CRISPR-T细胞治疗中免疫原性降低策略

CRISPR-T细胞治疗中免疫原性降低策略演讲人CRISPR-T细胞治疗中免疫原性的来源与挑战01CRISPR-T细胞免疫原性降低的核心策略02多策略联合与未来展望：构建“全维度”免疫原性调控体系03目录CRISPR-T细胞治疗中免疫原性降低策略作为细胞治疗领域的深耕者，我亲历了CAR-T疗法从实验室走向临床的突破性进展，也深刻理解其在血液肿瘤治疗中展现出的“活体药物”的独特魅力。然而，当我们将目光转向更具潜力的CRISPR-T细胞治疗——这一通过基因编辑技术对T细胞进行精准改造，赋予其靶向杀伤肿瘤细胞能力的前沿方向时，一个核心挑战始终萦绕在我们心头：免疫原性。无论是CRISPR编辑系统本身、外源递送载体，还是编辑后细胞表面分子的改变，都可能成为触发宿主免疫应答的“导火索”，导致编辑细胞被快速清除、治疗效果大打折扣，甚至引发严重不良反应。因此，降低CRISPR-T细胞的免疫原性，不仅是提升其安全性的关键，更是推动该技术从“概念验证”走向“临床普及”的必经之路。本文将系统梳理当前CRISPR-T细胞治疗中免疫原性的主要来源，并从多个维度详细阐述降低免疫原性的策略体系，以期为这一领域的研发者提供思路，共同推动CRISPR-T细胞治疗的迭代升级。01CRISPR-T细胞治疗中免疫原性的来源与挑战CRISPR-T细胞治疗中免疫原性的来源与挑战在探讨降低免疫原性的策略之前，我们必须首先明确其“敌人”的构成。CRISPR-T细胞的免疫原性并非单一因素所致，而是多环节、多层次的复杂结果，只有精准识别其来源，才能有的放矢地制定解决方案。1.1CRISPR编辑系统的免疫原性：Cas蛋白的“身份暴露”CRISPR系统的核心编辑蛋白——Cas9（或Cas12a等）是免疫原性的首要来源。目前临床前研究中最常用的Cas9蛋白来自化脓性链球菌（Streptococcuspyogenes,SpCas9），其作为一种外源细菌蛋白，在人体内可能被抗原呈递细胞（APCs）识别并加工呈递，激活T细胞和B细胞介导的适应性免疫应答。研究表明，部分患者体内存在针对SpCas9的预存抗体或T细胞，这可能导致首次输注CRISPR-T细胞时即发生免疫排斥；即使无预存免疫，CRISPR-T细胞治疗中免疫原性的来源与挑战编辑过程中Cas蛋白的持续表达也会诱导继发性免疫反应，加速编辑细胞的清除。此外，Cas蛋白的大小（SpCas9约160kDa）也增加了其被免疫系统识别的风险——较大的蛋白质更易被APCs吞噬并呈递。2外源递送载体的免疫原性：“送货员”的“身份标签”CRISPR系统进入T细胞需依赖递送载体，目前主流的病毒载体（如慢病毒、逆转录病毒）和非病毒载体（如脂质纳米粒LNP、电转）均可能引入免疫原性。慢病毒载体虽能实现基因组稳定整合，但其外壳蛋白（如VSV-G糖蛋白）具有强免疫原性，可激活补体系统并诱导中和抗体；电转等非病毒方法虽避免了病毒载体风险，但外源DNA/RNA的残留可能被Toll样受体（TLRs）识别，触发先天免疫应答，导致细胞因子释放综合征（CRS）或编辑细胞功能损伤。3编辑后细胞表面分子的改变：“非己”信号的误判CRISPR编辑过程中，除了目标基因的修饰（如插入CAR基因、敲除PD-1），还可能发生非预期的脱靶编辑或靶向位点的随机插入/删除（indels），导致细胞表面分子（如HLAI类分子、共刺激分子）的表达异常。