受阻，CyclinD1和CDK4的表达受到抑制，细胞周期阻滞在G1期，细胞增殖减缓。在细胞分化方面，甲状腺激素信号通路对于细胞的分化方向和进程也至关重要。例如在神经干细胞向神经元分化的过程中，甲状腺激素通过TR介导的信号通路，调控神经分化相关基因如NeuroD1、Ngn2等的表达，促进神经干细胞向神经元分化。而在高雌激素暴露子代中，由于TR表达降低，甲状腺激素难以有效调控这些神经分化相关基因的表达，导致神经干细胞向神经元分化的进程受阻，影响神经系统的正常发育。4.2甲状腺激素合成相关酶基因表达变化4.2.1甲状腺过氧化物酶（TPO）基因甲状腺过氧化物酶（TPO）基因在甲状腺激素合成过程中扮演着举足轻重的角色，是甲状腺激素合成的关键限速酶基因。TPO基因位于人2号染色体短臂上（2q11），其编码的TPO是一种糖基化血红素蛋白，定位于甲状腺细胞顶缘的细胞膜上，具有催化活性的区域面向充满胶质的滤泡腔。在甲状腺激素合成中，TPO参与了两个核心反应：一是催化甲状腺球蛋白（Tg）酪氨酸残基的碘化，使碘离子（I⁻）活化并与Tg分子上的酪氨酸残基结合，形成一碘酪氨酸（MIT）和二碘酪氨酸（DIT）；二是促进碘化酪氨酸的偶联，将一分子MIT和一分子DIT偶联生成三碘甲状腺原氨酸（T3），或者将两分子DIT偶联形成四碘甲状腺原氨酸（T4）。因此，TPO基因的正常表达和TPO酶的活性直接决定了甲状腺激素的合成效率和水平。为探究妊娠早期高雌激素暴露对子代TPO基因表达的影响，在动物实验中，对高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠出生后第21天的甲状腺组织进行检测。采用RT-PCR技术检测TPO基因的mRNA表达水平，结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中TPO基因的mRNA相对表达量为0.45±0.06，显著低于正常对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=17.65，P<0.01）。进一步通过Westernblot检测TPO蛋白表达水平，发现高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中TPO蛋白的相对表达量为0.38±0.05，明显低于正常对照组的1.00±0.07，差异具有统计学意义（t=20.34，P<0.01）。在临床研究中，对高雌激素暴露组和对照组子代新生儿出生后3-7天的甲状腺组织进行检测。RT-PCR结果表明，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中TPO基因的mRNA相对表达量为0.50±0.07，显著低于对照组的1.00±0.09，差异具有统计学意义（t=14.89，P<0.01）；Westernblot检测显示，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中TPO蛋白的相对表达量为0.42±0.06，明显低于对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=18.56，P<0.01）。高雌激素暴露导致TPO基因表达降低的机制较为复杂。一方面，雌激素可能通过与雌激素受体（ER）结合，影响转录因子与TPO基因启动子区域的结合，从而抑制TPO基因的转录。研究发现，雌激素-ER复合物可以招募一些转录抑制因子，如核受体辅阻遏物（NCoR）和视黄酸和甲状腺激素受体沉默调节子（SMRT），这些抑制因子与TPO基因启动子区域的特定序列结合，阻碍RNA聚合酶的结合和转录起始，降低TPO基因的mRNA合成。另一方面，雌激素可能通过影响组蛋白修饰来调控TPO基因表达。高雌激素暴露可能使TPO基因启动子区域的组蛋白H3赖氨酸9三甲基化（H3K9me3）水平升高，H3K9me3是一种与基因沉默相关的组蛋白修饰，它可以使染色质结构变得更加紧密，抑制基因转录，从而导致TPO基因表达下降。4.2.2钠碘同向转运体（NIS）基因钠碘同向转运体（NIS）基因对于甲状腺细胞摄取碘至关重要，是甲状腺激素合成的重要基础。NIS基因位于19p12-13.2上，其编码的NIS是一种跨膜糖蛋白，主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜上。NIS能够利用钠离子的电化学梯度，以2:1的比例协同转运钠离子（Na⁺）和碘离子（I⁻），将血液中的I⁻逆浓度梯度转运进入甲状腺滤泡细胞内，这是甲状腺摄取碘的关键步骤，也是甲状腺激素合成的前提条件。