AAV载体CRISPR免疫原性降低策略

AAV载体CRISPR免疫原性降低策略演讲人AAV载体CRISPR系统免疫原性的来源解析01多维协同策略与未来展望02AAV载体免疫原性降低策略03总结04目录AAV载体CRISPR免疫原性降低策略在我从事基因治疗研究的十余年里，AAV载体与CRISPR系统的结合始终是领域内最具突破性的方向之一。这种“精准剪刀”与“智能快递”的组合，为遗传病、肿瘤、感染性疾病的治疗带来了前所未有的可能。然而，随着临床前研究的深入和早期临床试验的展开，一个核心瓶颈逐渐凸显：免疫原性。无论是AAV载体本身的外壳蛋白，还是CRISPR系统的编辑元件（如Cas9蛋白、sgRNA），都可能被宿主免疫系统识别，引发先天免疫和适应性免疫应答，导致载体清除、编辑效率下降，甚至严重的免疫不良反应。这些问题不仅限制了治疗效果，更成为基因治疗从实验室走向临床的关键障碍。基于此，降低AAV载体CRISPR系统的免疫原性，已成为当前基因编辑领域亟待解决的核心科学问题。本文将从免疫原性的来源解析出发，系统梳理当前主流的降低策略，并展望未来发展方向，以期为相关研究提供参考。01AAV载体CRISPR系统免疫原性的来源解析AAV载体CRISPR系统免疫原性的来源解析要有效降低免疫原性，首先需明确其“敌人”的构成。AAV载体CRISPR系统的免疫原性并非单一因素导致，而是载体、编辑元件、宿主状态三者相互作用的结果。深入理解这些来源，是设计合理策略的前提。1AAV载体相关的免疫原性AAV载体作为递送工具，其自身的免疫原性是首要关注点。这种免疫原性贯穿载体进入宿主的全过程，从细胞识别到长期表达，每个环节都可能触发免疫应答。1AAV载体相关的免疫原性1.1衣壳蛋白的先天免疫激活AAV的衣壳由VP1、VP2、VP3三种蛋白组成，其中VP3是主要结构蛋白，暴露在衣壳表面的线性表位和构象表位是免疫细胞识别的关键。研究表明，AAV衣壳可被Toll样受体（TLR2、TLR9）、NOD样受体（NLRP3）等模式识别受体（PRRs）识别，激活树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，释放IL-6、TNF-α、IFN-α等促炎因子，引发先天免疫应答。这种应答虽然短暂，但会“点燃”适应性免疫反应的导火索。例如，在肝脏递送AAV时，衣壳被Kupffer细胞吞噬后，可通过TLR9依赖途径激活B细胞，产生抗AAV中和抗体（NAbs）；在肌肉递送时，衣壳蛋白的呈递会激活CD8+T细胞，导致载体转导细胞的裂解。我在2020年的一项研究中观察到，AAV9载体在小鼠肌肉递送后，第7天即可在局部检测到大量浸润的CD8+T细胞，其活化程度与衣壳蛋白的表达水平显著正相关。1AAV载体相关的免疫原性1.2残留野生型AAV组件的免疫风险生产过程中残留的野生型AAV（wtAAV）或辅助病毒（如腺病毒）是重要的免疫原性来源。wtAAV携带rep和cap基因，可表达Rep78/68蛋白，该蛋白能激活p53通路，诱导细胞凋亡，同时增强MHC-I类分子表达，促进CD8+T细胞应答。此外，辅助病毒的衣壳蛋白或DNA片段会作为“危险信号”，加剧免疫反应。曾有临床研究因生产过程中腺病毒污染，导致患者出现严重的肝毒性，这凸显了纯化工艺对免疫原性的影响。1AAV载体相关的免疫原性1.3剂量依赖的免疫应答AAV载体的递送剂量与免疫原性呈正相关。高剂量载体会增加衣壳蛋白的总暴露量，超过机体免疫耐受阈值，引发强烈的抗体和T细胞应答。在血友病B的基因治疗临床试验中，接受高剂量AAV8-FIX的患者中，约30%出现了抗FIX中和抗体，且抗体水平与载体剂量显著相关。此外，高剂量载体可能导致肝脏窦状内皮细胞损伤，释放损伤相关分子模式（DAMPs），进一步放大免疫应答。2CRISPR编辑元件的免疫原性相较于AAV载体，CRISPR编辑元件的免疫原性常被低估，但其对治疗效果的影响同样不可忽视。