HLAI类分子是T细胞识别“自己”的关键，若其表达下调，可能被NK细胞视为“缺失自我”而被清除；反之，若编辑过程中引入外源序列（如CAR的scFv区域）或因indels产生新肽段，则可能形成新抗原（neoantigen），被宿主T细胞识别为“非己”，引发免疫攻击。4宿主免疫状态：“土壤”的差异性不同患者的免疫状态存在显著差异：部分肿瘤患者因长期化疗或免疫抑制治疗，免疫功能低下，可能对CRISPR-T细胞的免疫应答较弱；而部分患者存在自身免疫背景或慢性炎症，可能对编辑后的细胞产生过度反应。此外，预处理方案（如环磷酰胺、氟达拉滨）虽能清除淋巴细胞为CRISPR-T细胞“腾空间”，但同时也可能激活残留的免疫细胞，加剧对编辑细胞的清除。这些免疫原性来源相互交织，构成了CRISPR-T细胞治疗的“免疫排斥网络”。因此，降低免疫原性绝非单一策略可解决，需要从“编辑器-载体-细胞-宿主”四个维度进行系统性优化。02CRISPR-T细胞免疫原性降低的核心策略CRISPR-T细胞免疫原性降低的核心策略针对上述免疫原性来源，研究者们已探索出一系列策略，涵盖编辑蛋白改造、递送系统优化、细胞表面分子修饰、免疫调节等多个层面。这些策略既各有侧重，又可协同作用，共同构筑“免疫隐身”的CRISPR-T细胞。2.1编辑系统的“去免疫原性”改造：从“外源入侵者”到“沉默工具人”Cas蛋白作为免疫原性的主要来源，其改造是降低免疫原性的核心方向之一。当前策略主要包括Cas蛋白来源优化、结构改造和表达调控三大类。1.1来源筛选：寻找“低免疫原性”的Cas同源物不同来源的Cas蛋白其免疫原性存在显著差异。除SpCas9外，来自金黄色葡萄球菌（SaCas9，约105kDa）的Cas9因分子量更小，被递送至细胞的效率更高，且部分研究显示其免疫原性低于SpCas9；此外，Cas12a（Cpf1）来自氨基酸球菌属，其识别PAM序列为TTTV，与SpCas9的NGG不同，可扩大编辑范围，且其切割产物为黏性末端，可能减少非预期的基因重排，初步研究提示其免疫原性低于SpCas9。近年来，研究者从微生物宏基因组中挖掘出多种小型Cas蛋白，如CasΦ（约0.35MDa，来自巨型噬菌体）和Cas12f1（约0.4MDa），这些蛋白不仅体积小，易于包装到病毒载体或通过非病毒方法递送，且因与人类蛋白的同源性极低，预存免疫风险更低。例如，2022年《NatureBiotechnology》报道，CasΦ在人类细胞中编辑效率与SpCas9相当，但小鼠模型中诱导的T细胞反应显著降低，为开发低免疫原性编辑器提供了新选择。1.2结构工程：消除“免疫识别表位”即使来源不同的Cas蛋白，其表面仍可能存在与人类MHC分子结合的T细胞表位（epitope）。通过结构预测和计算机辅助设计，可对Cas蛋白的表位进行突变或删除，同时保留其催化活性。例如，SpCas9的RuvC结构域存在多个T细胞表位，研究者通过点突变（如K848A、E849A）将其删除，构建了“表位沉默”的eSpCas9，在体外实验中显示，该突变体被APCs呈递的能力显著降低，且诱导的T细胞增殖反应减弱。此外，通过“人源化改造”——将Cas蛋白表面与人类蛋白同源性高的区域替换为人类来源的氨基酸序列，可进一步降低其被免疫系统识别的概率。例如，2021年《Science》报道的人源化Cas9（HuCas9）通过替换12个表面氨基酸，使其在人类血清中的稳定性提高，同时减少了抗Cas9抗体的产生。1.2结构工程：消除“免疫识别表位”2.1.3表达调控：实现“瞬时表达”与“最小残留”Cas蛋白的持续表达是诱发继发性免疫应答的关键。