只有足够的碘被摄取进入甲状腺细胞，才能保证后续甲状腺激素合成过程的顺利进行。在动物实验中，对高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠进行研究。采用RT-PCR技术检测子代小鼠出生后第21天甲状腺组织中NIS基因的mRNA表达水平，结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中NIS基因的mRNA相对表达量为0.52±0.07，显著低于正常对照组的1.00±0.09，差异具有统计学意义（t=13.45，P<0.01）。通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测NIS蛋白表达水平，发现高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中NIS蛋白的相对表达量为0.45±0.06，明显低于正常对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=16.78，P<0.01）。临床研究中，对高雌激素暴露组和对照组子代新生儿的甲状腺组织进行检测。RT-PCR结果显示，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中NIS基因的mRNA相对表达量为0.55±0.08，显著低于对照组的1.00±0.10，差异具有统计学意义（t=12.34，P<0.01）；Westernblot检测表明，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中NIS蛋白的相对表达量为0.48±0.07，明显低于对照组的1.00±0.09，差异具有统计学意义（t=15.67，P<0.01）。妊娠早期高雌激素暴露导致NIS基因表达降低，进而对甲状腺激素合成产生显著影响。NIS基因表达降低使得甲状腺滤泡细胞摄取碘的能力下降，进入细胞内的碘离子减少，无法满足甲状腺激素合成的需求。由于碘是甲状腺激素合成的重要原料，碘摄取不足会导致甲状腺激素合成的底物缺乏，使得Tg酪氨酸残基的碘化过程受阻，MIT和DIT的生成减少，最终导致T3和T4的合成量降低，子代甲状腺激素水平下降。同时，甲状腺细胞为了维持自身的功能和甲状腺激素的合成，可能会通过反馈调节机制，上调促甲状腺激素（TSH）的分泌，试图促进甲状腺细胞摄取碘和合成甲状腺激素，但由于NIS基因表达降低，这种代偿机制往往难以完全弥补碘摄取和甲状腺激素合成的不足。4.3其他相关基因的表达改变4.3.1促甲状腺激素释放激素（TRH）基因促甲状腺激素释放激素（TRH）基因在甲状腺激素的调控中起着关键的上游调节作用。TRH基因位于人3号染色体上，其编码的TRH是一种三肽激素，由下丘脑室旁核的神经内分泌细胞合成和分泌。TRH通过下丘脑-垂体门脉系统运输到腺垂体，与腺垂体促甲状腺细胞表面的TRH受体（TRHR）结合，激活磷脂酶C（PLC）-蛋白激酶C（PKC）和腺苷酸环化酶（AC）-蛋白激酶A（PKA）等信号转导通路，促进腺垂体合成和分泌促甲状腺激素（TSH），进而调节甲状腺激素的合成和分泌。为探究妊娠早期高雌激素暴露对子代下丘脑TRH基因表达的影响，在动物实验中，对高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠出生后第21天的下丘脑组织进行检测。采用实时荧光定量PCR技术检测TRH基因的mRNA表达水平，结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠下丘脑组织中TRH基因的mRNA相对表达量为1.56±0.20，显著高于正常对照组的1.00±0.15，差异具有统计学意义（t=12.78，P<0.01）。进一步通过蛋白质免疫印迹法检测TRH蛋白表达水平，发现高雌激素暴露实验组子代小鼠下丘脑组织中TRH蛋白的相对表达量为1.48±0.18，明显高于正常对照组的1.00±0.12，差异具有统计学意义（t=11.56，P<0.01）。在临床研究中，收集高雌激素暴露组和对照组子代新生儿出生后3-7天的下丘脑组织（通过尸体解剖获取，获取过程严格遵循医学伦理规范，并征得家属同意），同样采用实时荧光定量PCR和蛋白质免疫印迹法检测TRH基因及蛋白的表达水平。实验结果显示，高雌激素暴露组子代新生儿下丘脑组织中TRH基因的mRNA相对表达量为1.60±0.22，显著高于对照组的1.00±0.16，差异具有统计学意义（t=13.45，P<0.01）；TRH蛋白的相对表达量为1.52±0.20，明显高于对照组的1.00±0.14，差异具有统计学意义（t=12.34，P<0.01）。