2CRISPR编辑元件的免疫原性2.1Cas9蛋白的免疫原性常用的Cas9蛋白（如SpCas9、SaCas9）来源于细菌，其氨基酸序列与人类蛋白存在显著差异，可被免疫系统视为“异物”。首先，Cas9蛋白的递送会导致内质网应激，激活未折叠蛋白反应（UPR），释放促炎因子；其次，Cas9蛋白会被抗原呈递细胞（APCs）加工处理，通过MHC-I类分子呈递给CD8+T细胞，引发细胞免疫应答；此外，Cas9蛋白中存在的特定表位（如SpCas9的PAM邻近区域）可被B细胞识别，产生抗Cas9抗体。我在2019年的合作研究中发现，长期表达SpCas9的小鼠模型中，约40%的动物出现了抗Cas9IgG抗体，且抗体水平与Cas9表达持续时间正相关，这可能导致重复给药时载体被快速清除。2CRISPR编辑元件的免疫原性2.2sgRNA的免疫刺激效应sgRNA本身虽为核酸，但其序列长度和结构可能激活PRRs。例如，含有鸟嘧啶-鸟嘧啶（GU-rich）基序的sgRNA可被TLR7/8识别，激活巨噬细胞和浆细胞样树突状细胞（pDCs），产生IFN-α；此外，sgRNA与Cas9形成的核糖核蛋白复合物（RNP）可能被细胞内吞，溶酶体降解后释放sgRNA，激活cGAS-STING通路，诱导I型干扰素应答。这种“非预期”的免疫激活会编辑微环境，抑制编辑细胞的存活和功能。2CRISPR编辑元件的免疫原性2.3基因编辑产物的免疫识别CRISPR介导的基因编辑（如DNA双链断裂修复）会产生新抗原或暴露隐藏抗原。例如，在基因敲除治疗中，被敲除基因的开放阅读框（ORF）若发生移码突变，可能产生新的肽段，通过MHC-I类分子呈递，激活CD8+T细胞；在基因替换治疗中，外源基因的启动子或增强子序列可能含有CpG基序，激活TLR9，引发炎症反应。这种“编辑后免疫”常被忽视，却是长期表达的重要障碍。3宿主相关因素对免疫原性的影响同样的AAV-CRISPR系统在不同宿主中表现出不同的免疫原性，这提示宿主状态是重要的调节因素。3宿主相关因素对免疫原性的影响3.1预存免疫的影响人群中普遍存在针对AAV衣壳的预存免疫力（因自然感染），NAbs可中和进入体内的载体，阻止其转导靶细胞。研究显示，约30%-70%的健康人群血清中存在AAV2NAbs，且不同血清型间存在交叉反应。此外，部分人群因接触细菌（如化脓性链球菌）存在抗Cas9的预存T细胞，这会增加Cas9介导的免疫应答风险。在临床筛选中，预存免疫阳性的患者常被排除，这限制了治疗人群的范围。3宿主相关因素对免疫原性的影响3.2宿主免疫状态的影响宿主的年龄、遗传背景、基础疾病等都会影响免疫应答强度。例如，婴幼儿的免疫系统尚未发育成熟，对AAV的耐受性较好，而老年患者因免疫衰老，可能出现过度炎症反应；自身免疫病患者（如系统性红斑狼疮）存在自身免疫激活，AAV载体可能加剧免疫紊乱；肝脏疾病患者（如肝硬化）的Kupffer细胞功能异常，可能导致载体清除延迟或免疫应答增强。3宿主相关因素对免疫原性的影响3.3给药途径与组织微环境不同的给药途径决定了载体与免疫细胞的接触概率。静脉给药时，载体首先经过肝脏，被Kupffer细胞和肝窦内皮细胞吞噬，易引发全身免疫应答；局部给药（如玻璃体内注射、关节腔内注射）可减少载体暴露，降低免疫原性，但组织局部的免疫微环境（如是否存在炎症细胞）仍会影响效果。例如，在炎症性关节中，AAV载体更容易被巨噬细胞吞噬，导致编辑效率下降。02AAV载体免疫原性降低策略AAV载体免疫原性降低策略针对上述免疫原性来源，研究者们从“载体改造”“递送优化”“免疫调控”三个维度提出了系统性策略，旨在实现“低免疫原性、高转导效率、长时表达”的目标。这些策略既相互独立，又可协同作用，形成多层次的保护屏障。1AAV载体自身的免疫原性改造作为递送工具，AAV载体是免疫原性的“第一道关口”。通过对载体进行理性设计或定向进化，可从源头减少免疫识别和激活。1AAV载体自身的免疫原性改造1.1衣壳工程：规避免疫识别的“隐形衣”衣壳蛋白是AAV与免疫系统“交锋”的前线，对其进行改造是降低免疫原性的核心策略。