因此，通过调控其表达时间和水平，可显著降低免疫原性。目前主流策略包括：-mRNA瞬时表达：将Cas9mRNA与gRNA共转染T细胞，利用mRNA的短暂半衰期（约6-24小时）实现Cas蛋白的瞬时表达，避免其在细胞内长期积累。例如，Moderna公司开发的CRISPR-Cas9mRNA-LNP平台，在临床前研究中显示，mRNA递送的Cas9在T细胞内表达48小时后即降至检测限以下，且未观察到明显的T细胞激活。1.2结构工程：消除“免疫识别表位”-“自毁”系统：构建受诱导型启动子（如四环素响应启动子Tet-On、热休克启动子HSP）控制的Cas9表达系统，在完成编辑后通过小分子药物或物理刺激关闭Cas表达；或利用“蛋白降解标签”（如泛素-蛋白酶体系统标签）将Cas蛋白标记为降解底物，缩短其半衰期。例如，研究者将Cas9与E3泛素连接酶的底物结构域融合，构建了可被降解的Cas9，其在完成编辑后6小时内即被彻底降解，显著降低了免疫原性。2.2递送系统的“低免疫原性”优化：从“强刺激信号”到“沉默载体”递送载体作为连接CRISPR系统与T细胞的“桥梁”，其免疫原性直接影响编辑细胞的命运。当前优化方向聚焦于“去病毒化”“非病毒化”和“靶向化”三大路径。2.1病毒载体的“减毒”改造慢病毒载体（LV）和腺相关病毒载体（AAV）虽能实现高效转导，但其免疫原性不容忽视。针对LV，可通过改造外壳蛋白：用低免疫原性的VSV-G替代亲嗜性病毒糖蛋白，或插入靶向T细胞特异性受体的肽段（如CD8、CD19的抗体片段），实现靶向转导的同时，减少非特异性免疫激活；此外，通过“无启动子”设计——删除载体中的强启动子（如CMV），仅保留编辑元件（Cas9、gRNA、CAR基因），可减少载体在宿主细胞中的表达，降低被APCs识别的风险。针对AAV，其衣壳蛋白易被预存抗体中和，研究者通过“定向进化”技术筛选出低免疫原性的衣壳突变体（如AAV-LK03），其在人类血清中的抗体结合能力显著降低，且在肝脏模型中未观察到明显的T细胞浸润。2.2非病毒载体的“精准递送”非病毒载体（如LNP、电转、聚合物纳米粒）因无病毒成分，免疫原性显著低于病毒载体，但递送效率和组织靶向性仍是挑战。LNP是目前非病毒递送系统的“明星”，其通过可电离脂质、磷脂、胆固醇和PEG的优化，可实现对T细胞的高效转染。例如，通过调整PEG分子量和脂质组成，可减少LNP被单核巨噬细胞吞噬，延长其血液循环时间；此外，利用“细胞穿透肽”（CPP，如TAT、penetratin）修饰LNP表面，可增强其对T细胞的膜穿透能力，降低所需剂量，从而减少残留核酸引发的TLR激活。电转技术虽操作简便，但可能造成细胞膜损伤和炎症因子释放，研究者通过优化电转参数（如电压、脉冲时间）和电转缓冲液成分（如添加海藻糖等保护剂），可将细胞损伤率降低至5%以下，且编辑后T细胞的活化标志物（如CD25、CD69）表达水平显著下调。2.3“无痕递送”策略的探索“无痕递送”是指编辑元件（如Cas9蛋白-gRNA核糖核蛋白复合物，RNP）在完成编辑后不被细胞残留，从根本上避免免疫原性。RNP递送是目前最接近“无痕”的策略：将Cas9蛋白与gRNA预形成复合物，通过电转或微注射导入T细胞，因RNP进入细胞后迅速发挥编辑作用，且Cas蛋白会被细胞内蛋白酶降解，24-48小时内即可检测不到残留。临床前研究显示，RNP递送的CRISPR-T细胞在体内的持久性优于mRNA或病毒载体递送，且未观察到明显的抗Cas9抗体产生。