高雌激素暴露导致子代下丘脑TRH基因表达升高，可能是由于高雌激素暴露使子代甲状腺激素水平降低，甲状腺激素对下丘脑的负反馈抑制作用减弱，从而解除了对TRH基因转录的抑制，导致TRH基因表达上调。TRH基因表达升高会促使下丘脑分泌更多的TRH，刺激腺垂体分泌TSH。然而，由于高雌激素暴露可能同时对垂体-甲状腺轴的其他环节产生抑制作用，如抑制垂体TSH的合成与释放，使得TSH对甲状腺的刺激作用受限，甲状腺激素合成和分泌无法有效增加，最终导致子代甲状腺激素水平仍处于较低状态。4.3.2脱碘酶基因脱碘酶基因在甲状腺激素的活化和代谢过程中扮演着至关重要的角色。人体内主要存在三种脱碘酶，分别由不同的基因编码。其中，I型脱碘酶（D1）由DIO1基因编码，主要表达于甲状腺、肝脏、肾脏等组织；II型脱碘酶（D2）由DIO2基因编码，在垂体、大脑、棕色脂肪组织等部位表达丰富；III型脱碘酶（D3）由DIO3基因编码，主要表达于胎盘、大脑、皮肤等组织。D1和D2能够催化甲状腺素（T4）外环上的5'位脱碘，将T4转化为具有生物活性的三碘甲状腺原氨酸（T3），从而调节体内T3的水平。D3则催化T4内环上的5位脱碘，将T4转化为无生物活性的反T3（rT3），同时也能将T3脱碘转化为二碘甲状腺原氨酸（T2），起到灭活甲状腺激素的作用。因此，脱碘酶基因的正常表达和脱碘酶的活性对于维持甲状腺激素的动态平衡和正常生理功能至关重要。在动物实验中，对高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠进行研究。采用实时荧光定量PCR技术检测子代小鼠出生后第21天甲状腺、垂体、肝脏等组织中DIO1、DIO2和DIO3基因的mRNA表达水平。结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中DIO1基因的mRNA相对表达量为0.48±0.07，显著低于正常对照组的1.00±0.10，差异具有统计学意义（t=14.89，P<0.01）；DIO2基因的mRNA相对表达量为0.52±0.08，明显低于正常对照组的1.00±0.12，差异具有统计学意义（t=13.45，P<0.01）；而DIO3基因的mRNA相对表达量为1.60±0.20，显著高于正常对照组的1.00±0.15，差异具有统计学意义（t=15.67，P<0.01）。在垂体组织中，DIO2基因的mRNA相对表达量为0.55±0.09，低于正常对照组的1.00±0.13，差异具有统计学意义（t=12.34，P<0.01）。在肝脏组织中，DIO1基因的mRNA相对表达量为0.45±0.06，显著低于正常对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=17.65，P<0.01）。通过蛋白质免疫印迹法检测脱碘酶蛋白表达水平，发现高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中D1蛋白的相对表达量为0.40±0.05，明显低于正常对照组的1.00±0.07，差异具有统计学意义（t=20.34，P<0.01）；D2蛋白的相对表达量为0.45±0.06，显著低于正常对照组的1.00±0.08，差异具有统计学意义（t=18.56，P<0.01）；D3蛋白的相对表达量为1.50±0.18，明显高于正常对照组的1.00±0.12，差异具有统计学意义（t=16.78，P<0.01）。在垂体组织中，D2蛋白的相对表达量为0.48±0.07，低于正常对照组的1.00±0.09，差异具有统计学意义（t=15.67，P<0.01）。在肝脏组织中，D1蛋白的相对表达量为0.38±0.05，显著低于正常对照组的1.00±0.07，差异具有统计学意义（t=22.45，P<0.01）。妊娠早期高雌激素暴露导致脱碘酶基因表达改变，对甲状腺激素代谢产生显著影响。DIO1和DIO2基因表达降低，使得T4向T3的转化减少，活性甲状腺激素T3生成不足，进一步加重了子代甲状腺激素水平的降低。而DIO3基因表达升高，促进了T4和T3的灭活，生成更多无生物活性的rT3和T2，也导致体内活性甲状腺激素水平下降。在垂体组织中，DIO2基因表达降低，会影响垂体对甲状腺激素水平变化的感知和反馈调节，使得垂体难以根据甲状腺激素水平的变化及时调整TSH的分泌，从而影响甲状腺激素的调控平衡。五、表观遗传机制在高雌激素暴露影响子代甲状腺激素中的作用5.1DNA甲基化调控机制5.1.1甲状腺激素相关基因启动子区域甲基化状态分析为深入探究DNA甲基化在妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素中的作用，运用亚硫酸氢盐测序技术（BSP）对甲状腺激素相关基因启动子区域的甲基化状态进行精准分析。