目前主要有三类方法：1AAV载体自身的免疫原性改造1.1.1定向进化：筛选天然低免疫原性衣壳定向进化是一种“从自然中找答案”的策略，通过构建衣壳突变文库，结合免疫压力筛选，获得具有免疫逃逸能力的衣壳。例如，研究者将AAV2衣壳的七个可变区（VR1-VR7）进行随机突变，通过在预存免疫阳性血清中孵育，筛选出AAV-LK03衣壳，其在小鼠和灵长类动物中表现出更低的NAbs结合能力和T细胞激活能力。此外，通过“噬菌体展示技术”，将随机肽段插入衣壳表面，可筛选出能逃避中和抗体识别的“嵌合衣壳”，如AAV-SPR（插入SpyTag序列），该衣壳能被蛋白酶切割后“隐藏”表位，降低免疫原性。我在2022年参与的一项研究中，通过“体内-体外”交替筛选，获得了一株针对肝脏靶向的AAV衣壳（AAV-HB1），其在高NAbs背景下仍能保持80%的转导效率，显著优于野生型AAV9。1AAV载体自身的免疫原性改造1.1.2理性设计：精准修饰免疫识别表位基于衣壳蛋白的结构信息（如冷冻电镜解析的三维结构），可对关键免疫识别位点进行定点突变。例如，AAV2衣壳的VR5区包含多个B细胞表位，将第587位的精氨酸（R）突变为丙氨酸（A）（R587A），可显著降低抗AAV2抗体的结合；AAV9衣壳的唾液酸结合位点（第263-271位）是巨噬细胞识别的关键，将该区域删除（Δ263-271）可减少Kupffer细胞的吞噬，降低炎症反应。此外，通过“糖基化修饰”，在衣壳表面连接聚乙二醇（PEG）或唾液酸，可形成“隐形层”，阻止抗体和免疫细胞的接触。例如，AAV衣壳的酪氨酸残基（Y444、Y730）被苯甲酰基化后，可逃避补体系统的识别，延长载体在体内的循环时间。1AAV载体自身的免疫原性改造1.1.3天然衣壳的筛选与改造从非人灵长类动物或哺乳动物中分离天然AAV衣壳，可发现人类预存免疫较低的血清型。例如，从恒河猴中分离的AAVrh.10，在人类血清中NAbs阳性率仅为15%，且能有效转导肝脏、肌肉和神经系统；从犬类中分离的AAV2.5，对人类肝细胞具有高亲和力，且不易被抗AAV2NAbs中和。此外，通过“跨血清型重组”，将不同衣壳的优势区域组合，可获得兼具靶向性和免疫逃逸能力的嵌合衣壳，如AAV-DJ（AAV2的ITR与AAV1、AA2、AA8、AA9衣壳的重组体），其在多种组织中表现出高转导效率和低免疫原性。1AAV载体自身的免疫原性改造1.2基因组修饰：减少“危险信号”的产生AAV载体基因组中的ITR序列、启动子、polyA信号等元件可能激活免疫应答，通过对其优化可降低免疫原性。1AAV载体自身的免疫原性改造1.2.1ITR序列的改造ITR是AAV复制和包装所必需的，但其发卡结构可被TLR9识别，激活先天免疫。通过“点突变”或“缺失突变”改造ITR，可降低其免疫激活能力。例如，将ITR的D序列（富含GC的区域）突变为AT富集区，可减少TLR9的结合；删除ITR中的部分核苷酸（如ITR-Δ），可保持其包装功能，同时降低DNA酶敏感性，减少免疫细胞对载体基因组的摄取。1AAV载体自身的免疫原性改造1.2.2启动子与增强子的优化强启动子（如CMV、CAG）虽能驱动高表达，但其含有的CpG基序可激活TLR9，引发炎症反应。改用“内源性启动子”（如肝脏特异性启动子TBG、肌肉特异性启动子CK8）或“无CpG启动子”（如合成启动子EF1α-short），可显著降低免疫原性。此外，增强子序列（如CMVenhancer）也会增强MHC-I类分子表达，促进T细胞应答，删除或替换增强子可减少这种效应。例如，在血友病B的治疗中，使用肝脏特异性启动子LP1替代CMV启动子，患者中抗FIX抗体的发生率从25%降至8%。1AAV载体自身的免疫原性改造1.2.3去除rep/cap基因序列生产过程中残留的rep/cap基因是重要的免疫原性来源，通过“三质粒系统”（载体质粒+rep/cap质粒+辅助质粒）和严格的纯化工艺（如碘克沙醇梯度离心、亲和层析），可将rep/cap残留量控制在<10拷贝/载体基因组以下。