此外，“质粒游离”递送（如使用线性DNA模板或环状DNA载体，但确保其不整合到基因组）也是减少残留的有效方法，通过优化载体设计和递送条件，可使质粒DNA在编辑后72小时内被彻底降解。2.3细胞表面分子的“免疫编辑”：从“非己标记”到“免疫兼容”CRISPR-T细胞在编辑后，其表面分子的改变是触发免疫应答的直接原因。通过精准编辑表面分子，可使其“隐身”于宿主免疫系统，同时保留其抗肿瘤功能。3.1HLAI类分子的“部分敲除”与“选择性保留”HLAI类分子呈递内源性抗原，是CD8+T细胞识别“自己”的关键。完全敲除HLAI类分子虽可避免CD8+T细胞的攻击，但会激活NK细胞的“缺失自我”杀伤（因NK细胞通过抑制性受体识别HLAI类分子）。因此，“部分敲除”与“选择性保留”成为更优策略：-敲除特定HLA等位基因：通过分析患者的HLA分型，仅敲除与肿瘤抗原呈递相关的HLA等位基因，保留其余等位基因以维持NK细胞抑制。例如，在黑色素瘤CRISPR-T细胞治疗中，敲除HLA-A02:01（该等位基因呈递的肿瘤抗原易被T细胞识别），同时保留HLA-B和HLA-C，可同时避免CD8+T细胞和NK细胞的攻击。3.1HLAI类分子的“部分敲除”与“选择性保留”-表达HLAI类分子的“非经典亚型”：非经典HLA分子（如HLA-E、HLA-G）可与NK细胞的抑制性受体（如NKG2A、LILRB1）结合，抑制NK细胞活性。通过CRISPR编辑将HLA-E或HLA-G基因导入T细胞，可增强其“免疫逃逸”能力。例如，2023年《Cell》报道，表达HLA-E的CRISPR-T细胞在体内存活时间延长3倍以上，且抗肿瘤效果显著提升。3.2共刺激分子的“精准调控”共刺激分子（如CD28、4-1BB）是T细胞活化所必需的，但过度表达可能激活T细胞耗竭或引发过度免疫反应。通过CRISPR编辑可实现共刺激分子的“精准调控”：例如，在CAR结构中采用“可诱导共刺激分子”（如iCASP9，在无小分子存在时维持共刺激，存在时关闭共刺激），避免持续共刺激导致的T细胞耗竭；或敲除抑制性共刺激分子（如PD-1、CTLA-4），同时保留活化性共刺激分子（如CD28），平衡T细胞活化和免疫逃逸。3.3新抗原的“预测与清除”CRISPR编辑过程中的脱靶效应或靶向位点的indels可能产生新抗原，成为免疫攻击的靶点。因此，通过“预测-清除”双策略可降低新抗原风险：-预测：在编辑前通过全基因组测序（WGS）和生物信息学预测潜在脱靶位点，设计高特异性gRNA；编辑后通过RNA测序和质谱分析，识别T细胞表面呈递的新肽段，评估其免疫原性。-清除：针对预测到的高免疫原性新抗原，通过CRISPR编辑敲除其编码基因，或通过TCR编辑敲除T细胞内源性TCR，减少新抗原的产生。例如，敲除TCR可避免编辑后的T细胞识别宿主组织中的自身抗原，引发移植物抗宿主病（GVHD），同时降低因TCR与新抗原结合引发的T细胞活化。3.3新抗原的“预测与清除”2.4免疫调节剂的“协同作战”：从“被动隐身”到“主动调控”除了上述“被动隐身”策略，通过免疫调节剂的“主动调控”，可抑制或重塑宿主对CRISPR-T细胞的免疫应答，为编辑细胞创造“免疫特权”微环境。4.1预处理方案的“优化”传统预处理方案（如环磷酰胺+氟达拉滨）虽能清除淋巴细胞，但也会激活残留的APCs，加剧对编辑细胞的清除。