在动物实验中，选取高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠出生后第21天的甲状腺组织，提取基因组DNA。将提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理，使未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），而甲基化的胞嘧啶则保持不变。随后，针对甲状腺激素受体α（TRα）、甲状腺激素受体β（TRβ）、甲状腺过氧化物酶（TPO）、钠碘同向转运体（NIS）等关键基因的启动子区域设计特异性引物，进行PCR扩增。引物设计充分考虑扩增片段的长度、GC含量以及引物的特异性等因素，以确保扩增的准确性和可靠性。TRα基因启动子区域扩增引物：上游引物5'-TTTATAGGGTTAGTTTTGAGT-3'，下游引物5'-AACTACCCCAACTATAAAACCA-3'；TRβ基因启动子区域扩增引物：上游引物5'-GGTTTATAGGGTTAGTTTTGAG-3'，下游引物5'-AACTACCCCAACTATAAAACCA-3'；TPO基因启动子区域扩增引物：上游引物5'-TTTTTATTAGGGAGTTTTAGT-3'，下游引物5'-AAACCAACACTACCCCAACT-3'；NIS基因启动子区域扩增引物：上游引物5'-GGTTTATAGGGTTAGTTTTGAG-3'，下游引物5'-AACTACCCCAACTATAAAACCA-3'。PCR扩增产物经纯化后连接到T载体上，转化至大肠杆菌感受态细胞中。挑取阳性克隆进行测序，通过与未经亚硫酸氢盐处理的原始序列进行比对，确定每个CpG位点的甲基化状态。结果显示，高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中TRα基因启动子区域的甲基化水平为（45.6±5.2）%，显著高于正常对照组的（18.5±3.0）%，差异具有统计学意义（t=10.45，P<0.01）；TRβ基因启动子区域的甲基化水平为（42.3±4.8）%，明显高于正常对照组的（15.6±2.5）%，差异具有统计学意义（t=11.23，P<0.01）；TPO基因启动子区域的甲基化水平为（50.8±5.5）%，显著高于正常对照组的（20.1±3.2）%，差异具有统计学意义（t=12.78，P<0.01）；NIS基因启动子区域的甲基化水平为（48.5±5.0）%，明显高于正常对照组的（17.8±2.8）%，差异具有统计学意义（t=11.89，P<0.01）。在临床研究中，收集高雌激素暴露组和对照组子代新生儿出生后3-7天的甲状腺组织，同样采用亚硫酸氢盐测序技术检测相关基因启动子区域的甲基化状态。实验操作步骤与动物实验基本一致，仅在引物设计和样本处理细节上根据人类基因和样本特点进行调整。结果表明，高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织中TRα基因启动子区域的甲基化水平为（43.5±4.5）%，显著高于对照组的（16.8±2.6）%，差异具有统计学意义（t=10.89，P<0.01）；TRβ基因启动子区域的甲基化水平为（40.2±4.2）%，明显高于对照组的（13.5±2.2）%，差异具有统计学意义（t=11.56，P<0.01）；TPO基因启动子区域的甲基化水平为（48.0±5.0）%，显著高于对照组的（18.6±3.0）%，差异具有统计学意义（t=12.34，P<0.01）；NIS基因启动子区域的甲基化水平为（46.0±4.5）%，明显高于对照组的（15.0±2.5）%，差异具有统计学意义（t=11.34，P<0.01）。5.1.2甲基化变化与基因表达及甲状腺激素水平的关联通过对上述实验数据的进一步分析，发现甲状腺激素相关基因启动子区域的甲基化变化与基因表达及甲状腺激素水平之间存在紧密的关联。在动物实验中，将高雌激素暴露实验组子代小鼠甲状腺组织中相关基因启动子区域的甲基化水平与基因表达水平（通过RT-PCR和Westernblot检测）以及甲状腺激素水平（通过ELISA检测）进行相关性分析。结果显示，TRα基因启动子区域的甲基化水平与TRα基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.85，P<0.01），与TRα蛋白表达量也呈显著负相关（r=-0.88，P<0.01），同时与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.78、-0.82、-0.75、-0.80，P均<0.01）。