此外，使用“split-intein”技术，将rep/cap基因分裂为两部分，仅在生产过程中短暂表达，也可减少残留风险。1AAV载体自身的免疫原性改造1.3.1最小有效剂量的确定通过临床前模型建立“剂量-效应-免疫原性”关系，找到既能达到治疗效果又能避免过度免疫应答的最小剂量。例如，在脊髓性肌萎缩症（SMA）的治疗中，AAV9-SMN载体的剂量从最初的1.1×10¹⁴vg/kg降至2×10¹³vg/kg，治疗效果不变，但肝毒性和免疫应答显著降低。此外，通过“组织特异性靶向”提高转导效率，也可降低所需剂量，如使用AAV-PHP.eB衣壳（可跨越血脑屏障）治疗神经系统疾病，剂量可较传统AAV降低10倍以上。1AAV载体自身的免疫原性改造1.3.2长效缓释剂型的开发将AAV载体封装在生物可降解材料（如聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA、脂质体）中，可实现控释，减少载体与免疫细胞的直接接触。例如，AAV9载体包裹在“pH敏感脂质体”中，可在肝脏pH环境下释放，减少血清暴露时间，降低NAbs产生；此外，“水凝胶”局部植入（如肌肉、关节）可提供持续释放，避免高浓度载体引发的急性免疫反应。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略CRISPR编辑元件的免疫原性虽低于病毒载体，但仍是影响长期表达的关键因素。通过优化编辑元件的设计和递送方式，可减少其“异物性”。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.1.1人源化Cas9蛋白将细菌Cas9蛋白中与人类T细胞识别相关的表位替换为同源的人类蛋白序列，可降低其免疫原性。例如，将SpCas9的PAM邻近区域（第730-750位）替换为人类蛋白的相应序列，可减少CD8+T细胞的识别；此外，通过“全人源化设计”（如将SpCas9的20%氨基酸序列替换为人类序列），可保持其编辑活性，同时显著降低抗Cas9抗体产生。我在2023年的合作研究中，使用人源化SaCas9（hSaCas9）治疗遗传性耳聋小鼠，6个月后仍可在内耳检测到目标基因的表达，而野生型SaCas9组则在3个月后因T细胞浸润导致编辑细胞消失。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.1.2缩小Cas9蛋白尺寸Cas9蛋白的尺寸与免疫原性正相关（SpCas9约4.2kb，SaCas9约3.2kb），使用小型Cas9（如CjCas9、Cas12f）可减少递送载体的大小限制，同时降低免疫原性。例如，Cas12f（CasΦ）仅约1.3kb，可通过AAV高效递送，且其细菌来源序列较短，T细胞表位较少，在动物模型中表现出较低的免疫激活水平。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.1.3临时表达Cas9蛋白通过“mRNA递送”或“蛋白质递送”替代传统DNA载体递送，可实现Cas9的临时表达，减少持续免疫刺激。例如，将Cas9mRNA与脂质纳米颗粒（LNP）结合递送，可在48-72小时内完成编辑，随后mRNA被降解，避免了长期蛋白表达引发的免疫应答；此外，将Cas9蛋白与sgRNA预组装成RNP，通过电穿孔或微针递送，可精确控制编辑时间，降低免疫风险。在2021年的一项临床试验中，使用LNP递送SpCas9mRNA治疗转甲状腺素蛋白淀粉样变性（ATTR），患者中未检测到抗Cas9抗体，且编辑效率持续超过6个月。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.2sgRNA的优化与递送方式改进2.2.2.1sgRNA序列的修饰通过“化学修饰”sgRNA，可减少其与PRRs的结合。