研究者通过优化预处理方案：例如，使用低剂量氟达拉滨联合抗CD52抗体（如阿仑单抗），可选择性清除B细胞和T细胞，减少APCs的活化；或添加CTLA-4抑制剂（如伊匹木单抗），抑制T细胞的活化，降低免疫排斥风险。4.2免疫抑制剂的“短期应用”在CRISPR-T细胞输注前后，短期使用免疫抑制剂可有效抑制初始免疫应答。例如，钙调磷酸酶抑制剂（如环孢素A、他克莫司）可抑制T细胞活化，抗IL-6受体抗体（如托珠单抗）可阻断IL-6介导的炎症反应，降低CRS风险。但需注意用药时机和剂量，避免过度抑制编辑细胞的抗肿瘤功能。例如，在输注前3天开始使用环孢素A，持续2周，可显著降低抗Cas9抗体的产生，而不影响CRISPR-T细胞的体内扩增。4.3调节性免疫细胞的“过继输注”调节性T细胞（Tregs）和间充质干细胞（MSCs）具有免疫抑制功能，可通过过继输注创造免疫抑制微环境。例如，输注自体Tregs可抑制宿主效应T细胞对CRISPR-T细胞的攻击；MSCs则可通过分泌IL-10、TGF-β等细胞因子，抑制APCs的活化和炎症因子的释放。临床前研究显示，联合输注CRISPR-T细胞和MSCs的小鼠，其体内编辑细胞的存活时间延长2倍以上，且肿瘤负荷显著降低。4.4“免疫检查点”的“双重调节”免疫检查点分子（如PD-1、CTLA-4）既是免疫抑制的靶点，也可能影响CRISPR-T细胞的免疫原性。例如，敲除PD-1可增强编辑细胞的抗肿瘤功能，但可能增加其被免疫系统识别的风险；而使用抗PD-1抗体虽可激活编辑细胞，但也可能激活宿主T细胞，加速其清除。因此，“双重调节”策略——在编辑细胞中敲除PD-1的同时，短期使用抗PD-1抗体，可平衡“抗肿瘤”与“免疫逃逸”的关系。例如，2022年《NatureMedicine》报道，双重调节PD-1的CRISPR-T细胞在晚期肝癌患者中显示出持久的抗肿瘤活性，且未观察到明显的免疫排斥反应。03多策略联合与未来展望：构建“全维度”免疫原性调控体系多策略联合与未来展望：构建“全维度”免疫原性调控体系单一看，上述策略均可部分降低CRISPR-T细胞的免疫原性，但临床前和临床研究表明，单一策略往往难以完全解决免疫原性问题。例如，仅通过Cas蛋白改造，仍可能因递送载体或细胞表面分子的改变引发免疫应答；仅通过递送系统优化，若Cas蛋白持续表达仍会导致继发性免疫反应。因此，“多策略联合”成为当前CRISPR-T细胞免疫原性降低的主流方向。1“编辑器-载体-细胞”三位一体的联合优化理想的CRISPR-T细胞应实现“低免疫原性编辑器+无痕递送+免疫兼容细胞”的协同：例如，使用CasΦ（低免疫原性编辑器）通过LNP（无痕递送）递送至T细胞，同时敲除HLA-A02:01（避免CD8+T细胞识别）和表达HLA-E（抑制NK细胞），最终构建“免疫隐身”的CRISPR-T细胞。临床前研究显示，此类联合策略的CRISPR-T细胞在小鼠模型中的存活时间延长至4周以上，而单一策略仅能延长1-2周。2个体化与精准化的免疫原性评估不同患者的免疫状态和肿瘤背景差异显著，因此，免疫原性降低策略需“个体化定制”。例如，对于预存抗Cas9抗体的患者，优先选择CasΦ或人源化Cas9；对于HLA分型复杂的患者，需通过测序确定需敲除的HLA等位基因；对于自身免疫病患者，需谨慎使用免疫抑制剂，避免加重自身免疫反应。此外，开发“免疫原性预测模型”——通过整合患者的免疫细胞谱、抗体水平、HLA分型等数据，预测其对CRISPR-T细胞的免疫应答强度，从而指导策略选择，是未来的重要方向。3长期安全性与有效性的平衡免疫原性降低的最终目标是实现