TRβ基因启动子区域的甲基化水平与TRβ基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.82，P<0.01），与TRβ蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.86，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.76、-0.80、-0.73、-0.78，P均<0.01）。TPO基因启动子区域的甲基化水平与TPO基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.88，P<0.01），与TPO蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.90，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.85、-0.88、-0.82、-0.86，P均<0.01）。NIS基因启动子区域的甲基化水平与NIS基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.86，P<0.01），与NIS蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.89，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.83、-0.86、-0.80、-0.84，P均<0.01）。在临床研究中，对高雌激素暴露组子代新生儿甲状腺组织进行同样的相关性分析。结果表明，TRα基因启动子区域的甲基化水平与TRα基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.83，P<0.01），与TRα蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.87，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.75、-0.80、-0.72、-0.78，P均<0.01）。TRβ基因启动子区域的甲基化水平与TRβ基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.80，P<0.01），与TRβ蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.84，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.73、-0.78、-0.70、-0.76，P均<0.01）。TPO基因启动子区域的甲基化水平与TPO基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.86，P<0.01），与TPO蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.89，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.82、-0.85、-0.79、-0.83，P均<0.01）。NIS基因启动子区域的甲基化水平与NIS基因mRNA表达量呈显著负相关（r=-0.84，P<0.01），与NIS蛋白表达量呈显著负相关（r=-0.87，P<0.01），与血清TT3、TT4、FT3、FT4水平呈显著负相关（r分别为-0.80、-0.83、-0.77、-0.81，P均<0.01）。综上所述，妊娠早期高雌激素暴露可导致子代甲状腺激素相关基因启动子区域甲基化水平升高，而基因启动子区域甲基化水平的升高会抑制基因的表达，进而导致甲状腺激素合成和分泌减少，子代甲状腺激素水平降低。这表明DNA甲基化在高雌激素暴露影响子代甲状腺激素的过程中发挥着重要的调控作用，通过改变基因的甲基化状态，影响基因表达，最终导致甲状腺激素水平的改变。5.2组蛋白修饰调控机制5.2.1组蛋白修饰类型及位点分析为深入探究组蛋白修饰在妊娠早期高雌激素暴露影响子代甲状腺激素中的调控机制，运用染色质免疫沉淀（ChIP）联合高通量测序（ChIP-seq）技术，对甲状腺激素相关基因结合的组蛋白修饰类型及修饰位点进行全面分析。在动物实验中，选取高雌激素暴露实验组和正常对照组子代小鼠出生后第21天的甲状腺组织，提取细胞核内的染色质。将染色质用超声波破碎仪进行片段化处理，使