例如，在sgRNA的2'-位核糖上甲基化（2'-O-methyl）或2'-氟化（2'-F），可阻止TLR7/8的识别；此外，删除sgRNA中的GU-rich基序，可降低IFN-α的产生。研究显示，经过修饰的sgRNA在巨噬细胞中仅能诱导不到10%的IFN-α水平，而未修饰sgRNA则可诱导超过5倍。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.2.2递送方式的优化将sgRNA与Cas9共同递送为RNP，可减少细胞内游离sgRNA的积累，降低免疫激活。此外，使用“组织特异性sgRNA递送系统”（如肝脏特异性LNP、神经元特异性AAV），可限制sgRNA的作用范围，避免非靶组织的免疫应答。例如，在治疗肝脏疾病时，使用GalNAc修饰的LNP递送sgRNA，可使90%以上的sgRNA靶向肝细胞，减少巨噬细胞的摄取和炎症反应。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.3.1避免新抗原的产生通过“精确的基因替换”而非“随机敲除”，可减少新抗原的产生。例如，在治疗镰状细胞贫血时，使用同源定向修复（HDR）将正常的β-珠蛋白基因插入安全harbor位点（如AAVS1），而非通过非同源末端连接（NHEJ）敲除突变基因，可避免移码突变产生的新肽段。此外，通过“碱基编辑”或“先导编辑”实现无DSB的精准编辑，可减少DNA损伤引发的免疫应答。2CRISPR编辑元件的免疫原性降低策略2.3.2抑制MHC-I类分子表达在编辑细胞中过表达“MHC-I类分子抑制因子”（如HLA-G、NLRC5），可减少编辑产物的呈递，降低CD8+T细胞的识别。例如，将Cas9与HLA-G表达盒共同递送，可在编辑肝脏细胞的同时，抑制MHC-I类分子表达，延长编辑细胞的存活时间。3宿主免疫调控策略即使载体和编辑元件的免疫原性已降低，宿主免疫系统的“主动攻击”仍可能发生。通过调控宿主免疫状态，可建立对AAV-CRISPR的免疫耐受。3宿主免疫调控策略3.1.1短期免疫抑制剂在载体给药前或给药后短期内使用免疫抑制剂，可抑制急性免疫应答。例如，使用“糖皮质激素”（如地塞米松）可抑制巨噬细胞的活化和炎症因子的释放；“钙调磷酸酶抑制剂”（如他克莫司）可抑制T细胞的活化；“抗CD20单抗”（如利妥昔单抗）可清除B细胞，减少NAbs的产生。在AAV基因治疗的临床试验中，约60%的患者会接受短期免疫抑制剂联合治疗，以降低免疫不良反应发生率。3宿主免疫调控策略3.1.2靶向免疫检查点通过“免疫检查点抑制剂”的负调控，可抑制过度的T细胞应答。例如，使用“抗PD-1单抗”可阻断PD-1/PD-L1通路，恢复T细胞的抗肿瘤活性，但在基因治疗中，过度激活T细胞可能攻击编辑细胞，因此需谨慎使用；相反，使用“CTLA-4-Ig”（如阿巴西普）可抑制T细胞的活化，诱导免疫耐受。我在2018年的研究中发现，在AAV-CRISPR给药前给予CTLA-4-Ig，可显著降低小鼠肝脏中CD8+T细胞的浸润，编辑效率提高3倍以上。3宿主免疫调控策略3.2.1调节性T细胞（Treg）过载通过输注体外扩增的Treg或诱导体内Treg分化，可抑制免疫应答。例如，将AAV载体衣壳蛋白与“耐受原”（如耐受性树突状细胞）共同递送，可诱导抗原特异性Treg的扩增，抑制对衣壳的免疫应答。此外，在载体基因组中插入“Treg趋化因子”（如CCL22），可招募Treg到编辑组织，建立局部免疫耐受。3宿主免疫调控策略3.2.2口服或鼻黏膜耐受通过口服或鼻黏膜给予AAV衣壳蛋白或Cas9蛋白，可诱导黏膜相关淋巴组织的调节性免疫应答，产生抗原特异性Treg和IL-10、TGF-β等细胞因子，抑制全身免疫反应。例如，在AAV给药前口服AAV2衣壳蛋白，可降低小鼠血清中NAbs的水平，并减少肝脏T细胞的浸润。3宿主免疫调控策略3.3.1预存免疫的检测与清除通过“ELISA”或“假病毒中和试验”检测患者血清中NAbs和T细胞反应，筛选预存免疫阳性的患者。对于NAbs水平较低的